สารยับยั้งโมเลกุลขนาดเล็กของ EGFR: กลไกการออกฤทธิ์ การดื้อยา และการคัดเลือกสารประกอบที่สำคัญอย่างแท้จริง

EGFR เป็นเป้าหมายหนึ่งที่ปรากฏซ้ำแล้วซ้ำเล่าในการวิจัยโรคมะเร็ง มันปรากฏอยู่ในแผนภาพเส้นทาง การคัดกรองสารยับยั้ง และโครงการที่เกี่ยวข้องกับ NSCLC เกือบทุกโครงการ แต่เมื่อการทดลองก้าวพ้นทฤษฎีไปแล้ว จุดสนใจก็จะเปลี่ยนไปอย่างรวดเร็ว คำถามไม่ใช่ว่า EGFR ทำอะไรอีกต่อไป แต่เป็นว่าจะใช้สารยับยั้งชนิดใด และข้อมูลนั้นสะท้อนถึงการยับยั้งเส้นทางอย่างแท้จริงหรือไม่

ห้องปฏิบัติการต่างๆ ประสบปัญหานี้ในขั้นตอนที่แตกต่างกัน กลุ่มหนึ่งอาจต้องการเพียงแค่แสดงให้เห็นถึงการลดลงของการฟอสโฟรีเลชันของ EGFR อีกกลุ่มหนึ่งอาจกำลังทำงานกับแบบจำลองที่ดื้อต่อ T790M บางกลุ่มมุ่งเน้นไปที่อะพอพโทซิส บางกลุ่มมุ่งเน้นไปที่การเคลื่อนย้ายหรือการดื้อยาในระยะยาว คำถามเหล่านี้ล้วนเกี่ยวข้องกับ EGFR แต่การจัดเตรียมการทดลองเบื้องหลังนั้นแตกต่างกัน

สารยับยั้ง EGFR คืออะไร?

EGFR เป็นของตระกูลตัวรับ HER/ErbB และทำหน้าที่เป็นไทโรซีนไคเนสแบบทรานส์เมมเบรน ภายใต้สภาวะปกติ การจับกับลิแกนด์จะกระตุ้นให้เกิดการรวมตัวกันเป็นคู่และการฟอสโฟรีเลชันของตัวรับ ซึ่งจะกระตุ้นการส่งสัญญาณต่อไปในขั้นตอนถัดไป

ภายใต้สภาวะทางพยาธิวิทยา โดยเฉพาะอย่างยิ่งในเนื้องอกร้ายชนิดต่างๆ เช่น มะเร็งปอดชนิดไม่ใช่เซลล์ขนาดเล็ก มะเร็งลำไส้ใหญ่ และมะเร็งเซลล์สควาโมซาบริเวณศีรษะและลำคอ ยีน EGFR มักเกิดการกลายพันธุ์แบบจุด การกลายพันธุ์แบบลบ การกลายพันธุ์แบบแทรก หรือการแสดงออกมากเกินไป การเปลี่ยนแปลงเหล่านี้ทำให้โครงสร้างของตัวรับผิดปกติ ทำให้ตัวรับไม่สามารถทำงานภายใต้การควบคุมทางสรีรวิทยาตามปกติ และทำให้ตัวรับทำงานอยู่ตลอดเวลา กระบวนการนี้ส่งผลให้เซลล์มะเร็งเพิ่มจำนวนอย่างไม่จำกัด บุกรุกไปยังบริเวณใกล้เคียง และแพร่กระจายไปยังส่วนอื่นๆ ของร่างกาย ในขณะเดียวกันก็ยับยั้งการตายของเซลล์มะเร็ง ดังนั้น EGFR จึงทำหน้าที่เป็นเป้าหมายหลักในการเริ่มต้นและการลุกลามของเนื้องอก

นี่คือเหตุผลว่าทำไม EGFR จึงปรากฏอยู่บ่อยครั้งใน:

