การทดสอบการแพร่กระจายภูมิคุ้มกันแบบคู่: หลักการ ขั้นตอน ผลลัพธ์ และการแก้ไขปัญหา

การทดสอบอิมมูโนดิฟฟิวชันแบบคู่เป็นวิธีการทดสอบทางภูมิคุ้มกันวิทยาที่ค่อนข้างง่าย อย่างไรก็ตาม ความผิดพลาดเล็กน้อยเพียงไม่กี่อย่างในระหว่างการเตรียมการ อาจทำให้แผ่นอะกาโรสว่างเปล่าแม้หลังจากบ่มเป็นเวลาหลายชั่วโมงแล้วก็ตาม ความเข้มข้นของแอนติบอดีที่ไม่เหมาะสม รูปทรงของหลุมที่ไม่ดี การแห้งของเจลในระหว่างการบ่ม หรือเพียงแค่การตรวจสอบแผ่นในเวลาที่ไม่เหมาะสม อาจทำให้เกิดปัญหาเหล่านี้ได้

วิธีนี้สามารถใช้สังเกตการตกตะกอนของแอนติเจนและแอนติบอดีโดยตรงได้ ไม่จำเป็นต้องใช้สารบ่งชี้หรือเครื่องมือใดๆ ในการตรวจจับปฏิกิริยา แอนติเจนที่ละลายได้และแอนติบอดีที่เกี่ยวข้องจะแพร่กระจายในรูปสารละลายผ่านเจลอะกาโรสเข้าหากัน เมื่อพวกมันมาเจอกันในอัตราส่วนความเข้มข้นที่เหมาะสม จะเกิดเส้นตกตะกอนสีขาวที่มองเห็นได้

สำหรับห้องปฏิบัติการที่ทำการวิเคราะห์ภูมิคุ้มกันวิทยาและโปรตีนเป็นประจำ สามารถสร้างชุดทดสอบได้โดยใช้สารเคมีมาตรฐานที่มีจำหน่ายทั่วไป กลุ่มผลิตภัณฑ์ Solarbioรวมถึงซีรั่มภูมิคุ้มกัน โปรตีนบริสุทธิ์ อะกาโรส น้ำเกลือ และวัสดุทางห้องปฏิบัติการที่เกี่ยวข้อง

การทดสอบการแพร่กระจายภูมิคุ้มกันแบบคู่ (Double Immunodiffusion Assay) คืออะไร?

เทคนิคการแพร่กระจายภูมิคุ้มกันแบบคู่ (Double immunodiffusion) อาศัยหลักการเคลื่อนที่ของแอนติเจนและแอนติบอดีที่ละลายได้ในเจลกึ่งแข็ง โดยจะวางแอนติเจนไว้ในช่องหนึ่งของเจล และวางแอนติบอดีที่สอดคล้องกันไว้ในอีกช่องหนึ่ง จากนั้นทั้งแอนติเจนและแอนติบอดีจะแพร่กระจายออกจากช่องของตนเองพร้อมกัน

เมื่อส่วนประกอบทั้งสองมีสัดส่วนที่เหมาะสม คอมเพล็กซ์แอนติเจน-แอนติบอดีจะขยายตัวจนมีขนาดใหญ่พอที่จะตกตะกอนได้ ทำให้เกิดเส้นสีขาวซึ่งโดยปกติจะสามารถมองเห็นได้โดยตรงบนจานเพาะเชื้อ

เหตุใดจึงเกิดเส้นตกตะกอน

เส้นแบ่งที่มองเห็นได้นั้นขึ้นอยู่กับความสมดุลระหว่างแอนติเจนและแอนติบอดีเป็นอย่างมาก หากมีส่วนประกอบใดส่วนประกอบหนึ่งมากเกินไป อาจทำให้ปฏิกิริยาเบี่ยงเบนไปจากช่วงความเข้มข้นที่สังเกตการตกตะกอนได้ง่ายที่สุด

นี่คือเหตุผลที่ตำแหน่งของเส้นตกตะกอนอาจเปลี่ยนแปลงได้ เมื่อความเข้มข้นของแอนติเจนและแอนติบอดีค่อนข้างใกล้เคียงกัน เส้นตกตะกอนมักจะปรากฏอยู่ระหว่างหลุมทั้งสอง เมื่อความเข้มข้นแตกต่างกัน เส้นตกตะกอนมักจะปรากฏใกล้กับหลุมที่มีส่วนประกอบที่มีความเข้มข้นต่ำกว่า

