Объяснение роли TGF-β1: активация, SMAD-сигнализация, роль в заболеваниях и определение методом ELISA.

TGF-β1 — широко изучаемый цитокин, фигурирующий во многих научных контекстах. Некоторые исследования сосредоточены на образовании рубцов и регенерации тканей, в то время как другие изучают уклонение опухолей от иммунного ответа, фиброз почек, ремоделирование сердца или связанные с ними процессы. Таким образом, один и тот же аналит имеет различное значение в зависимости от биологического вопроса.

Почему TGF-β1 так интересен, но при этом так сложен для изучения? В одних клеточных контекстах он может подавлять пролиферацию, а в других — способствовать регенерации тканей, эпителиально-мезенхимальному переходу, инвазии или уклонению от иммунного ответа. Длительная или нарушенная передача сигналов TGF-β1 также может приводить к фиброзу. Поэтому информативный эксперимент должен учитывать тип клеток, стадию заболевания, активность рецепторов, передачу сигналов SMAD и молекулярную форму измеряемого TGF-β1.

Соларбио Компания поставляет антитела, наборы для ИФА, биохимические реагенты, продукты для клеточной биологии и сопутствующие исследовательские инструменты для изучения этих процессов. Исследователи, планирующие более широкий рабочий процесс, также могут ознакомиться с ее продукцией. Решения для исследований в области биологических наук перед выбором отдельных анализов.

Что такое TGF-β1?

Ключевой член суперсемейства TGF-β

Трансформирующий фактор роста бета (TGF-β) — это семейство секретируемых полипептидных факторов роста, входящих в более крупное суперсемейство TGF-β. У млекопитающих имеется 33 гена, кодирующих лиганды этого суперсемейства, включая три изоформы TGF-β (TGF-β1, TGF-β2 и TGF-β3), активины, белки Nodal, антимюллеров гормон, костные морфогенетические белки и факторы роста и дифференцировки.

Эти лиганды имеют общие структурные и сигнальные принципы, но различаются по использованию рецепторов, нижележащим путям SMAD и биологическим эффектам. TGF-β1 — наиболее изученная изоформа. Она широко экспрессируется и регулирует пролиферацию, дифференцировку, миграцию, апоптоз клеток, регенерацию тканей и иммунные реакции.

TGF-β1 также тесно связан с фиброзом. Он вырабатывается многими типами клеток, включая фибробласты, иммунные клетки и эпителиальные клетки. Нормальное заживление ран требует ослабления сигнализации TGF-β; постоянная активация может привести к чрезмерному отложению внеклеточного матрикса и фиброзу.

Высококонсервативный белок у разных видов

Ген TGFB1 человека расположен на хромосоме 19q13.2 и кодирует препропротеин, который перерабатывается в LAP и зрелый С-концевой пептид TGF-β1. TGF-β1 высококонсервативен у млекопитающих, и мышиные модели широко используются для исследования его биологических функций.

Высокая степень консервации последовательности не исключает видоспецифических различий. Экспрессия рецепторов, иммунный фон, состояние тканей и модель заболевания — все это может влиять на результаты эксперимента. Поэтому результаты, полученные на мышиной модели фиброза, могут быть полезны, но не обязательно напрямую применимы к фиброзным заболеваниям человека.

Это различие также важно при выборе средств обнаружения. Необходимо подобрать как вид животного, так и матрицу образца в соответствии с проверенными областями применения анализа. Не следует предполагать, что набор, разработанный для одного вида, подходит и для другого; межвидовая реактивность зависит от конкретного продукта и должна быть подтверждена данными валидации.

TGF-β1 первоначально вырабатывается в неактивной форме.

Клетки, как правило, не секретируют TGF-β1 в качестве немедленно активной сигнальной молекулы. Он синтезируется в виде препропротеина и направляется в секреторный путь с помощью N-концевого сигнального пептида.

В аппарате Гольджи предшественник расщепляется фурином с образованием N-концевого латентно-ассоциированного пептида (LAP) и зрелого C-концевого пептида TGF-β1. Димер LAP остается нековалентно связанным с зрелым димером TGF-β1, поддерживая комплекс в латентном состоянии.

Латентный комплекс может секретироваться или удерживаться на поверхности клетки или во внеклеточном матриксе посредством связывающих партнеров, таких как LTBP или GARP. Это добавляет еще один уровень регуляции: TGF-β1 может присутствовать вне клетки, не будучи доступным для активации своих рецепторов.

Как активируется TGF-β1 и Как это сигнализирует??