มะเร็งปอดชนิดไม่ใช่เซลล์ขนาดเล็ก

มะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนัก

มะเร็งเซลล์สความัสบริเวณศีรษะและลำคอ

วิธีการทำงานของสารยับยั้ง EGFR ในการทดลองจริง

สารยับยั้ง EGFR โมเลกุลขนาดเล็กส่วนใหญ่จะมุ่งเป้าไปที่บริเวณจับ ATP ของโดเมนไคเนส โดยการปิดกั้นการจับ ATP จะทำให้การฟอสโฟรีเลชันลดลงและทำให้การส่งสัญญาณในขั้นตอนถัดไปอ่อนลง

ในทางทฤษฎีแล้วดูเหมือนจะสอดคล้องกัน แต่ในทางปฏิบัติ ผลลัพธ์แตกต่างกันมากระหว่างแต่ละรุ่น

ตัวอย่างเช่น:

ในเซลล์ที่มีการกลายพันธุ์ของ EGFR ยา Gefitinib อาจลดความสามารถในการอยู่รอดและกระตุ้นให้เกิดอะพอพโทซิสภายใน 48 ชั่วโมง

ในแบบจำลองอีกแบบหนึ่งที่มีความต้านทานบางส่วน ความเข้มข้นเดียวกันอาจส่งผลต่อกระบวนการฟอสโฟรีเลชันเท่านั้น

ในเซลล์ที่ดื้อยา การตอบสนองอาจมีน้อยมากแม้จะใช้ยาในปริมาณสูงก็ตาม

ความแตกต่างเหล่านี้เกิดจากพื้นฐานของการกลายพันธุ์ การชดเชยวิถีการทำงาน และสภาวะการทดลอง แม้แต่ปัจจัยอย่างความหนาแน่นของเซลล์หรือวิธีการเตรียมสารละลายตั้งต้นก็สามารถเปลี่ยนแปลงผลลัพธ์ได้

ด้วยเหตุนี้ การเลือกสารประกอบจึงไม่ควรอาศัยเพียงค่า IC50 ที่รายงานไว้เท่านั้น สารประกอบที่ได้ผลดีในงานวิจัยชิ้นหนึ่ง อาจให้ผลลัพธ์ที่แตกต่างออกไปในห้องปฏิบัติการอื่น

เส้นทางสำคัญที่ต้องตรวจสอบ ไม่ใช่แค่ EGFR เพียงอย่างเดียว

EGFR ไม่ได้ทำงานเพียงลำพัง เมื่อถูกกระตุ้นแล้ว มันจะเชื่อมต่อกับส่วนประกอบอื่นๆ อีกหลายส่วน เส้นทางการส่งสัญญาณ ที่ควบคุมพฤติกรรมของเซลล์

ราส/อาร์เอฟ/แมปเค

เส้นทางนี้ถูกกระตุ้นอย่างต่อเนื่องโดย EGFR และควบคุมการแสดงออกของยีนในขั้นตอนถัดไป รวมถึงขับเคลื่อนการดำเนินไปของวงจรเซลล์และการเพิ่มจำนวนเซลล์ โดยทั่วไปแล้วจะใช้ ERK ที่ถูกฟอสฟอริเลตแล้วในการประเมินกิจกรรมของเส้นทางนี้ในการทดลอง

พีไอ3เค/เอเคที

มันส่งสัญญาณการอยู่รอดของเซลล์และยับยั้งอะพอพโทซิส การทำงานอย่างต่อเนื่องของเส้นทางนี้เป็นสาเหตุสำคัญของการดื้อยาต่อยาที่มุ่งเป้าไปที่ EGFR และการตายของเซลล์ที่บกพร่อง

เจเอเค/สเตท3

กระบวนการนี้ควบคุมทั้งการเพิ่มจำนวนเซลล์และการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกัน และมีบทบาทสำคัญในแบบจำลองการรักษาในระยะยาว สภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอก และการวิจัยเกี่ยวกับการดื้อยา AG-490 สามารถนำมาใช้เพื่อยับยั้งกระบวนการนี้โดยเฉพาะได้