ปฏิกิริยาพื้นฐานอาจดูเรียบง่าย แต่คุณภาพและความเข้มข้นของแอนติบอดียังคงมีความสำคัญ นักวิจัยที่ต้องการความรู้พื้นฐานที่กว้างขึ้นเกี่ยวกับโครงสร้างและการจับตัวของอิมมูโนโกลบูลินสามารถอ่านเพิ่มเติมได้ที่ โมเลกุลชีววิทยาคืออะไร?.

วิธีการตรวจภูมิคุ้มกันแบบ Double Immunodiffusion สามารถนำไปใช้ในด้านใดได้บ้าง?

วิธีการนี้สามารถใช้สำหรับการระบุแอนติเจนหรือแอนติบอดีเชิงคุณภาพได้ นอกจากนี้ยังช่วยในการประเมินระดับความเข้มข้นของแอนติบอดี การวิเคราะห์ความบริสุทธิ์ และการเปรียบเทียบแอนติเจนหรือแอนติบอดีจากแหล่งที่มาต่างกันได้อีกด้วย

ด้วยเหตุนี้ วิธีการอิมมูโนดิฟฟิวชั่นแบบคู่จึงยังคงมีประโยชน์ในห้องปฏิบัติการสอนและการทำงานด้านภูมิคุ้มกันวิทยาขั้นพื้นฐาน ซึ่งปฏิกิริยาแอนติเจน-แอนติบอดีที่มองเห็นได้ก็เพียงพอที่จะตอบคำถามในการทดลองได้

วิธีนี้แตกต่างจากวิธีการเชิงปริมาณ เช่น ELISA เนื่องจากไม่มีระบบตรวจจับที่เชื่อมต่อกับเอนไซม์ และไม่มีการอ่านค่าการดูดกลืนแสง ผลลัพธ์หลักคือการก่อตัว ตำแหน่ง และความชัดเจนของเส้นตกตะกอน

วัสดุที่จำเป็นสำหรับการทดสอบการแพร่กระจายภูมิคุ้มกันแบบคู่

การทดลองทั่วไปเริ่มต้นด้วยซีรั่มและแอนติซีรั่มที่เกี่ยวข้อง หรือโปรตีนบริสุทธิ์ที่จับคู่กับแอนติบอดีที่รู้จักโปรตีนนั้น ระบบเจลต้องใช้อะกาโรสร่วมกับน้ำเกลือทางสรีรวิทยาหรือบัฟเฟอร์ที่เหมาะสมอื่นๆ

นอกจากนี้ยังต้องใช้จานเพาะเชื้อ หลอดหยด ปลายหลอดหยด ที่เจาะหลุม และอุปกรณ์บ่มเพาะพื้นฐานด้วย

การเลือกแอนติเจนและแอนติบอดี

สิ่งแรกที่ต้องตรวจสอบคือ แอนติเจนและแอนติบอดีจดจำกันได้อย่างจำเพาะเจาะจงหรือไม่ จานเพาะเชื้อที่สะอาดจะไม่แสดงเส้นที่ใช้งานได้หากแอนติบอดีไม่รู้จักแอนติเจน

ความเข้มข้นก็เป็นสิ่งที่ควรให้ความสนใจเช่นกัน สำหรับแอนติบอดีที่บริสุทธิ์แล้ว ความเข้มข้นประมาณ 1 มก./มล. ถือเป็นจุดเริ่มต้นที่เหมาะสมในวิธีการทดสอบประเภทนี้ หากตัวอย่างเจือจางเกินไป ตะกอนอาจอ่อนเกินไปจนมองไม่เห็นแม้ว่าจะมีการจับตัวกันเกิดขึ้นก็ตาม

Solarbio นำเสนอผลิตภัณฑ์เซรั่มภูมิคุ้มกันสำหรับงานด้านภูมิคุ้มกันวิทยา ตัวอย่างเช่น แอนติบอดีแพะต่อ IgG ของมนุษย์ (ซีรั่มภูมิคุ้มกัน) SA101ซึ่งสามารถจับคู่กับแอนติเจน IgG ของมนุษย์ที่เหมาะสมได้ตามการออกแบบการทดลอง

การเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้ออะกาโรส

สามารถเตรียมสารละลายอะกาโรส 1% ในสารละลายเกลือทางสรีรวิทยาได้ อาจใช้บัฟเฟอร์ฟอสเฟตหรือบัฟเฟอร์บาร์บิทูเรตก็ได้ ขึ้นอยู่กับวิธีการของห้องปฏิบัติการ

อะกาโรสต้องละลายให้หมด เจลที่ไม่สม่ำเสมออาจเปลี่ยนแปลงการแพร่กระจายและทำให้เส้นสุดท้ายอ่านยากขึ้น โดยทั่วไปแล้วอะกาโรสที่ละลายแล้วจะถูกทำให้เย็นลงจนถึงอุณหภูมิประมาณ 50 ถึง 60 องศาเซลเซียสก่อนที่จะเทลงในจานเพาะเชื้อ

ความหนาของเจลประมาณ 3 ถึง 5 มิลลิเมตรเหมาะสมสำหรับการจัดเตรียมเพลทตามที่อธิบายไว้ในที่นี้ อะกาโรส A8201 เป็นหนึ่งในสารช่วยเสริมที่สามารถใช้ในการเตรียมตัวกลางการแพร่กระจายภูมิคุ้มกันแบบอะกาโรสได้

วิธีการทำการทดสอบการแพร่กระจายภูมิคุ้มกันแบบคู่ (Double Immunodiffusion Assay)

ผลลัพธ์ที่ดีนั้นขึ้นอยู่กับการเตรียมเพลทอย่างระมัดระวังมากกว่าอุปกรณ์ที่ซับซ้อน ช่องในเพลทต้องสะอาด เจลต้องคงความชุ่มชื้น และตัวอย่างควรอยู่ในช่องที่กำหนดไว้เท่านั้น

การเตรียมจานและหลุม

หลังจากที่อะกาโรสแข็งตัวสนิทแล้ว สามารถเจาะหลุมลงในเจลได้ โดยทั่วไปจะใช้หลุมตรงกลางหนึ่งหลุมล้อมรอบด้วยหลุมด้านนอกหลายหลุม

สามารถใช้หลุมที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางประมาณ 3 มม. โดยเว้นระยะห่างระหว่างหลุมตรงกลางกับหลุมรอบข้างประมาณ 5 ถึง 6 มม. ขอบหลุมที่สะอาดมีความสำคัญ เนื่องจากอะกาโรสที่เสียหายอาจทำให้การแพร่กระจายไม่สม่ำเสมอ

หลังจากนำแผ่นเจลออกแล้ว ให้ตรวจสอบก้นหลุมอย่างละเอียด ตัวอย่างควรอยู่ในหลุม ไม่รั่วไหลลงไปใต้ชั้นอะกาโรส

จากนั้นจึงทำเครื่องหมายบนเพลทเพื่อให้สามารถระบุหลุมโดยรอบได้ง่ายในภายหลัง ขั้นตอนเล็กๆ นี้จะมีประโยชน์เมื่อต้องการเปรียบเทียบความเข้มข้นของแอนติเจนหรือการเจือจางของแอนติบอดีหลายระดับบนเพลทเดียวกัน

กำลังโหลดแอนติเจนและแอนติบอดี

แอนติเจนและแอนติบอดีจะถูกเติมลงในหลุมที่เตรียมไว้แยกกัน เมื่อทำการทดสอบชุดการเจือจาง สามารถใส่สารละลายที่มีความเข้มข้นต่างกันลงในหลุมรอบข้างตามลำดับได้ ส่วนตัวอย่างที่ไม่เจือจางสามารถวางไว้ในหลุมตรงกลางได้ ขึ้นอยู่กับการจัดเตรียมการทดลอง

สามารถใช้สารละลายเกลือทางสรีรวิทยาเป็นตัวควบคุมเชิงลบได้

เติมตัวอย่างลงในหลุมอย่างระมัดระวัง หากเติมตัวอย่างน้อยเกินไปอาจทำให้เส้นไม่ชัด ในขณะที่หากเติมมากเกินไปอาจทำให้ตัวอย่างหกเลอะบนพื้นผิวเจลและรบกวนรูปแบบการแพร่กระจายได้