Освобождение от латентного комплекса

Для начала передачи сигнала от рецептора необходимо активировать латентный TGF-β1. Некоторые интегрины связываются с RGD-мотивом в LAP и оказывают механическое воздействие или взаимодействуют с другими белками, чтобы обнажить или высвободить зрелый димер TGF-β1.

Протеазы и другие изменения во внеклеточной среде также могут способствовать активации. Доминирующий механизм зависит от ткани и контекста заболевания. Контролируемая активация способствует заживлению ран, тогда как повторная или длительная активация может поддерживать активность фибробластов и миофибробластов при хроническом фиброзе.

Общее количество TGF-β1 не эквивалентно активному TGF-β1. Образец может содержать большое количество латентного TGF-β1, но лишь небольшое количество свободного активного лиганда. Поэтому исследователям необходимо определить, измеряет ли анализ нативный активный TGF-β1, латентный TGF-β1 или общее количество TGF-β1 после этапа активации.

Связывание рецептора запускает сигнал.

Активный TGF-β1 сначала связывается с рецептором типа II (TβRII). Затем связанный с лигандом TβRII рекрутирует рецептор типа I (TβRI/ALK5), образуя сигнальный комплекс на поверхности клетки.

TβRII — это конститутивно активная серин/треониновая киназа, которая фосфорилирует и активирует TβRI в составе лиганд-рецепторного комплекса. TβRIII, или бетагликан, — это некиназный корецептор, облегчающий представление лиганда сигнальному рецепторному комплексу, в частности, TGF-β2.

Количество рецепторов и их регуляция также имеют значение. Клеточные линии, подвергнутые воздействию одинаковой концентрации TGF-β1, могут реагировать по-разному, поскольку у них разный уровень экспрессии рецепторов. Мутации рецепторов, интернализация, экспрессия корецепторов и ингибиторные белки могут дополнительно изменять силу сигнала.

SMAD2 и SMAD3 опосредуют каноническую передачу сигналов.

классический TGF-β/СМАД сигнальный путь Этот процесс опосредуется в основном SMAD2 и SMAD3. После активации TβRI фосфорилирует эти регулируемые рецепторами SMAD.

TβRI фосфорилирует регулируемые рецептором SMAD2 и SMAD3. Фосфорилированные белки отсоединяются от рецептора и связываются с SMAD4 в цитоплазме. Затем эти комплексы накапливаются в ядре, где они регулируют транскрипцию целевых генов вместе с ДНК-связывающими партнерами и ко-регуляторами транскрипции. Полученная программа экспрессии генов зависит от клеточного контекста.

Каноническая передача сигналов TGF-β может влиять на эпителиально-мезенхимальный переход, апоптоз, регуляцию иммунитета, продукцию внеклеточного матрикса и дифференцировку клеток. Результат зависит от типа клеток, стадии развития или заболевания, продолжительности передачи сигналов и взаимодействия с другими сигнальными путями; активация SMAD не приводит к единому фиксированному ответу.

Какова роль TGF-β1 в здоровье и болезни?

Заживление ран и фиброз

TGF-β1 способствует привлечению и активации фибробластов и может стимулировать их дифференцировку в миофибробласты. Активированные миофибробласты продуцируют повышенное количество коллагена и других компонентов внеклеточного матрикса, которые поддерживают восстановление тканей.

В процессе нормального заживления эта реакция прекращается после завершения процесса восстановления. Проблемы возникают, когда сигнализация TGF-β остается постоянно активной. Коллаген продолжает накапливаться, деградация внеклеточного матрикса снижается, и ткань постепенно становится жесткой.

Такая картина наблюдается при различных фиброзных состояниях. В экспериментальных моделях перитонеального фиброза TGF-β1 может снижать экспрессию E-кадгерина, одновременно увеличивая экспрессию α-SMA и коллагена I типа, что соответствует более мезенхимальному, матрикс-продуцирующему фенотипу.

Ремоделирование сердца

TGF-β1 также изучается при фиброзе сердца и ремоделировании желудочков. Активированные фибробласты увеличивают выработку коллагена I и III типов. Со временем чрезмерное отложение матрикса может снизить податливость желудочков и ухудшить функцию сердца.

Исследователи часто изучают TGF-β1 в сочетании с сигнальными путями фактора роста тромбоцитов, c-Abl, белками внеклеточного матрикса и маркерами воспаления. Измерение только одного фактора может не отразить более широкий процесс ремоделирования.

