شرح HDAC: كيف تتحكم إنزيمات هيستون ديأسيتيلاز في التعبير الجيني

تُغير الطفرة وظيفة الجين، وهذا أمر معروف لدى معظم الباحثين. مع ذلك، فإن تنظيم الجينات بواسطة الخلية أكثر تعقيدًا، إذ يمكن للخلية أن تزيد من نشاط الجينات، أو تقلله، أو حتى تكبحه تمامًا، كل ذلك دون أي تغيير في تسلسل الحمض النووي.

تُشارك إنزيمات نزع أسيتيل الهيستون، والتي تُعرف عادةً باسم HDACs، في هذه العملية التنظيمية. فهي تُغير حالة أسيتيل الهيستونات والعديد من البروتينات الأخرى. وقد يؤثر ذلك على تنظيم الكروماتين، والنسخ، ونمو الخلايا، والتمثيل الغذائي، والإشارات المناعية، والاستجابات للضغط النفسي.

ما هو إنزيم HDAC وماذا يفعل بالكروماتين؟

يؤدي أستلة الهيستون إلى إضعاف تماسك الحمض النووي

لا يذوب الحمض النووي في النواة كجزيئات حرة، بل يُعبأ على شكل كروماتين، وهو يتكون من الحمض النووي وبروتينات الهيستون. يمكن أستلة بقايا الليسين الموجودة على ذيول الهيستون بواسطة مجموعات الأسيتيل. كلما زاد عدد مجموعات الأسيتيل المضافة إلى ذيول الهيستون، ضعفت الشحنة الموجبة على هذه المناطق.

تصبح الرابطة بين الهستونات والحمض النووي ذي الشحنة السالبة أضعف، مما يزيد من فرص وصول عوامل النسخ وإنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي إلى الجين.

تجدر الإشارة إلى أن أستلة الهستونات لا تُفعّل جميع الجينات المجاورة. إذ تُفعّل جينات إضافية بواسطة مُحفزاتها وعوامل النسخ الخاصة بها، وما إلى ذلك، في أنواع الخلايا المعنية. كما تسود بروتينات كروماتينية إضافية على الهستونات المؤستلة، مما يُتيح الوصول إلى مناطق مُحددة من الكروماتين. وهذا يُسهّل وصول آلية النسخ، ولكنه لا يُحدد النتيجة النهائية بمفرده.

تقوم مثبطات الهيستون ديأسيتيلاز (HDACs) بإزالة مجموعات الأسيتيل

تعمل إنزيمات HDAC على عكس هذا التغيير، حيث تزيل مجموعات الأسيتيل من بقايا الليسين في الهيستونات. وبمجرد إزالة مجموعة الأسيتيل، تعود بقايا الليسين لتحمل شحنة موجبة أقوى. وبذلك، تستطيع الهيستونات الارتباط بالحمض النووي بشكل أكثر إحكامًا، وقد يصبح الوصول إلى الكروماتين أكثر صعوبة.

لهذا السبب غالباً ما ترتبط مثبطات الهيستون ديأسيتيلاز (HDACs) بانخفاض نسخ الجينات. وتصفها بعض المقالات بأنها إنزيمات إسكات الجينات. هذا الوصف ليس خاطئاً تماماً، ولكنه مبسط للغاية.

يعمل إنزيم HDAC عادةً مع بروتينات أخرى. ويعتمد تأثيره على المركب الذي يرتبط به وعلى الخلية التي ينشط فيها هذا المركب. قد يُعطي نفس المُثبِّط نتيجةً في سلالة خلايا ورمية ونتيجةً مختلفةً في خلية مناعية أولية. لذا، لا يكفي النظر إلى اسم المركب فقط.

ليست الهيستونات هي الأهداف الوحيدة

تؤثر مثبطات الهيستون ديأسيتيلاز (HDACs) أيضًا على البروتينات غير الهيستونية، بما في ذلك عوامل النسخ، وبروتينات الهيكل الخلوي، والبروتينات المرافقة الجزيئية، والبروتينات المشاركة في إصلاح الحمض النووي. وقد يؤدي إزالة مجموعة أسيتيل إلى تغيير استقرار البروتين، أو موقعه، أو البروتينات التي يرتبط بها، أو نشاطه.