นักวิจัยที่ทำงานกับสารรีเอเจนต์ทางภูมิคุ้มกันหลายชนิดในโครงการเดียวกัน อาจพบว่าการอภิปรายเกี่ยวกับการเลือกสารรีเอเจนต์ในทางปฏิบัติมีประโยชน์เช่นกัน สารเคมีชีวภาพสำหรับการวิจัยภูมิคุ้มกันวิทยาและโปรตีน มีประโยชน์เมื่อตั้งค่าขั้นตอนการทำงานโดยรวม

การฟักไข่และการสังเกต

เมื่อโหลดตัวอย่างเสร็จแล้ว ให้ปิดฝาจานเพาะเชื้อและนำไปไว้ในห้องที่มีความชื้น เจลควรคงความชุ่มชื้นตลอดระยะเวลาการบ่ม

สามารถบ่มเพาะจานเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ 37°C และสังเกตผลได้ในช่วงเวลาประมาณ 10 ถึง 36 ชั่วโมง ในการทดลองครั้งแรก ควรตรวจสอบจานเพาะเชื้อหลายๆ ครั้ง แทนที่จะรอจนถึงสิ้นสุดการทดลอง

สำหรับการคัดเลือกผลิตภัณฑ์หรือการจับคู่แอนติเจน เซรั่มภูมิคุ้มกัน และสารเคมีสนับสนุนต่างๆ ให้เข้ากับขั้นตอนการวิจัย นักวิจัยสามารถติดต่อ Solarbio พร้อมแจ้งประเภทของตัวอย่างและเงื่อนไขการทดสอบที่วางแผนไว้ได้

ทำไมจึงไม่มีเส้นตกตะกอน?

การที่ไม่มีเส้นตัวอย่างปรากฏอยู่ไม่ได้หมายความว่าแอนติบอดีนั้นล้มเหลวเสมอไป การตรวจด้วยวิธีอิมมูโนดิฟฟิวชันแบบคู่ขึ้นอยู่กับการแพร่กระจาย ความเข้มข้น สภาพของเจล และเวลาในการสังเกตไปพร้อมๆ กัน

ตรวจสอบเจลก่อนเปลี่ยนแอนติบอดี

เริ่มจากอะกาโรส ควรละลายให้หมดก่อนเทลงในเพลท พื้นผิวควรเรียบเสมอกัน และขอบของหลุมควรเรียบร้อย

ห้องควบคุมความชื้นก็ต้องการความชื้นที่เพียงพอเช่นกัน หากเจลแห้งระหว่างการบ่ม การแพร่กระจายของแอนติเจนและแอนติบอดีตามปกติจะถูกรบกวน

การบรรจุตัวอย่างลงในหลุมทดสอบนั้นสมควรได้รับการตรวจสอบอีกครั้ง หลุมทดสอบที่บรรจุตัวอย่างไม่เต็มอาจมีแอนติเจนหรือแอนติบอดีน้อยเกินไปจนไม่สามารถเกิดตะกอนที่มองเห็นได้ชัดเจน

Solarbio นำเสนอทางเลือกที่หลากหลายยิ่งขึ้น โซลูชันการวิจัยด้านภูมิคุ้มกันวิทยาและวิทยาศาสตร์ชีวภาพ สำหรับห้องปฏิบัติการที่ทำงานด้านการเตรียมตัวอย่าง การวิจัยโปรตีน การทดสอบแอนติบอดี และกระบวนการทำงานที่เกี่ยวข้อง

ตรวจสอบสมาธิและเวลาในการสังเกต

ถ้าเจลดูดีแล้ว คำถามต่อไปคือเรื่องความเข้มข้น ความเข้มข้นของแอนติบอดีที่ต่ำมากเป็นสาเหตุทั่วไปที่ทำให้เส้นปรากฏจางหรือไม่ปรากฏเลย

ความเข้มข้นของแอนติเจนอาจทำให้เกิดปัญหาเดียวกันได้ เมื่อทดสอบตัวอย่างที่ไม่คุ้นเคย การเจือจางหลายระดับมักจะมีประโยชน์มากกว่าการใช้ความเข้มข้นเพียงระดับเดียว

