Explicación de las HDAC: Cómo las histonas deacetilasas controlan la expresión génica

Una mutación altera la función de un gen. Esto es bien sabido por la mayoría de los investigadores. Sin embargo, la regulación de los genes por parte de la célula es mucho más compleja, ya que los genes pueden ser regulados al alza, a la baja o incluso completamente reprimidos por la célula, todo ello sin que se produzca ningún cambio en la secuencia de ADN.

Las histonas deacetilasas, generalmente llamadas HDAC, participan en este control. Modifican el estado de acetilación de las histonas y de muchas otras proteínas. El resultado puede afectar el empaquetamiento de la cromatina, la transcripción, el crecimiento celular, el metabolismo, la señalización inmunitaria y las respuestas al estrés.

¿Qué es la HDAC y qué efecto tiene sobre la cromatina?

La acetilación de histonas afloja el empaquetamiento del ADN.

El ADN no se encuentra disuelto en el núcleo como moléculas libres, sino empaquetado en cromatina, la cual está compuesta por ADN y proteínas histonas. Los residuos de lisina en las colas de las histonas pueden ser acetilados por grupos acetilo. Cuantos más grupos acetilo se añadan a las colas de las histonas, menor será la carga positiva en estas regiones.

El enlace entre las histonas y el ADN con carga negativa se debilita. Los factores de transcripción y la ARN polimerasa tienen mayores probabilidades de llegar al gen.

Cabe destacar que la acetilación de las histonas no activa todos los genes cercanos. Otros genes se activarán mediante sus respectivos promotores, factores de transcripción, etc., en los distintos tipos celulares. Además, otras proteínas de la cromatina predominarán sobre las histonas acetiladas, abriendo así zonas específicas de la cromatina. Esto permite el acceso a la maquinaria de transcripción, pero no determina el resultado final por sí solo.

Las HDAC eliminan los grupos acetilo.

Las enzimas HDAC revierten este cambio. Eliminan los grupos acetilo de las lisinas de las histonas. Una vez que el grupo acetilo desaparece, la lisina vuelve a tener una carga positiva más fuerte. Las histonas pueden sujetar el ADN con mayor firmeza, y la cromatina puede volverse más difícil de acceder.

Por eso, las HDAC suelen asociarse con una menor transcripción génica. Algunos artículos las denominan enzimas silenciadoras de genes. Esta descripción no es del todo errónea, pero resulta un tanto simplista.

Una HDAC normalmente actúa en conjunto con otras proteínas. Su efecto depende del complejo al que se une y de la célula en la que dicho complejo está activo. El mismo inhibidor puede producir un resultado en una línea celular tumoral y otro diferente en una célula inmunitaria primaria. No basta con fijarse únicamente en el nombre del compuesto.

Las histonas no son los únicos objetivos.

Las HDAC también actúan sobre proteínas no histonas. Estas incluyen factores de transcripción, proteínas del citoesqueleto, chaperonas moleculares y proteínas implicadas en la reparación del ADN. La eliminación de un grupo acetilo puede alterar la estabilidad, la localización, las proteínas con las que interactúa o la actividad de una proteína.

HDAC6 es un buen ejemplo. Gran parte de su función está relacionada con proteínas citoplasmáticas como la alfa-tubulina. También participa en el transporte y el control de calidad de las proteínas.

Un investigador que estudia HDAC6 puede aprender muy poco midiendo solo la acetilación de histonas. La alfa-tubulina acetilada, la agregación de proteínas, el movimiento celular o marcadores de vías relacionadas pueden ser más útiles. La investigación más amplia de Solarbio catálogo de productos de investigación Incluye compuestos, anticuerpos, kits y reactivos de apoyo para estos flujos de trabajo combinados.

¿En qué se diferencian las principales familias de HDAC?

Las HDAC de clase I están estrechamente relacionadas con la transcripción.

Las HDAC1, 2, 3 y 8 pertenecen a la Clase I de las HDAC. Se encuentran principalmente en el núcleo y han sido ampliamente estudiadas en cuanto a su papel en la transcripción, así como en el control del ciclo celular, la proliferación, la diferenciación y la apoptosis.

HDAC1 y HDAC2 suelen estar presentes en grandes complejos represores. HDAC3 también requiere proteínas coactivas para ser completamente activa. No se limita a recorrer el núcleo de forma inespecífica eliminando grupos acetilo.