يُعدّ HDAC6 مثالاً جيداً. يرتبط جزء كبير من عمله بالبروتينات السيتوبلازمية مثل ألفا-توبولين. كما أنه يشارك في نقل البروتينات ومراقبة جودتها.

قد لا يستفيد الباحث الذي يدرس HDAC6 إلا قليلاً من قياس أستلة الهيستون وحده. قد تكون قياسات أخرى أكثر فائدة، مثل أستلة ألفا-توبولين، وتجمع البروتينات، وحركة الخلايا، أو مؤشرات المسارات ذات الصلة. (Solarbio) كتالوج منتجات البحث يشمل ذلك المركبات والأجسام المضادة والمجموعات والكواشف الداعمة لهذه العمليات المدمجة.

كيف تختلف عائلات HDAC الرئيسية؟

ترتبط مثبطات الهيستون ديأسيتيلاز من الفئة الأولى ارتباطًا وثيقًا بعملية النسخ

ينتمي كل من HDAC1 و2 و3 و8 إلى الفئة الأولى من مثبطات الهيستون ديأسيتيلاز (HDACs). وتوجد هذه الإنزيمات بشكل أساسي في النواة، وقد دُرست جيداً من حيث دورها في عملية النسخ، وكذلك في تنظيم دورة الخلية، والتكاثر، والتمايز، والاستماتة الخلوية.

غالباً ما يتواجد كل من HDAC1 وHDAC2 داخل مركبات مثبطة كبيرة. كما يتطلب HDAC3 وجود بروتينات مساعدة ليكون نشطاً تماماً. فهو لا يتجول في النواة بشكل عشوائي لإزالة مجموعات الأسيتيل.

يُعدّ هذا الأمر بالغ الأهمية عند قراءة نتائج مثبطات الهيستون. إذ يُمكن لمثبطات الفئة الأولى أن تُعدّل التعبير عن عدد كبير من الجينات. وقد تُؤدي إلى دخول الخلايا في مرحلة نمو بطيء لأسبابٍ مثل توقف دورة الخلية، أو موت الخلايا المبرمج، أو الإجهاد، وقد تعود هذه المرحلة إلى أسبابٍ متعددة. لذا، يتطلب الأمر دراسة تأثير مُؤَسْتِل الهيستون على أستلة الهيستون والتعبير عن الجينات المستهدفة بمزيدٍ من التفصيل للوصول إلى استنتاجٍ قاطع.

يعمل الفصلان الثاني والرابع بشكل مختلف

تُعدّ مثبطات الهيستون ديأسيتيلاز من الفئة IIa مجموعة فرعية من مثبطات الهيستون ديأسيتيلاز من الفئة II، وتتألف من HDAC4 وHDAC5 وHDAC7 وHDAC9. تتواجد هذه البروتينات في النواة أو السيتوبلازم، وتتميز بقدرتها العالية على الحركة والتنقل بين هذين الحيزين، لا سيما استجابةً لإشارات الخلية. تُعتبر هذه الإنزيمات وحدات تحفيزية ضعيفة نسبيًا، لكنها تُشكّل مُركّبات بروتينية مُستقرة مُتعددة مع بروتينات أخرى.

تُعدّ إنزيمات HDAC6 وHDAC10 من الفئة الثانية ب. ويُعرف الكثير عن HDAC6 لكونه العضو الوحيد في عائلة إنزيمات HDAC الذي يمتلك نطاقين تحفيزيين. كما يُعرف بارتباطه ببروتين ألفا-توبولين في الأنيبيبات الدقيقة، وبمختلف مراحل نقل البروتين واستتبابه.

يُصنَّف HDAC11 ضمن الفئة الرابعة فقط، ولا يزال قيد الدراسة في مجال تنظيم المناعة والتمثيل الغذائي. عندما يركز مشروع ما على فئة واحدة من HDAC بدلاً من نشاط ديأسيتيلاز العام، فمن المفيد التحقق من العوامل ذات الصلة. مسارات الإشارات قبل اختيار المثبط والعلامات اللاحقة.