Исследования, связанные с беременностью

TGF-β1 также изучается в исследованиях, связанных с беременностью, поскольку передача сигналов TGF-β регулирует плацентацию и инвазию трофобласта. Нарушение регуляции сигналов связывают с преэклампсией. В экспериментальных моделях человеческой плаценты сообщалось, что TGF-β1 активирует выработку активных форм кислорода, зависящую от НАДФН-оксидазы; это открытие следует интерпретировать в контексте конкретной модели, а не как универсальный механизм.

Рак и регуляция иммунитета

TGF-β1 играет сложную, зависящую от стадии развития опухоли роль в развитии рака. На ранних стадиях развития опухоли путь TGF-β может действовать как супрессор опухоли, подавляя пролиферацию и индуцируя апоптоз, тем самым замедляя рост опухоли.

На более поздних стадиях многие опухоли избегают ингибирования роста, опосредованного TGF-β. В этом контексте устойчивая или повышенная передача сигналов TGF-β может способствовать эпителиально-мезенхимальному переходу, инвазии, метастазированию и уклонению от иммунного ответа.

Такое поведение, зависящее от стадии заболевания, имеет важное значение. Описывать TGF-β1 только как супрессор или только как промотор опухоли — слишком упрощенно. Результат зависит от типа опухоли, генетической предрасположенности, функции рецептора и стадии заболевания. Исследователи могут следить за новыми исследованиями сигнальных путей с помощью Solarbio. Новости исследований и обновления приложений.

Как следует измерять уровень TGF-β1 у исследователей?

Начните с образца и вида.

Первый вопрос заключается не в том, какой набор имеет самый короткий протокол, а в том, какой тип образца будет тестироваться. Сыворотка, плазма и супернатант клеточной культуры требуют иного подхода к обработке. Другие матрицы, включая гомогенаты или лизаты тканей, следует использовать только после валидации, специфичной для данного анализа, таких факторов, как степень извлечения, линейность разведения и влияние матрицы.

Дегрануляция тромбоцитов во время свертывания крови может существенно повысить уровень измеряемого TGF-β1 в сыворотке. Выбор антикоагулянта, задержка обработки, условия центрифугирования и повторные циклы замораживания-оттаивания также могут влиять на результаты. Используйте один определенный протокол сбора и обработки для всех групп и не сравнивайте сыворотку напрямую с плазмой.

Выбор вида животного также имеет важное значение. Компания Solarbio предлагает наборы для ИФА TGF-β1 для образцов мышей, людей, крыс, свиней, кроликов, собак, кур, крупного рогатого скота и обезьян.

Разделение уровня белка и активности метаболического пути

Более высокая измеренная концентрация TGF-β1 не обязательно указывает на более сильную передачу сигналов в нисходящем направлении. Большая часть белка может оставаться в латентном состоянии, экспрессия рецепторов может быть ограничена, или передача сигналов может быть подавлена ​​в нисходящем направлении.

Более эффективный рабочий процесс сочетает количественное определение TGF-β1 с анализом активности сигнальных путей, таких как фосфорилированные SMAD2 и SMAD3, ядерная локализация комплексов SMAD, α-SMA, коллаген I типа, E-кадгерин или выбранные целевые гены.

Подходящая комбинация зависит от исследовательского вопроса. В исследовании фиброза не будет использоваться та же панель маркеров, что и в проекте по изучению противоопухолевого иммунитета, и добавление большего количества маркеров не обязательно означает улучшение. Каждый показатель должен проверять определенный этап предлагаемого механизма.

Используйте набор для ИФА, соответствующий виду животного.

Для образцов мышей... Набор для ИФА ElaBoX™ для определения TGF-β1 у мышей Предоставляет возможность количественного определения в проверенных типах образцов с учетом видовой принадлежности. Может использоваться в проектах, связанных с исследованиями на людях. Набор для ИФА ElaBoX™ Human TGF-β1При этом для образцов крыс, свиней, кроликов, собак, кур, крупного рогатого скота и обезьян доступны отдельные продукты.

Более широкий ассортимент наборов для ИФА TGF-β1 компании Solarbio включает SEKM-0035, SEKH-0316, SEKR-0012, SEKP-0011, SECRT-0401, SEKC-0049, SEKCN-0005, SEKB-0305 и SEKMY-0019.

Перед тестированием ценных образцов убедитесь, что анализ показывает наличие нативного активного TGF-β1 или активированного кислотой общего TGF-β1. Для SEKM-0035 сыворотка, плазма и супернатанты клеточных культур требуют активации кислотой с последующей нейтрализацией; полученный коэффициент разведения необходимо включить в окончательный расчет. Также проверьте валидированные типы образцов, диапазон обнаружения, стандартную кривую, степень извлечения, точность, линейность разведения и перекрестную реактивность. Короткий пилотный запуск часто экономит больше времени, чем повторное тестирование на полной планшетке позже.

