Метод двойной иммунодиффузии: принцип, протокол, результаты и устранение неполадок.

Двойной иммунодиффузионный анализ — это относительно простой иммунологический тест. Однако несколько незначительных ошибок при подготовке могут привести к тому, что агаровая пластина останется пустой даже после нескольких часов инкубации. Неправильная концентрация антител, неправильная форма лунок, высыхание геля во время инкубации или просто неправильное время осмотра пластины могут вызвать эти проблемы.

Этот метод можно использовать для наблюдения прямой преципитации антигена и антитела. Для обнаружения реакции не требуется ни метка, ни прибор. Растворимый антиген и соответствующее ему антитело диффундируют в виде раствора через агарозный гель навстречу друг другу. При достижении подходящего соотношения концентраций образуется видимая белая линия преципитации.

Для лабораторий, занимающихся рутинными иммунологическими и белковыми исследованиями, анализ может быть выполнен с использованием стандартных реагентов, доступных через [название компании]. Ассортимент продукции Solarbioвключая иммунную сыворотку, очищенные белки, агарозу, физиологический раствор и соответствующие лабораторные материалы.

Что такое двойной иммунодиффузионный анализ?

Метод двойной иммунодиффузии основан на перемещении растворимых антигенов и антител в полутвердом геле. Антигены помещаются в одну лунку геля, а соответствующие антитела — в другую. Затем и антигены, и антитела одновременно диффундируют из своих лунок.

Когда соотношение двух компонентов достигает подходящей величины, комплексы антиген-антитело становятся достаточно большими для осаждения. Это приводит к образованию белой линии, которую обычно можно увидеть непосредственно на планшете.

Почему образуется преципитационная линия

Видимая линия сильно зависит от баланса между антигеном и антителом. Слишком большое количество любого из компонентов может сместить реакцию за пределы диапазона концентраций, в котором осаждение легче всего наблюдать.

Именно поэтому расположение линии может меняться. Когда концентрации антигена и антитела относительно схожи, линия преципитации обычно появляется между двумя лунками. Когда их концентрации различаются, линия, как правило, образуется ближе к лунке, содержащей компонент с более низкой концентрацией.

Базовая реакция может показаться простой, но качество и концентрация антител по-прежнему имеют значение. Исследователи, желающие получить более широкое представление о структуре и связывании иммуноглобулинов, также могут ознакомиться с другими материалами. Какие биологические молекулы представляют собой антитела?.

Для чего можно использовать двойную иммунодиффузию?

Этот метод может использоваться для качественной идентификации антигена или антитела. Он также может помочь в оценке титра антител, анализе чистоты и сравнении антигенов или антител из разных источников.

По этой причине метод двойной иммунодиффузии остается полезным в учебных лабораториях и при проведении фундаментальных иммунологических исследований, где видимой реакции антиген-антитело достаточно для ответа на экспериментальный вопрос.

Этот метод отличается от количественных методов, таких как ИФА. В нем отсутствует система обнаружения с использованием ферментов и измерение абсорбции. Основной результат — формирование, положение и видимость преципитационной линии.

Материалы, необходимые для двойной иммунодиффузии

Типичный эксперимент начинается с сыворотки и соответствующей антисыворотки, или очищенного белка в паре с антителом, которое его распознает. Для гелевой системы требуется агароза вместе с физиологическим раствором или другим подходящим буфером.

Также необходимы чашки Петри, пипетки, наконечники для пипеток, пробойник для лунок и базовое оборудование для инкубации.

Выбор антигена и антитела

Первое, что нужно проверить, это действительно ли антиген и антитело специфически распознаются. На чистой планшетке не получится получить полезную линию, если антитело не распознает антиген.

Концентрация также заслуживает внимания. Для очищенных антител практической отправной точкой в ​​этом типе анализа является концентрация около 1 мг/мл. Если образец слишком разбавлен, осадок может быть слишком слабым, чтобы его можно было увидеть, даже когда происходит связывание.

Компания Solarbio предлагает иммунологические сыворотки для проведения иммунологической работы. В качестве примера можно привести... Козьи антитела к человеческому IgG (иммунная сыворотка) SA101который может быть соединен с подходящим антигеном человеческого IgG в соответствии с экспериментальным планом.

Подготовка агарозной среды

1%-ный раствор агарозы можно приготовить в физиологическом растворе. В зависимости от лабораторного метода также можно использовать фосфатный или барбитуратный буфер.