تستخدم السيرتوينات NAD+ بدلاً من الزنك

تُعرف السيرتوينات من SIRT1 إلى SIRT7 مجتمعةً باسم مثبطات الهيستون ديأسيتيلاز من الفئة الثالثة. وهي إنزيمات نازعة للأسيتيل تختلف عن مثبطات الهيستون ديأسيتيلاز الأخرى في آلية عملها وفي كيمياء تفاعلها. يُشار إلى معظم مثبطات الهيستون ديأسيتيلاز الأخرى بأنها "معتمدة على الزنك" لأن موقعها النشط يحتوي على أيون الزنك الذي يشارك مباشرةً في عملية إزالة مجموعة الأسيتيل من الركيزة. أما السيرتوينات فتستخدم NAD+ بدلاً من ذلك.

يُدخل هذا الارتباط مع NAD+ السيرتوينات في دراسات حول حالة المغذيات، واستقلاب الجلوكوز والدهون، والإجهاد التأكسدي، والميتوكوندريا، والشيخوخة. كما يختلف موقعها؛ فبعضها يعمل بشكل رئيسي في النواة، بينما يرتبط البعض الآخر ارتباطًا وثيقًا بالسيتوبلازم أو الميتوكوندريا.

لا ينبغي أن تُجرى تجربة SIRT1 كنسخة طبق الأصل من تجربة SIRT3. فالركائز مختلفة، والموقع مختلف، وكذلك النتائج. بالنسبة لـ SIRT3، قد يكون من المفيد استخدام علامات أستلة الميتوكوندريا والتنفس. أما بالنسبة لـ SIRT1، فقد تستحق الأهداف النووية والإشارات الأيضية مزيدًا من الاهتمام.

كيف يؤثر التحفيز بواسطة HDAC على اختيار المثبط؟

تشترك مثبطات الهيستون ديأسيتيلاز المعتمدة على الزنك في تفاعل أساسي

تستخدم إنزيمات HDAC من الفئات الأولى والثانية والرابعة الزنك بشكل أساسي في موقعها التحفيزي. يدخل الليسين المؤستل إلى الموقع النشط، حيث يساعد الزنك في تحديد موضع مجموعة الأسيتيل وجزيء الماء. تقوم الأحماض الأمينية في الإنزيم بتنشيط الماء، الذي بدوره يهاجم مجموعة الأسيتيل.

يتم إطلاق الأسيتات، ويعود الليسين إلى حالته منزوعة الأسيتيل.

صُممت العديد من مثبطات إنزيمات هيستون ديأسيتيلاز (HDAC) حول هذا الجيب. يتفاعل جزء من الجزيء مع منطقة الزنك، بينما تساعد أجزاء أخرى المركب على دخول القناة وتؤثر على مدى ملاءمته لأنواع إنزيمات هيستون ديأسيتيلاز المختلفة.

قد يحمل مركبان اسم "مثبط HDAC"، لكنهما يتصرفان بشكل مختلف تمامًا داخل الخلايا. فقوة ارتباطهما، وتغطية الأنواع الفرعية، وذوبانهما، ونفاذيتهما للخلايا، كلها عوامل تؤثر على النتيجة.

تتبع السيرتوينات مسارًا كيميائيًا آخر

لا تستخدم السيرتوينات نفس التفاعل الذي يتمحور حول الزنك. فهي تستهلك NAD+ أثناء عملية إزالة الأسيتيل. ببساطة، يشارك NAD+ في التفاعلات التحفيزية ويخضع للتحلل. في الوقت نفسه، ينقل مجموعات الأسيتيل من الهستونات إلى جزيئاته الخاصة، مما يؤدي في النهاية إلى إزالة مجموعات الأسيتيل. تنتج هذه العملية النيكوتيناميد ومنتجًا مرتبطًا بـ ADP-ريبوز.

يُستخدم النيكوتيناميد غالبًا في الدراسات التي يسعى فيها الباحثون إلى تقليل نشاط السيرتوين. كما يظهر الريسفيراترول في الأبحاث المتعلقة بإشارات السيرتوين وعمليات الأيض. ولا ينبغي اعتبار أيٍّ من المركبين مفتاحًا مثاليًا لاستهداف هدف واحد.

غالباً ما تصل المركبات الخلوية إلى أكثر من بروتين واحد. كما أن الجرعة مهمة أيضاً. قد يؤدي التركيز المنخفض إلى استجابة مركزة إلى حد ما، بينما يؤدي التركيز العالي إلى إجهاد غير ذي صلة أو آثار جانبية غير مرغوب فيها.