จังหวะเวลาที่เหมาะสมก็อาจเป็นปัญหาได้เช่นกัน หากตรวจสอบจานเพาะเชื้อเร็วเกินไป แอนติเจนและแอนติบอดีอาจยังกระจายตัวไม่ทั่วถึงจนเกิดเป็นเส้นที่มองเห็นได้ หากปล่อยทิ้งไว้นานเกินไป เส้นนั้นก็อาจมองเห็นได้ยาก การบันทึกผลที่หลายช่วงเวลาจะช่วยให้เห็นภาพชัดเจนยิ่งขึ้น

สารเคมีที่ใช้กันทั่วไปในการทดสอบ

การทดลองการแพร่กระจายภูมิคุ้มกันแบบคู่ขั้นพื้นฐาน อาจใช้ผง IgG จากวัว SP033 ร่วมกับแอนติบอดี IgG จากกระต่ายต่อวัว SA233 หรือผง IgG จากมนุษย์ SP001 ร่วมกับแอนติบอดี IgG จากแพะต่อมนุษย์ SA101

สารปิดกั้น Normal Human Serum SL010 อาจใช้ในงานด้านภูมิคุ้มกันวิทยาที่เกี่ยวข้อง ในขณะที่ Normal saline IN9004 และ Agarose A8201 ช่วยในการเตรียมระบบการแพร่กระจาย

ผลิตภัณฑ์เหล่านี้มีหน้าที่แตกต่างกัน โปรตีน IgG ทำหน้าที่เป็นแอนติเจนในระบบที่เหมาะสม เซรั่มภูมิคุ้มกันให้แอนติบอดีที่เกี่ยวข้อง และอะกาโรสเป็นตัวกลางที่ช่วยให้ส่วนประกอบทั้งสองเคลื่อนที่ผ่านกันได้

สำหรับห้องปฏิบัติการที่เปลี่ยนจากการทดสอบแบบมาตรฐานไปเป็นการผลิตโปรตีนหรือแอนติบอดีแบบกำหนดเอง Solarbio ยังให้บริการเพิ่มเติมอีกด้วย บริการทางเทคนิค ครอบคลุมความต้องการด้านการวิจัยที่เกี่ยวข้องกับแอนติบอดีและโปรตีน

ข้อสรุป

การตรวจหาแอนติเจนด้วยวิธี Double immunodiffusion ไม่จำเป็นต้องใช้อุปกรณ์ที่ซับซ้อน แต่ต้องมีการควบคุมการจัดเตรียมอย่างเหมาะสม อะกาโรสต้องมีความสม่ำเสมอ ขอบของหลุมทดสอบต้องสะอาด เจลต้องคงความชุ่มชื้น และความเข้มข้นของแอนติเจนและแอนติบอดีต้องอยู่ในช่วงที่เหมาะสม

เมื่อแผ่นเพลทไม่แสดงเส้นตกตะกอน การเปลี่ยนทุกอย่างพร้อมกันมักจะทำให้การแก้ไขปัญหายากขึ้น ตรวจสอบอะกาโรสก่อน จากนั้นตรวจสอบหลุมและปริมาตรการโหลด ตามด้วยความเข้มข้นของตัวอย่างและเวลาในการบ่ม

สำหรับการเลือกผลิตภัณฑ์หรือข้อสงสัยเกี่ยวกับการจับคู่แอนติเจน เซรั่มภูมิคุ้มกัน หรือสารช่วยเสริมกับขั้นตอนการทำงานวิจัย นักวิจัยสามารถ ติดต่อ Solarbio โดยพิจารณาจากประเภทของตัวอย่างและเงื่อนไขการทดสอบที่วางแผนไว้

คำถามที่พบบ่อย

คำถามที่ 1: หลักการของการทดสอบการแพร่กระจายภูมิคุ้มกันแบบคู่คืออะไร?