Агароза должна полностью раствориться. Неравномерный гель может изменить диффузию и затруднить интерпретацию конечной линии. Расплавленную агарозу обычно охлаждают до 50-60 °C перед тем, как вылить ее в чашку Петри.

Для описанной здесь схемы приготовления планшета подходит толщина геля около 3–5 мм. Агароза A8201 является одним из вспомогательных реагентов, которые можно использовать при приготовлении среды для иммунодиффузии на основе агарозы.

Как провести двойной иммунодиффузионный анализ

Хорошие результаты в большей степени зависят от тщательной подготовки планшета, чем от сложного оборудования. Лунки должны быть чистыми, гель должен оставаться влажным, а образцы должны находиться внутри отведенных для них лунок.

Подготовка пластины и лунок

После полного застывания агарозы в гель можно вырезать лунки. Обычно используется одна центральная лунка, окруженная несколькими внешними лунками.

Можно использовать лунки диаметром около 3 мм, при этом расстояние между центральной лункой и окружающими лунками должно составлять приблизительно 5-6 мм. Чистые края лунок имеют значение, поскольку поврежденный агар может вызывать неравномерную диффузию.

После удаления гелевых пробок внимательно проверьте дно лунок. Образец должен оставаться в лунке, а не просачиваться под слой агарозы.

Затем планшет можно пометить, чтобы в дальнейшем было легко идентифицировать каждую окружающую лунку. Этот небольшой шаг становится полезным, когда на одном планшете сравниваются несколько концентраций антигена или разведений антител.

Загрузка антигена и антитела

Антиген и антитело добавляются в подготовленные лунки по отдельности. При проведении серии разведений различные концентрации можно последовательно загружать в окружающие лунки. В зависимости от экспериментальной схемы, неразбавленный образец можно поместить в центральную лунку.

В качестве отрицательного контроля можно использовать физиологический раствор.

Заполняйте лунки аккуратно. Слишком малое количество образца может привести к слабому изображению, а переполнение может вызвать вытекание образца на поверхность геля и нарушить картину диффузии.

Исследователи, работающие с несколькими иммунологическими реагентами в рамках одного проекта, также могут найти практическое обсуждение выбора реагентов в [ссылка на соответствующий раздел]. Биохимические реагенты для иммунологии и исследования белков Полезно при настройке более широкого рабочего процесса.

Инкубация и наблюдение

После завершения загрузки накройте планшет и поместите его во влажную камеру. Гель должен оставаться влажным на протяжении всего периода инкубации.

Чашку Петри можно инкубировать при температуре 37°C и наблюдать за ней в течение примерно 10–36 часов. Во время первого эксперимента целесообразно проверять чашку несколько раз, а не ждать до конца.

Для выбора продукции или подбора антигенов, иммунных сывороток и вспомогательных реагентов в соответствии с исследовательским процессом исследователи могут связаться с компанией Solarbio, указав тип образца и планируемые условия проведения анализа.

Почему отсутствует линия преципитации?

Отсутствие строки не означает автоматически, что антитело не было использовано. Двойная иммунодиффузия зависит от диффузии, концентрации, состояния геля и времени наблюдения одновременно.

Перед заменой антител проверьте гель.

Начните с агарозы. Она должна быть полностью растворена, прежде чем заливать агар в чашку Петри. Поверхность должна быть ровной, а края лунок — чистыми.

В камере с повышенной влажностью также необходимо достаточное количество влаги. Если гель высохнет во время инкубации, это нарушит нормальную диффузию антигенов и антител.

Вопрос загрузки лунок заслуживает более пристального внимания. В частично заполненной лунке может просто содержаться слишком мало антигена или антител для образования четко видимого осадка.

Solarbio предоставляет более широкий спектр услуг. Решения для исследований в области иммунологии и биологических наук для лабораторий, работающих в области подготовки образцов, исследования белков, анализа антител и смежных рабочих процессов.

Проверьте концентрацию внимания и время наблюдения.

Если гель выглядит хорошо, следующий вопрос — концентрация. Очень низкая концентрация антител является распространенной причиной слабых или отсутствующих линий.

Концентрация антигена может вызывать ту же проблему. При тестировании незнакомого образца серия разведений часто оказывается более полезной, чем использование одной концентрации.