النهج الأكثر أمانًا هو إقران المركب بعلامة هدف مباشرة أو استجابة لاحقة معروفة.

الانتقائية يعتمد على على ظروف العمل

يُستخدم فورينوستات عادةً كمثبط واسع النطاق لإنزيمات هيستون ديأسيتيلاز (HDAC). ويظهر ريكولينوستات في العديد من الدراسات التي تركز على HDAC6. ويرتبط TMP195 غالبًا بأبحاث إنزيمات هيستون ديأسيتيلاز من الفئة الثانية أ.

تُعدّ هذه الأوصاف مفيدة عند فحص المنتجات، لكنها لا تُغني عن الحاجة إلى التحقق من صحتها. فالمركب الذي يبدو انتقائيًا في التحليل الكيميائي الحيوي قد يصبح أقل انتقائية عند زيادة الجرعة الخلوية.

يُعدّ مستوى المذيب مشكلة شائعة أخرى. تُحضّر العديد من مثبطات إنزيمات هيستون ديأسيتيلاز (HDAC) في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). عند إضافة كمية زائدة من المحلول المركز، قد يؤثر تركيز DMSO النهائي على سلوك الغشاء، أو عملية الأيض، أو بقاء الخلية. يجب أن يحتوي محلول التحكم على نفس كمية المذيب الموجودة في كل مجموعة معالجة.

قبل تحضير اللوحة الأولى، يجب أن يكون نطاق التركيز ووقت المعالجة ومستوى المركبة وعلامة الآلية واضحًا بالفعل.

لماذا يتم دراسة مثبطات الهيستون ديأسيتيلاز (HDACs) في علم الأحياء الخلوي المرضي والطبيعي؟

يعتمد نمو الخلايا على نشاط الجينات المتحكم فيه

إنزيمات HDAC هي إنزيمات طبيعية. تحتاجها الخلايا السليمة. فهي تساعد في تنظيم وقت نشاط الجينات المشاركة في النمو والتمايز والاستماتة الخلوية.

أثناء النمو، تتبع الأنسجة المختلفة برامج جينية مختلفة. فخلايا الكبد، والخلايا العصبية، والخلايا العضلية، والخلايا المناعية لا تستخدم نفس الجينات في الوقت نفسه. وتساعد أفراد عائلة HDAC في الحفاظ على هذه الأنماط.

تبدأ المشاكل عندما يختل التوازن. في بعض الخلايا السرطانية، قد يؤدي ارتفاع نشاط إنزيمات HDAC أو وجودها في غير موضعها إلى تثبيط جينات التحكم في النمو. وقد يساعد استخدام مثبط لها في إعادة تنشيط هذه الجينات. كما قد يؤثر هذا المثبط على العديد من الجينات الأخرى، ولذلك لا يمكن تفسير الآلية وحدها بانخفاض حيوية الخلية.

تتواجد السيرتوينات بالقرب من التغيرات الأيضية

تُدرس السيرتوينات عادةً عندما يبحث الباحثون في عمليات الأيض أو الميتوكوندريا. واعتمادها على NAD+ يعني أن نشاطها يمكن أن يتغير بتغير حالة الطاقة والاختزال في الخلية.

يرتبط SIRT1 بشكل متكرر بالإشارات النووية والأيضية. أما SIRT3، فيتم فحصه غالبًا من خلال أستلة بروتينات الميتوكوندريا. وللسيرتوينات الأخرى مواقعها ووظائفها الخاصة.

إنّ الادعاءات العامة مثل "هذا المركب يُحسّن الشيخوخة" ليست مفيدةً جدًا في المختبر. من الأفضل التساؤل عمّا تغيّر. هل كان ذلك إنتاج الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)، أم جهد غشاء الميتوكوندريا، أم أنواع الأكسجين التفاعلية، أم التنفس الخلوي، أم بروتين الاستجابة للضغط؟ بمجرد تحديد النتيجة النهائية، يصبح تكرار التجربة أسهل.