ไม่ใช่ทุกการทดลองที่ต้องครอบคลุมทั้งสามเส้นทาง แต่การพึ่งพาเพียงแค่ความมีชีวิตของเซลล์นั้นมักไม่เพียงพอ การเพิ่มการวัดผลอย่างน้อยหนึ่งอย่างในขั้นตอนถัดไปจะทำให้ข้อมูลนั้นตีความได้ง่ายขึ้นในภายหลัง

การต่อต้านเป็นส่วนหนึ่งของกระบวนการทำงาน

การศึกษาเกี่ยวกับสารยับยั้ง EGFR เกือบทุกครั้งมักพบการดื้อยาในบางช่วง

มีการกลายพันธุ์สองแบบที่เกิดขึ้นซ้ำๆ:

ที790เอ็ม: ลดการจับตัวของสารยับยั้งรุ่นแรกๆ สำหรับแบบจำลองการดื้อยาที่เน้น T790M โค-1686 (โรซิเลทินิบ) สามารถเพิ่มเป็นตัวเลือกยับยั้ง EGFR ที่จำเพาะเจาะจงได้เมื่อเปรียบเทียบการตอบสนองของเซลล์ที่ดื้อยา

ซี797เอส: ส่งผลต่อการจับกันแบบโควาเลนต์ของสารยับยั้งที่ไม่สามารถย้อนกลับได้บางชนิด

นอกเหนือจากความต้านทานที่เกิดจากการกลายพันธุ์แล้ว การปิดกั้น EGFR อาจอ่อนแอลงได้จากการส่งสัญญาณแบบลัด ในบางแบบจำลอง การกระตุ้น MET หรือ HER2 ทำให้เส้นทางปลายทางยังคงทำงานอยู่แม้ว่ากิจกรรมของเอนไซม์ไคเนส EGFR จะลดลงก็ตาม เซลล์อื่นๆ อาจไม่แสดงการเปลี่ยนแปลงระดับโมเลกุลที่ชัดเจนในตอนเริ่มต้น แต่ต่อมาอาจแสดงลักษณะที่รุกรานมากขึ้นหรือตอบสนองต่อการรักษาได้น้อยลง รูปแบบเหล่านี้อาจมองข้ามได้ง่ายหากการทดลองบันทึกเฉพาะช่วงเวลาเริ่มต้นเท่านั้น

การยับยั้งที่อ่อนแอไม่ได้หมายความว่าคุณภาพของสารประกอบนั้นต่ำเสมอไป ตัวอย่างเช่น ในแบบจำลองที่มี T790M สารยับยั้ง EGFR ทั่วไปอาจให้ผลลัพธ์ที่จำกัดเพียงเพราะมันไม่ตรงกับพื้นฐานของการดื้อยา ดังนั้นขั้นตอนแรกคือการเลือกสารยับยั้งให้สอดคล้องกับลักษณะการกลายพันธุ์และวัตถุประสงค์ของการทดลอง

การจับคู่สารยับยั้งกับแบบจำลองเซลล์

ก่อนเลือกใช้สารยับยั้ง EGFR ควรตรวจสอบประเด็นที่มักส่งผลต่อผลลัพธ์ของการทดลองดังนี้:

สถานะการกลายพันธุ์ รวมถึงการลบเอ็กซอน 19, L858R, T790M และ C797S

ไม่ว่าสารยับยั้งนั้นจะเป็นแบบย้อนกลับได้หรือย้อนกลับไม่ได้ก็ตาม

ขอบเขตเป้าหมาย เช่น การยับยั้งเฉพาะ EGFR หรือการออกฤทธิ์ในกลุ่ม HER ที่กว้างขึ้น.เพลิตินิบ อาจรวมอยู่ในกลุ่มเปรียบเทียบสารยับยั้ง EGFR เมื่อการทดลองต้องการสารประกอบอื่นที่มุ่งเน้น EGFR สำหรับการทดสอบการตอบสนองต่อขนาดยาหรือการตรวจสอบความถูกต้องของการอ่านค่าฟอสโฟรีเลชัน