Esto es importante al interpretar los resultados de un inhibidor. Un inhibidor de clase I puede modular la expresión de un gran número de genes. Puede provocar que las células entren en una fase de crecimiento lento debido a causas como la detención del ciclo celular, la apoptosis o el estrés, y esta fase de crecimiento lento puede deberse a múltiples razones. Es necesario examinar con mayor detalle el efecto de un acetilador de histonas sobre la acetilación de histonas y la expresión de los genes diana para llegar a una conclusión.

Las clases II y IV funcionan de manera diferente.

Las HDAC de clase IIa constituyen un subgrupo de las histonas deacetilasas de clase II, que incluye HDAC4, HDAC5, HDAC7 y HDAC9. Estas proteínas son nucleares o citoplasmáticas y pueden ser altamente móviles y transitorias entre ambos compartimentos, especialmente en respuesta a eventos de señalización. Estas enzimas son unidades catalíticas relativamente débiles, pero forman complejos multiproteicos estables con otras proteínas.

Las enzimas HDAC6 y HDAC10 pertenecen a la clase IIb. Se conoce más sobre HDAC6 porque es el único miembro de la familia de enzimas HDAC que posee dos dominios catalíticos. También se sabe que está relacionada con la alfa-tubulina de los microtúbulos y con diversas etapas del transporte y la homeostasis de proteínas.

HDAC11 se encuentra solo en la Clase IV. Todavía se está estudiando en la regulación inmunitaria y el metabolismo. Cuando un proyecto se centra en una clase de HDAC en lugar de la actividad desacetilasa general, ayuda a comprobar la relación vías de señalización antes de elegir el inhibidor y los marcadores posteriores.

Las sirtuinas utilizan NAD+ en lugar de zinc.

Las sirtuinas SIRT1 a SIRT7 se conocen colectivamente como HDAC de clase III. Son desacetilasas que se diferencian de las demás HDAC por su mecanismo de acción y la química de su reacción. La mayoría de las demás HDAC se denominan "dependientes de zinc" porque su sitio activo contiene un ion zinc que participa directamente en la eliminación de un grupo acetilo del sustrato. Las sirtuinas, en cambio, utilizan NAD+.

Esa conexión con el NAD+ introduce a las sirtuinas en estudios sobre el estado nutricional, el metabolismo de la glucosa y los lípidos, el estrés oxidativo, las mitocondrias y el envejecimiento. Su localización también varía. Algunas actúan principalmente en el núcleo, mientras que otras están más estrechamente relacionadas con el citoplasma o las mitocondrias.

Un experimento con SIRT1 no debería ser una simple copia de uno con SIRT3. Los sustratos son diferentes. La localización es diferente. Los resultados también deberían ser diferentes. Para SIRT3, la acetilación mitocondrial y los marcadores respiratorios pueden ser útiles. Para SIRT1, las dianas nucleares y la señalización metabólica merecen mayor atención.

¿Cómo influye la catálisis de la HDAC en la elección del inhibidor?

Las HDAC dependientes de zinc comparten una reacción básica.

Las HDAC de clase I, II y IV utilizan principalmente zinc en su sitio catalítico. La lisina acetilada ingresa al sitio activo. El zinc ayuda a posicionar el grupo acetilo y una molécula de agua. Los aminoácidos de la enzima activan el agua, que luego ataca al grupo acetilo.

Se libera acetato y la lisina vuelve a su estado desacetilado.

Muchos inhibidores de HDAC se diseñan en torno a este sitio de unión. Una parte de la molécula interactúa con la región del zinc. Otras partes ayudan al compuesto a entrar en el canal y afectan a su capacidad para unirse a los diferentes subtipos de HDAC.

Dos compuestos pueden llevar la etiqueta de "inhibidor de HDAC", pero comportarse de forma muy diferente en las células. Su afinidad de unión, la cobertura de subtipos, la solubilidad y la permeabilidad celular pueden influir en el resultado.

Las sirtuinas siguen otra ruta química.

Las sirtuinas no utilizan la misma reacción centrada en el zinc. Consumen NAD+ durante la desacetilación. En términos sencillos, el NAD+ participa en reacciones catalíticas y se descompone. Al mismo tiempo, transfiere los grupos acetilo de las histonas a sus propias moléculas, logrando finalmente la eliminación de dichos grupos. Este proceso produce nicotinamida y un producto relacionado con la ADP-ribosa.

La nicotinamida se usa frecuentemente en estudios donde los investigadores buscan reducir la actividad de las sirtuinas. El resveratrol también aparece en trabajos relacionados con la señalización y el metabolismo de las sirtuinas. Ninguno de estos compuestos debe considerarse un interruptor perfecto para un solo objetivo.

Los compuestos celulares suelen actuar sobre más de una proteína. La dosis también es importante. Una concentración baja puede generar una respuesta bastante específica, mientras que una concentración más alta provoca estrés no relacionado o efectos fuera del objetivo.