تتضمن الاستجابات المناعية أيضًا نشاط إنزيمات HDAC

تشارك مثبطات الهيستون ديأسيتيلاز (HDACs) في تنشيط الخلايا التائية، وسلوك البلاعم، وإنتاج السيتوكينات، والإشارات الالتهابية. وقد يؤدي كل من النشاط المفرط والنشاط غير الكافي إلى اختلال التوازن.

قد يُقلل نفس المُثبِّط من مؤشرات الالتهاب في نموذجٍ ما، بينما يُضر ببقاء الخلايا في نموذجٍ آخر. وتُعد الخلايا الأولية حساسةً بشكلٍ خاص لاختلافات المتبرعين، وطرق العزل، وحالة التنشيط.

بالنسبة للمشاريع التي تجمع بين المركبات أو الأجسام المضادة أو فحوصات السيتوكينات أو أنواع متعددة من العينات، فإن Solarbio الخدمات الفنية يمكن أن يساعد ذلك في اختيار الاختبارات وتخطيط سير العمل. والهدف ليس إضافة المزيد من الاختبارات لمجرد الإضافة، بل يجب أن يجيب كل اختبار على جزء واضح من سؤال البحث.

كيف يمكنك إعداد تجربة HDAC أنظف؟

حدد الهدف قبل شراء المركب

إنّ عبارة "دراسة تثبيط HDAC" ليست سؤالاً تجريبياً دقيقاً، فهي فضفاضة للغاية. والسؤال الأنسب هو: هل يؤدي تثبيط HDAC6 إلى زيادة أستلة ألفا-توبولين قبل أن يؤثر على هجرة الخلايا؟

هذه الجملة تخبرك بالكثير بالفعل. أنت بحاجة إلى مركب مرتبط بـ HDAC6، وقراءة ألفا-توبولين المؤستل، ونقطتين زمنيتين على الأقل، واختبار الهجرة.

ينبغي أن يُظهر نموذج الخلية التعبير عن الهدف. تحقق من خط الأساس باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) أو لطخة ويسترن، إن أمكن. لا تُثبت النتيجة السلبية من نموذج يكاد يخلو من التعبير عن الهدف فشل المُثبِّط.

تحتاج الخلايا الأولية إلى مستوى آخر من العناية. فخلفية المتبرع، ورقم التمرير، وظروف العزل، وحالة التنشيط، كلها عوامل قد تؤثر على الاستجابة.

استخدم أكثر من شاشة عرض واحدة

يسهل قياس حيوية الخلايا، لكنها ليست دقيقة. قد ينتج انخفاض الإشارة عن موت الخلايا المبرمج، أو توقف دورة الخلية، أو تثبيط عمليات الأيض، أو تلف الغشاء، أو تداخل في التحليل.

ينبغي أن تتضمن تجربة HDAC مؤشرًا أقرب إلى الهدف. في دراسة من الفئة الأولى، قد يكون ذلك أسيتلة الهيستون وتعبير الجين المستهدف. بالنسبة لـ HDAC6، غالبًا ما يكون ألفا-توبولين المؤستل أكثر فائدة. أما بالنسبة للسيرتوينات، فقد تكون المؤشرات الميتوكوندرية أو المرتبطة بـ NAD+ أنسب.

للكشف العام عن الهيستونات، المضادات المضادة للهيستون H3.1 Monoclonal يمكن دعم إجراءات العمل الخاصة بتقنيات WB وIP وIF وIHC وELISA وفقًا للتطبيقات المذكورة. ولا يزال استخدام جسم مضاد متخصص بالتعديل ضروريًا عندما تركز التجربة على موقع أستلة معين.

احتفظ بـ أدوات تحكم بسيطة و مكتمل.

ابدأ بنطاق تركيز معقول بدلاً من جرعة عالية واحدة. حدد نقطة زمنية مبكرة للأستلة ونقطة زمنية لاحقة للتعبير الجيني أو سلوك الخلية.

ينبغي وجود كل من عينة التحكم غير المعالجة وعينة التحكم بالمركبة. وعند الإمكان، أضف عينة تحكم إيجابية معروفة. يمكن أن يساعد مثبط ثانٍ ذو بنية كيميائية مختلفة في توضيح ما إذا كانت النتيجة تتبع الهدف أم أنها ناتجة عن نشاط غير مستهدف لمركب واحد.