Неправильный выбор времени также может привести к ошибкам. Если проверить планшет слишком рано, антиген и антитело могут не успеть распространиться достаточно далеко, чтобы образовать видимую линию. Если же оставить его слишком долго, линию может стать трудноразличимой. Запись данных в нескольких временных точках дает гораздо более четкую картину.

Реагенты, обычно используемые в анализе.

В базовом эксперименте по двойной иммунодиффузии можно использовать порошок бычьего IgG SP033 вместе с кроличьими антителами к бычьему IgG SA233 или порошок человеческого IgG SP001 вместе с козьими антителами к человеческому IgG SA101.

Блокирующий препарат на основе нормальной сыворотки человека SL010 может использоваться в аналогичных иммунологических исследованиях, а физиологический раствор IN9004 и агароза A8201 помогают в подготовке диффузионной системы.

Эти продукты выполняют разные функции. Белок IgG выступает в качестве антигена в соответствующей конфигурации, иммунная сыворотка поставляет соответствующее антитело, а агароза обеспечивает среду, через которую перемещаются оба компонента.

Для лабораторий, переходящих от стандартных анализов к разработке индивидуальных методов определения белков или антител, компания Solarbio также предлагает следующие решения. техническое обслуживание охватывая потребности в исследованиях, связанных с антителами и белками.

Вывод

Для двойной иммунодиффузии не требуется сложного оборудования, но необходима контролируемая установка. Агароза должна быть однородной, края лунок должны быть чистыми, гель должен оставаться влажным, а концентрации антигена и антител должны находиться в пределах допустимого диапазона.

Если на планшете не наблюдается преципитационная линия, замена всего сразу обычно затрудняет поиск неисправностей. Сначала проверьте агарозу, затем лунки и объем загрузки, после чего концентрацию образца и время инкубации.

Для выбора продукции или по вопросам подбора антигена, иммунной сыворотки или вспомогательного реагента в соответствии с исследовательским процессом исследователи могут обратиться к нам. связаться с Solarbio с указанием типа образца и запланированных условий анализа.

Часто задаваемые вопросы

В1: В чем принцип двойного иммунодиффузионного анализа?

А1: Растворимый антиген и антитело помещают в отдельные лунки агарозного геля. Оба вещества диффундируют через гель. При достижении подходящего соотношения концентраций образуются комплексы антиген-антитело, которые выпадают в осадок и образуют видимую белую линию.

В2: Какая концентрация агарозы обычно используется для двойной иммунодиффузии?

A2: Для описанной здесь схемы приготовления чашки Петри можно использовать 1%-ный раствор агарозы. Перед заливкой агароза должна быть полностью растворена, чтобы обеспечить диффузию через однородную среду.

В3: Почему в моем иммунодиффузионном анализе отсутствует линия преципитации?

A3: К распространенным причинам относятся низкая концентрация антигена или антител, слишком мало образца в лунках, плохо сформированные лунки, неравномерный состав агарозы, сухая пластина или неподходящее время наблюдения. Каждый фактор следует проверять отдельно.

Вопрос 4: Какой должна быть концентрация антитела?

A4: Для очищенных антител в качестве практического ориентира для этого анализа можно использовать концентрацию около 1 мг/мл или выше. Подходящая концентрация может варьироваться в зависимости от пары антиген-антитело.

В5: Как долго следует инкубировать планшет для двойной иммунодиффузии?

A5: Чашку Петри можно инкубировать при температуре 37°C и наблюдать за ней в течение приблизительно 10–36 часов. Во время первого цикла проверки чашки каждые 5–10 часов можно определить, когда линия преципитации наиболее заметна.

В6: Почему линия преципитации образуется ближе к одной лунке?

A6: Положение линии зависит от концентрации антигена и антитела. При неравных концентрациях видимая линия обычно располагается ближе к лунке, содержащей компонент с более низкой концентрацией.

В7: Можно ли использовать метод двойной иммунодиффузии для измерения титра антител?

A7: Да. Этот анализ можно использовать для качественной идентификации и оценки титра. Он также может использоваться для анализа чистоты и сравнения образцов антигенов или антител из разных источников.

В8: Двойная иммунодиффузия — это то же самое, что и ИФА?

A8: Нет. Оба метода основаны на специфическом распознавании антигена и антитела, но двойная иммунодиффузия приводит к образованию видимой линии преципитации в агарозе. В ИФА используется система детекции, связанная с ферментом, и результаты обычно считываются по измеримому цветовому сигналу.