El enfoque más seguro consiste en combinar el compuesto con un marcador objetivo directo o con una respuesta posterior conocida.

Selectividad depende en el condiciones de trabajo

Vorinostat se usa comúnmente como un inhibidor de HDAC de amplio espectro. Ricolinostat aparece en muchos estudios centrados en HDAC6. TMP195 se asocia frecuentemente con la investigación de HDAC de clase IIa.

Estas descripciones son útiles para evaluar productos, pero no eliminan la necesidad de validación. Un compuesto que parece selectivo en un ensayo bioquímico puede volverse menos selectivo al aumentar la dosis celular.

El nivel de disolvente es otro problema común. Muchos inhibidores de HDAC se preparan en DMSO. Si se añade demasiado disolvente, la concentración final de DMSO puede afectar el comportamiento de la membrana, el metabolismo o la supervivencia celular. El control del vehículo debe contener la misma cantidad de disolvente que todos los grupos tratados.

Antes de preparar la primera placa, el rango de concentración, el tiempo de tratamiento, el nivel del vehículo y el marcador del mecanismo ya deben estar claros.

¿Por qué se estudian las HDAC en la biología celular normal y en las enfermedades?

El crecimiento celular depende de la actividad génica controlada.

Las HDAC son enzimas normales. Las células sanas las necesitan. Ayudan a controlar cuándo se activan los genes implicados en el crecimiento, la diferenciación y la apoptosis.

Durante el desarrollo, los distintos tejidos siguen programas genéticos diferentes. Las células hepáticas, nerviosas, musculares e inmunitarias no utilizan los mismos genes simultáneamente. Los miembros de la familia HDAC contribuyen a mantener estos patrones.

Los problemas comienzan cuando se altera el equilibrio. En algunas células cancerosas, una actividad elevada o anómala de HDAC puede mantener inactivos los genes que controlan el crecimiento. Un inhibidor podría ayudar a reactivar esos programas. También puede afectar a muchos otros genes, por lo que una disminución en la viabilidad celular no puede explicar el mecanismo por sí sola.

Las sirtuinas están estrechamente relacionadas con los cambios metabólicos.

Las sirtuinas se estudian con frecuencia cuando los investigadores analizan el metabolismo o las mitocondrias. Su dependencia del NAD+ implica que su actividad puede variar según el estado energético y redox de la célula.

SIRT1 se asocia frecuentemente con la señalización nuclear y metabólica. SIRT3 se estudia a menudo mediante la acetilación de proteínas mitocondriales. Otras sirtuinas tienen sus propias localizaciones y funciones.

Una afirmación tan general como «el compuesto mejora el envejecimiento» no resulta muy útil en el laboratorio. Es mejor preguntarse qué cambió. ¿Fue la producción de ATP, el potencial de membrana mitocondrial, las especies reactivas de oxígeno, la respiración o una proteína de respuesta al estrés? Una vez que se define el resultado final, el experimento resulta más fácil de repetir.

Las respuestas inmunitarias también implican la actividad de las HDAC.

Las HDAC participan en la activación de las células T, el comportamiento de los macrófagos, la producción de citocinas y la señalización inflamatoria. Tanto la actividad excesiva como la insuficiente pueden alterar este equilibrio.

El mismo inhibidor puede reducir los marcadores inflamatorios en un modelo y perjudicar la supervivencia celular en otro. Las células primarias son especialmente sensibles a las diferencias entre donantes, los métodos de aislamiento y el estado de activación.

Para proyectos que combinan compuestos, anticuerpos, ensayos de citoquinas o varios tipos de muestras, Solarbio’s servicios técnicos Puede ser útil para la selección de ensayos y la planificación del flujo de trabajo. El objetivo no es añadir más pruebas sin motivo. Cada prueba debe responder a una parte específica de la pregunta de investigación.

¿Cómo se puede configurar un experimento con HDAC más limpio?

Defina el objetivo antes de comprar el compuesto.

La pregunta sobre la inhibición de HDAC no es una cuestión experimental sólida. Es demasiado general. Una pregunta más pertinente sería: ¿la inhibición de HDAC6 aumenta la acetilación de la alfa-tubulina antes de modificar la migración celular?

Esa frase ya lo dice todo. Necesitas un compuesto relacionado con HDAC6, una lectura de alfa-tubulina acetilada, al menos dos puntos temporales y un ensayo de migración.