A1: นำแอนติเจนและแอนติบอดีที่ละลายน้ำได้ใส่ลงในช่องแยกกันในเจลอะกาโรส ทั้งสองชนิดจะแพร่ผ่านเจล เมื่อมาเจอกันในอัตราส่วนความเข้มข้นที่เหมาะสม คอมเพล็กซ์แอนติเจน-แอนติบอดีจะตกตะกอนและก่อตัวเป็นเส้นสีขาวที่มองเห็นได้

Q2: โดยทั่วไปแล้ว ความเข้มข้นของอะกาโรสที่ใช้สำหรับการทดสอบภูมิคุ้มกันแบบคู่ (double immunodiffusion) คือเท่าใด?

A2: สามารถใช้สารละลายอะกาโรส 1% สำหรับการจัดเตรียมเพลทตามที่อธิบายไว้ที่นี่ ควรละลายอะกาโรสให้หมดก่อนเท เพื่อให้การแพร่กระจายเกิดขึ้นอย่างสม่ำเสมอทั่วทั้งตัวกลาง

Q3: เหตุใดจึงไม่มีเส้นตกตะกอนในการทดสอบอิมมูโนดิฟฟิวชันของฉัน?

A3: สาเหตุทั่วไป ได้แก่ ความเข้มข้นของแอนติเจนหรือแอนติบอดีต่ำเกินไป ปริมาณตัวอย่างในหลุมน้อยเกินไป หลุมขึ้นรูปไม่ดี อะกาโรสไม่สม่ำเสมอ จานแห้ง หรือระยะเวลาการสังเกตไม่เหมาะสม ควรตรวจสอบแต่ละปัจจัยแยกกัน

คำถามที่ 4: แอนติบอดีควรมีความเข้มข้นเท่าใด?

A4: สำหรับแอนติบอดีที่บริสุทธิ์แล้ว ความเข้มข้นประมาณ 1 มก./มล. หรือสูงกว่านั้น สามารถใช้เป็นค่าอ้างอิงที่เหมาะสมสำหรับการทดสอบนี้ได้ ความเข้มข้นที่เหมาะสมอาจแตกต่างกันไปตามคู่ของแอนติเจนและแอนติบอดี

Q5: ควรบ่มเพาะจานทดสอบการแพร่กระจายภูมิคุ้มกันแบบสองชั้นนานเท่าใด?

A5: สามารถบ่มเพาะจานเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ 37°C และสังเกตการณ์ได้ประมาณ 10 ถึง 36 ชั่วโมง ในการทดลองครั้งแรก การตรวจสอบจานเพาะเชื้อทุกๆ 5 ถึง 10 ชั่วโมง จะช่วยให้ระบุได้ว่าเส้นตกตะกอนปรากฏชัดเจนที่สุดเมื่อใด

Q6: เหตุใดเส้นตกตะกอนจึงปรากฏใกล้กับหลุมหนึ่งมากกว่าอีกหลุมหนึ่ง?

A6: ตำแหน่งของเส้นจะได้รับผลกระทบจากความเข้มข้นของแอนติเจนและแอนติบอดี เมื่อความเข้มข้นไม่เท่ากัน โดยทั่วไปเส้นที่มองเห็นได้จะอยู่ใกล้กับหลุมที่มีส่วนประกอบที่มีความเข้มข้นต่ำกว่า

Q7: สามารถใช้วิธีอิมมูโนดิฟฟิวชั่นคู่ในการวัดระดับแอนติบอดีได้หรือไม่?

A7: ใช่ค่ะ การทดสอบนี้สามารถใช้สำหรับการระบุเชิงคุณภาพและการประเมินระดับความเข้มข้นได้ นอกจากนี้ยังสามารถใช้สนับสนุนการวิเคราะห์ความบริสุทธิ์และการเปรียบเทียบตัวอย่างแอนติเจนหรือแอนติบอดีจากแหล่งที่มาต่างๆ ได้อีกด้วย

Q8: การทดสอบอิมมูโนดิฟฟิวชันแบบคู่เหมือนกับการทดสอบ ELISA หรือไม่?

A8: ไม่ใช่ ทั้งสองวิธีอาศัยการจดจำแอนติเจน-แอนติบอดีจำเพาะ แต่การทดสอบอิมมูโนดิฟฟิวชันแบบคู่จะสร้างเส้นตกตะกอนที่มองเห็นได้ในอะกาโรส ส่วน ELISA ใช้ระบบตรวจจับที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ และโดยทั่วไปจะอ่านผลผ่านสัญญาณสีที่วัดได้