Как Solarbio может поддержать рабочий процесс с использованием TGF-β1?

Выбор продукта в соответствии с исследовательским вопросом

Для проекта, посвященного TGF-β1, может потребоваться набор для ИФА, а также антитела, реагенты для культивирования клеток, соединения, участвующие в метаболических процессах, биохимические анализы и инструменты для обнаружения белков.

Выбор продукта должен соответствовать биологическому вопросу. Измеряйте лиганд, если вопрос касается секреции или общего количества. Оценивайте фосфорилирование рецепторов и SMAD, если основное внимание уделяется активации сигнального пути. Добавьте маркеры фиброза, апоптоза, окислительного стресса или иммунной системы при оценке последующих клеточных реакций.

Такой подход обеспечивает механистическую связь между этапами рабочего процесса и снижает риск получения несвязанных результатов, которые трудно интерпретировать вместе.

Техническая поддержка при планировании анализов

Тип образца, вид животного, ожидаемая концентрация и схема обработки — все это влияет на план анализа. Компания Solarbio техническое обслуживание может помочь исследователям в подборе продуктов в соответствии с запланированным рабочим процессом.

Техническая поддержка особенно полезна при переходе между типами образцов или добавлении нового маркера. Протокол, валидированный для сыворотки, может быть неприменим напрямую к плазме, супернатанту клеточной культуры или невалидированным тканевым матрицам.

Перед запросом поддержки подготовьте информацию о виде животного, типе образца, модели заболевания или лечения, ожидаемом диапазоне концентраций TGF-β1, планируемой процедуре активации и результатах последующих измерений.

Обеспечьте простоту и повторяемость рабочего процесса.

Результаты определения TGF-β1 могут изменяться из-за обработки образцов, активации и нейтрализации кислотой, разведения, времени инкубации или промывания планшетов. Небольшие различия становятся более заметными, когда значения приближаются к нижнему или верхнему пределу диапазона анализа.

Используйте одинаковый метод сбора и обработки образцов для всех групп. Запишите информацию об антикоагулянте, условиях центрифугирования, времени хранения, истории замораживания-оттаивания, а также факторах активации и разбавления. Проводите анализ стандартов и контрольных образцов на каждой планшетке. При сравнении партий или исследований старайтесь обеспечить максимально единообразный подход к обработке образцов.

Эти контрольные образцы просты, но зачастую они вносят больший вклад в повышение качества данных, чем добавление еще одного анализа в конце.

Вывод

TGF-β1 является центральным регулятором регенерации тканей, фиброза, иммунного баланса, развития и биологии рака. Он вырабатывается в латентном комплексе, становится доступным посредством регулируемой активации и передает сигналы главным образом через TβRII, TβRI/ALK5, SMAD2, SMAD3 и SMAD4.

Его роль меняется в зависимости от биологических условий. Контролируемая передача сигналов способствует заживлению и гомеостазу тканей, тогда как постоянная или нарушенная передача сигналов может приводить к фиброзу, ремоделированию, инвазии или подавлению иммунитета. Поэтому в хорошо спланированном исследовании следует измерять не только концентрацию TGF-β1.

Валидированные по видам и матрицам наборы ELISA, рецепторные и SMAD-маркеры, а также последующие функциональные анализы позволяют получить более четкое представление о сигнальном пути. Исследователи, планирующие новый проект, могут Свяжитесь с командой Solarbio с указанием типа образца, вида животного и ожидаемых результатов.

ФАКВ

В1: Что такое TGF-β1?

A1: TGF-β1 — это секретируемый полипептидный фактор роста из суперсемейства TGF-β. Он регулирует пролиферацию, дифференцировку, миграцию, апоптоз клеток, иммунные реакции, регенерацию тканей и продукцию внеклеточного матрикса.

Вопрос 2: Как активируется TGF-β1?

A2: TGF-β1 синтезируется в виде препропротеина. После расщепления фурином зрелый TGF-β1 остается нековалентно связанным с LAP в латентном комплексе. Интегрины, протеазы и другие внеклеточные сигналы могут обнажать или высвобождать зрелый активный лиганд.

В3: Каков основной сигнальный путь TGF-β1?

A3: Активный TGF-β1 связывается с TβRII, который рекрутирует и фосфорилирует TβRI/ALK5. Активированный TβRI фосфорилирует SMAD2 и SMAD3. Затем эти белки связываются со SMAD4, накапливаются в ядре и регулируют транскрипцию целевых генов с другими транскрипционными партнерами.