ความสามารถในการละลายและสภาวะการเก็บรักษา

จุดสิ้นสุดการทดสอบที่วางแผนไว้

เมื่อการออกแบบการศึกษาต้องการสารยับยั้ง EGFR แบบถาวรและเฉพาะเจาะจง ซีแอล-387785 สามารถนำมาพิจารณาเพื่อเปรียบเทียบการฟอสโฟรีเลชัน ความมีชีวิต หรือการตอบสนองของวิถีการทำงานปลายทางกับสารยับยั้ง EGFR ประเภทอื่นๆ ได้

ตัวอย่างเช่น:

Osimertinib มักถูกนำมาใช้ในการศึกษาที่เกี่ยวข้องกับ T790M

อาจเลือกใช้ Afatinib หรือ Dacomitinib เพื่อยับยั้ง ErbB ในวงกว้างขึ้น

ยา Lapatinib หรือ Neratinib มีประโยชน์เมื่อเกี่ยวข้องกับการส่งสัญญาณของ HER2

ควรตรวจสอบความสามารถในการละลายก่อนการทดลองครั้งแรก ไม่ใช่รอจนกว่าจะพบข้อมูลที่ไม่สอดคล้องกัน สารประกอบบางชนิดระบุว่าละลายได้ใน DMSO แต่ก็อาจตกตะกอนได้ในระหว่างการเตรียมสารละลายเข้มข้นหรือการเจือจางลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ เมื่อเกิดการตกตะกอนแล้ว ปริมาณยาที่ได้รับจริงอาจแตกต่างจากปริมาณยาที่วางแผนไว้ ปัญหานี้มักมองข้ามได้ง่ายในช่วงเริ่มต้น แต่จะเห็นได้ชัดเจนเมื่อผลการทดลองซ้ำหรือการทดลองที่ทำซ้ำเริ่มแยกออกจากกัน

ระบบตรวจจับหลายมิติสำหรับการวิจัย EGFR

การทดสอบเพียงครั้งเดียวมักไม่สามารถบอกเรื่องราวทั้งหมดได้ในงานวิจัยเกี่ยวกับ EGFR

จุดสิ้นสุดทั่วไป ได้แก่:

ความมีชีวิตของเซลล์

อะพอพโทซิส

การกระจายตัวของวงจรเซลล์

การฟอสโฟรีเลชันของ EGFR

การฟอสโฟรีเลชันของ ERK หรือ AKT

การอพยพและการรุกราน

ขั้นตอนการทำงานที่ได้ผลมักเริ่มต้นด้วยการไล่ระดับความเข้มข้นเพื่อกำหนดช่วงการตอบสนอง ในขั้นตอนนี้ ควรใช้การไล่ระดับความเข้มข้นเพื่อกำหนดรูปแบบการตอบสนอง ไม่ใช่แค่เลือกขนาดยาที่มีอัตราการรอดชีวิตต่ำ การเปลี่ยนแปลงอัตราการรอดชีวิตอาจเกิดจากอะพอพโทซิส การเจริญเติบโตที่ล่าช้า การหยุดชะงักของวงจรเซลล์ หรือความเป็นพิษต่อเซลล์แบบไม่จำเพาะเจาะจง ด้วยเหตุนี้ การทดสอบอะพอพโทซิสหรือการวิเคราะห์วงจรเซลล์จึงมักจำเป็นหลังจากทำการคัดกรองอัตราการรอดชีวิตครั้งแรก

หากคำถามหลักคือการยับยั้งวิถีการส่งสัญญาณ ควรวัดระดับ p-EGFR ร่วมกับตัวบ่งชี้ปลายทาง เช่น p-ERK หรือ p-AKT การเปรียบเทียบผลลัพธ์เหล่านี้กับข้อมูลความมีชีวิตของเซลล์จะช่วยแยกแยะผลกระทบจากการส่งสัญญาณที่แท้จริงออกจากการสูญเสียความแข็งแรงของเซลล์โดยทั่วไป เมื่อการทดลองขึ้นอยู่กับจุดสิ้นสุดเพียงจุดเดียว การตีความก็จะแคบลง