تُظهر البيانات الأكثر وضوحًا عادةً ترتيبًا معينًا. أولًا، يتغير مؤشر الأسيتلة. ثم يتغير المسار. ويظهر النمط الظاهري للخلية لاحقًا.

لا تزال تفاصيل المعالجة الصغيرة قادرة على إفساد هذه العملية. فدورات التجميد والذوبان المتكررة، أو ترتيب التخفيف الخاطئ، أو التعرض المطول لدرجة حرارة الغرفة، أو عدم انتظام كثافة الخلايا، كلها عوامل قد تُنتج نتيجة تبدو بيولوجية ظاهريًا، ولكنها في الواقع تقنية بحتة. مقالات تقنية وملاحظات تطبيقية يمكن التحقق من ذلك قبل التشغيل الأول لمعرفة تفاصيل التعامل مع المنتج والتحليل.

لأن مشروع HDAC نادرًا ما يقتصر على شراء مثبط واحد ثم قياس حيوية الخلية، فمن المرجح أنك ستحتاج أيضًا إلى أجسام مضادة أخرى، ومركبات أخرى معدلة للمسار، وسلسلة من الاختبارات لمراقبة التغيرات في موت الخلايا المبرمج، أو إطلاق السيتوكينات، أو في علامات الميتوكوندريا، على سبيل المثال لا الحصر، قبل أن تبدأ بياناتك في إخبارك بقصة متماسكة.

بيجين سولاربيو ساينس آند شركة التكنولوجيا المحدودة تُقدّم الشركة مواد بحثية لعلوم الحياة منذ عام 2004. ويشمل كتالوجها مركبات الجزيئات الصغيرة، والأجسام المضادة، ومجموعات اختبار ELISA، ومجموعات التحليل الكيميائي الحيوي، وكواشف بيولوجيا الخلية، والخدمات ذات الصلة. بالنسبة للباحثين الذين يُجهّزون أبحاثهم باستخدام عدة طرق تحليلية، فإنّ منتجات الشركة تُعدّ خيارًا مثاليًا. حلول أبحاث علوم الحياة قدّم نقطة انطلاق مفيدة.

استنتاج

إن مثبطات الهيستون ديأسيتيلاز ليست مجرد مجموعة بسيطة من إنزيمات إسكات الجينات. يعتمد عملها على فئة الإنزيم، والموقع الخلوي، وآلية التحفيز، والبروتينات الشريكة، والنموذج المستخدم في الدراسة.

تبدأ تجربة مثبطات الهيستون ديأسيتيلاز (HDAC) الناجحة بتحديد هدف واضح. ثم يُقارن المركب بقراءة جزيئية مباشرة، وضوابط مناسبة، ونتيجة وظيفية لاحقة. عندما تتبع هذه الأجزاء نفس المسار البيولوجي، تصبح البيانات أسهل في التفسير وأسهل بكثير في التكرار.

FAQ

س1: ما معنى HDAC؟

أ1: HDAC اختصار لـ Histone Deacetylase (إنزيم نازع أسيتيل الهيستون). تعمل هذه الإنزيمات على إزالة مجموعات الأسيتيل من الهيستونات والبروتينات الأخرى. قد يؤدي ذلك إلى تغيير بنية الكروماتين، وسلوك البروتين، والتعبير الجيني.

س2: لماذا تعتبر مثبطات الهيستون ديأسيتيلاز مهمة في علم التخلق؟

ج٢: تستطيع مثبطات الهيستون ديأسيتيلاز (HDACs) تغيير نشاط الجينات دون تغيير تسلسل الحمض النووي. فمن خلال إزالة مجموعات الأسيتيل من الهيستونات، غالباً ما تجعل الكروماتين أكثر كثافة وتقلل من الوصول إلى جينات معينة.

س3: هل جميع أنواع HDAC متشابهة؟

ج٣: لا. تُقسم مثبطات الهيستون ديأسيتيلاز (HDACs) إلى عدة فئات. تستخدم الفئات الأولى والثانية والرابعة بشكل أساسي آلية تحفيزية تعتمد على الزنك. أما مثبطات الهيستون ديأسيتيلاز من الفئة الثالثة، والمعروفة باسم السيرتوينات، فتعتمد على NAD+.