El modelo celular debe expresar la proteína diana. Compruebe el nivel basal mediante qPCR o Western blot, si es posible. Un resultado negativo en un modelo con expresión casi nula de la proteína diana no demuestra que el inhibidor haya fallado.

Las células primarias requieren un cuidado adicional. Los antecedentes del donante, el número de pasajes, las condiciones de aislamiento y el estado de activación pueden modificar la respuesta.

Utilice más de una lectura

La viabilidad celular es fácil de medir, pero no es específica. Una señal baja puede deberse a apoptosis, detención del ciclo celular, supresión metabólica, daño en la membrana o interferencia en el ensayo.

Un experimento con HDAC debería incluir un marcador más cercano al objetivo. Para un estudio de Clase I, esto podría ser la acetilación de histonas y la expresión del gen objetivo. Para HDAC6, la alfa-tubulina acetilada suele ser más útil. Para las sirtuinas, los marcadores mitocondriales o relacionados con NAD+ podrían ser más adecuados.

Para la detección general de histonas, la Anticuerpo monoclonal anti-histona H3.1 Puede admitir flujos de trabajo de WB, IP, IF, IHC o ELISA según las aplicaciones indicadas. Aun así, se requiere un anticuerpo específico para la modificación cuando el experimento se centra en un sitio de acetilación particular.

Mantén el controles simples y completo.

Comience con un rango de concentración razonable en lugar de una dosis alta. Incluya un punto de tiempo temprano para la acetilación y un punto de tiempo posterior para la expresión génica o el comportamiento celular.

Deben estar presentes tanto el control sin tratamiento como el control con vehículo. Siempre que sea posible, añada un control positivo conocido. Un segundo inhibidor con una estructura química diferente puede ayudar a determinar si el resultado se corresponde con la diana terapéutica o con la actividad inespecífica de un compuesto.

Los datos más claros suelen mostrar un orden. Primero, cambia el marcador de acetilación. Luego, cambia la vía metabólica. El fenotipo celular aparece más tarde.

Los pequeños detalles de manipulación aún pueden arruinar esa secuencia. Los ciclos repetidos de congelación-descongelación, el orden de dilución incorrecto, la exposición prolongada a temperatura ambiente o la densidad celular desigual pueden crear un resultado que parece biológico pero que en realidad es técnico. Artículos técnicos y notas de aplicación Se puede consultar antes de la primera prueba para obtener detalles sobre el manejo del producto y los ensayos.

Dado que un proyecto sobre HDAC rara vez consiste simplemente en comprar un inhibidor y medir la viabilidad celular, lo más probable es que también necesite otros anticuerpos, otros compuestos moduladores de vías metabólicas y una serie de ensayos para monitorizar los cambios en la apoptosis, la liberación de citoquinas o los marcadores mitocondriales, por nombrar solo algunos, antes de que sus datos empiecen a contarle una historia coherente.

Beijing Solarbio Ciencia y Tecnología Co., Ltd. ha suministrado reactivos para la investigación en ciencias de la vida desde 2004. Su catálogo abarca compuestos de moléculas pequeñas, anticuerpos, kits ELISA, kits de ensayos bioquímicos, reactivos de biología celular y servicios relacionados. Para los investigadores que trabajan con múltiples métodos de lectura, la empresa soluciones para la investigación en ciencias de la vida Ofrecer un punto de partida útil.

Conclusión

Las HDAC no son un grupo simple de enzimas que silencian genes. Su función depende de la clase de enzima, la ubicación celular, el mecanismo catalítico, las proteínas asociadas y el modelo utilizado en el estudio.

Un experimento sólido con HDAC comienza con un objetivo claro. A continuación, se compara el compuesto con una lectura molecular directa, controles adecuados y un resultado funcional posterior. Cuando estos elementos siguen la misma línea biológica, los datos son más fáciles de explicar y mucho más fáciles de reproducir.

FAQ

P1: ¿Qué significa HDAC?

A1: HDAC significa histona desacetilasa. Estas enzimas eliminan los grupos acetilo de las histonas y otras proteínas. Esto puede alterar la estructura de la cromatina, el comportamiento de las proteínas y la expresión génica.

P2: ¿Por qué son importantes las HDAC en la epigenética?

A2: Las HDAC pueden modificar la actividad genética sin alterar la secuencia de ADN. Al eliminar los grupos acetilo de las histonas, suelen compactar la cromatina y reducir el acceso a ciertos genes.

P3: ¿Son todos los HDAC iguales?

A3: No. Las HDAC se dividen en varias clases. Las clases I, II y IV utilizan principalmente un mecanismo catalítico dependiente del zinc. Las HDAC de clase III, conocidas como sirtuinas, dependen del NAD+.