สารเคมีที่ใช้มีความสำคัญมากกว่าที่คาดคิด

ในการศึกษาเกี่ยวกับ EGFR สารยับยั้งเป็นเพียงส่วนหนึ่งของระบบเท่านั้น สารละลายบัฟเฟอร์ สารตรวจจับ และชุดทดสอบ ล้วนมีส่วนช่วยให้ได้ผลลัพธ์สุดท้าย

ปัญหาทั่วไปที่พบในการทดลองตามปกติ ได้แก่:

สภาวะบัฟเฟอร์ที่มีผลต่อกิจกรรมของเอนไซม์

ความแปรปรวนระหว่างชุดน้ำยา

สิ่งเจือปนที่ก่อให้เกิดผลกระทบที่ไม่พึงประสงค์

ระบบการผลิตน้ำยาที่มีคุณภาพน่าเชื่อถือมักจะมีการควบคุมคุณภาพอย่างเข้มงวดและมีความผันแปรต่อชุดการผลิตต่ำ ซึ่งช่วยให้ผลลัพธ์มีความสม่ำเสมอ

สำหรับห้องปฏิบัติการที่ทำการทดลองซ้ำๆ หรือเปรียบเทียบข้อมูลระหว่างโครงการต่างๆ ความสม่ำเสมอจะมีความสำคัญมากกว่าต้นทุนเริ่มต้น

หมายเหตุเกี่ยวกับการจัดหาสารประกอบและสารช่วยในการผลิต

การทดลองเกี่ยวกับสารยับยั้ง EGFR มักต้องใช้สารเคมีและสารช่วยหลายชนิด กลุ่มตัวอย่างเดียวกันอาจถูกวิเคราะห์ด้วยวิธีการทดสอบความมีชีวิตรอด การตรวจจับอะพอพโทซิส เวสเทิร์นบลอตติง และการทดสอบการทำงานโดยใช้เซลล์เพาะเลี้ยง ในกระบวนการนั้น สารละลายบัฟเฟอร์ แอนติบอดี สารตรวจจับ สารควบคุม และวัสดุเพาะเลี้ยง ล้วนมีผลต่อผลลัพธ์สุดท้าย หากส่วนใดส่วนหนึ่งของระบบสารเคมีไม่เสถียรหรือไม่เหมาะสมกับการทดสอบ ความแตกต่างของสัญญาณความมีชีวิตรอด อะพอพโทซิส และการฟอสโฟรีเลชันก็จะตรวจสอบได้ยากขึ้น

สำหรับ การศึกษา EGFR แบบหลายจุดสิ้นสุด, การจัดหาวัตถุดิบควรคำนึงถึงทั้งความครอบคลุมของผลิตภัณฑ์และการตรวจสอบย้อนกลับคุณภาพ ปักกิ่ง Solarbio Science & บริษัท เทคโนโลยี จำกัดบริษัทซึ่งก่อตั้งขึ้นในปี 2547 จัดจำหน่ายสารประกอบโมเลกุลขนาดเล็ก สารเคมีสำหรับชีววิทยาของเซลล์ สารเคมีทางชีวเคมี ผลิตภัณฑ์ที่เกี่ยวข้องกับ ELISA แอนติบอดี และสารเคมีวิจัยอื่นๆ ผลิตภัณฑ์เหล่านี้มีความเหมาะสมอย่างยิ่งเมื่อต้องการวางแผนการรักษาด้วยสารยับยั้ง การตรวจสอบความถูกต้องของเส้นทาง และการตรวจหาจุดสิ้นสุดของการทดลองไปพร้อมกัน

ทิศทางการวิจัย EGFR ในอนาคต

งานวิจัยล่าสุดในการพัฒนายาต้าน EGFR มุ่งเน้นไปที่:

การกำหนดเป้าหมาย C797S และการกลายพันธุ์ที่ทำให้เกิดการดื้อยาอื่นๆ

การปรับปรุงการแทรกซึมเข้าสู่สมองสำหรับแบบจำลองการแพร่กระจายของมะเร็ง สำหรับการศึกษาที่เกี่ยวข้องกับการแพร่กระจายของมะเร็งไปยังระบบประสาทส่วนกลาง หรือการยับยั้ง EGFR ที่สามารถแทรกซึมเข้าสู่สมองได้ AZD3759 (โซริเฟอร์ตินิบ) สามารถกล่าวถึงได้ว่าเป็นตัวเลือกที่เหมาะสมในการยับยั้ง EGFR

การรวมสารยับยั้งเพื่อชะลอการดื้อยา

การใช้ไบโอมาร์กเกอร์เพื่อเป็นแนวทางในการเลือกวิธีการรักษา

สำหรับการวิจัยเชิงทดลอง นั่นหมายถึงการผสมผสานการวิเคราะห์การกลายพันธุ์เข้ากับการทดสอบการทำงาน แทนที่จะพึ่งพาการตอบสนองของสารยับยั้งเพียงอย่างเดียว

ตรวจสอบขั้นสุดท้ายก่อนเริ่มการทดลอง

ก่อนเริ่มการรักษา การตรวจสุขภาพเบื้องต้นบางอย่างสามารถช่วยป้องกันปัญหาทั่วไปได้:

ยืนยันสายเซลล์และสถานะการกลายพันธุ์

เตรียมสารละลายสต็อกอย่างระมัดระวัง

รักษาระดับความเข้มข้นของ DMSO ให้คงที่

ปรับความหนาแน่นของการเพาะเลี้ยงเซลล์

กำหนดระยะเวลาการรักษาให้ชัดเจน

รวมถึงการควบคุมที่เหมาะสม

ขั้นตอนเหล่านี้ง่าย แต่การข้ามขั้นตอนเหล่านี้มักนำไปสู่ข้อมูลที่ไม่สอดคล้องกัน

สารยับยั้ง EGFR เป็นเครื่องมือทดลองคลาสสิกและเชื่อถือได้ในการวิจัยด้านมะเร็งวิทยา ตราบใดที่คุณภาพและฤทธิ์ทางชีวภาพของยาเป็นไปตามข้อกำหนด ผลลัพธ์ของการทดลองและความน่าเชื่อถือของข้อสรุปจะขึ้นอยู่กับว่าการออกแบบการทดลองสอดคล้องกับวัตถุประสงค์ทางชีววิทยาของการศึกษาหรือไม่

คำถามที่พบบ่อย

คำถามที่ 1: สารยับยั้งโมเลกุลขนาดเล็กของ EGFR คืออะไร?
สารประกอบที่ยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ EGFR kinase โดยปกติจะจับกับช่อง ATP และลดการส่งสัญญาณในขั้นตอนถัดไป

คำถามที่ 2: เหตุใดผลลัพธ์จึงแตกต่างกันระหว่างเซลล์แต่ละสายพันธุ์?
ภูมิหลังของการกลายพันธุ์ การกระตุ้นวิถีการทำงาน และสภาวะการทดลอง ล้วนส่งผลต่อการตอบสนองได้

คำถามที่ 3: โดยทั่วไปแล้วมีการวิเคราะห์วิถีการทำงานใดบ้าง?
RAS/RAF/MAPK, PI3K/AKT และ JAK/STAT3 เป็นเส้นทางหลักที่ใช้ในการตรวจสอบความถูกต้อง

คำถามที่ 4: ควรเลือกสารยับยั้งอย่างไร?
ควรพิจารณาถึงประเภทของการกลายพันธุ์ จุดเน้นของวิถีทางชีวภาพ ความสามารถในการละลาย และการทดสอบที่วางแผนไว้ มากกว่าที่จะพึ่งพาเพียงแค่ประสิทธิภาพเพียงอย่างเดียว

คำถามที่ 5: อะไรคือสาเหตุที่ทำให้เกิดการดื้อยาในการศึกษาเกี่ยวกับ EGFR?
การกลายพันธุ์ เช่น T790M และ C797S รวมถึงการส่งสัญญาณแบบบายพาสและการเปลี่ยนแปลงลักษณะทางฟีโนไทป์ เป็นสาเหตุหลัก