Поляризация макрофагов RAW264.7 M1: практическое руководство по 48-часовой индукции и валидации.

Клетки RAW264.7 часто используются в исследованиях макрофагов. Их применяют в исследованиях воспаления, в проектах по изучению иммунного ответа, в экспериментах по иммунологии опухолей и во многих базовых анализах макрофагов. Причина проста: эти клетки несложно выращивать, они довольно быстро размножаются, и их реакцию на воспалительную стимуляцию обычно легко наблюдать.

Вопросы, касающиеся корпоративной культуры, зачастую довольно просты. Однако вводному курсу для студентов первого курса требуется больше внимания.

Добавление индуктора не означает автоматически, что модель готова. Состояние клеток имеет значение. Плотность посева также важна. Время обработки может изменить результат, и то же самое относится к способу проверки клеток после индукции.

Для лабораторий, которые не хотят изготавливать каждый индукционный компонент с нуля, Набор для индукции поляризации макрофагов M1 RAW264.7 Предлагается фиксированная схема индукции. Протокол предусматривает 48-часовой период обработки. После этого клетки можно использовать для ИФА, ПЦР, проточной цитометрии, анализа совместного культивирования, исследований фагоцитоза или других экспериментов с макрофагами.

Почему клетки RAW264.7 часто используются для поляризации макрофагов M1?

RAW264.7 — это клеточная линия, имитирующая мышиные макрофаги. Она уже хорошо известна многим лабораториям, занимающимся изучением воспаления и функций макрофагов.

Первичные макрофаги имеют свое место, но они также вносят больше вариативности и требуют больше подготовительной работы. Клетки RAW264.7 легче размножать и проще использовать в повторных экспериментах. Это полезно, когда необходимо провести несколько групп экспериментов в одинаковых базовых условиях.

Стабильный рост упрощает планирование экспериментов.

Клетки RAW264.7 обычно растут без особых проблем при соблюдении стандартных условий культивирования. Здоровая культура в логарифмической фазе роста может обеспечить достаточное количество клеток для нескольких групп лечения за короткое время.

Это не означает, что состояние клеток можно игнорировать.

Клетки, которые слишком долго находились в слишком плотной среде, могут реагировать иначе, чем здоровая культура. Та же проблема может возникнуть с клетками, подвергшимися стрессу, или с культурами, с которыми не осуществлялось последовательное обращение. Если исходные клетки уже находятся в плохом состоянии, результат индукции может быть неудовлетворительным, независимо от того, насколько хорошо проведены последующие этапы.

Для работы, охватывающей культивирование макрофагов, воспалительную сигнализацию, тестирование цитокинов и соответствующие клеточные анализы, компания Solarbio также предоставляет Решения для исследований в области клеточной биологии и иммунологии.Это полезно, когда для эксперимента требуется более одной категории реагентов, и весь рабочий процесс необходимо спланировать совместно.

Поляризация М1 вызывает обнаруживаемые функциональные изменения.

После соответствующей индукции M1 клетки RAW264.7 не остаются точно такими же, какими они были в обычной культуре.

Их форма меняется. Некоторые поверхностные маркеры также изменяются. Количество воспалительных цитокинов, выделяемых в культуральную среду, также может увеличиваться.

Эти изменения предоставляют несколько способов проверить, сработала ли модель.

Наблюдение под микроскопом — самый быстрый способ, но не единственный. Клетка может менять форму из-за плотности, стресса или манипуляций. Именно поэтому проточная цитометрия и определение цитокинов полезны в одном эксперименте.

Как можно добиться фенотипа M1 у клеток RAW264.7?

Фиксированная процедура индукции упрощает проведение повторных экспериментов. Она также экономит время, обычно затрачиваемое на настройку отдельных компонентов по одному.

Начните со здоровых клеток правильной плотности.

Начните с клеток RAW264.7 в логарифмической фазе роста. Для индукционной подготовки можно использовать культуру с плотностью около 80–90%.

Соберите клетки, подсчитайте их и ресуспендируйте в предварительно подогретой среде для индукции поляризации M1. Можно использовать начальную плотность около 2 × 10^5 клеток/мл.

Для шестилуночного планшета практичным объемом является 2 мл на лунку. Для двенадцатилуночного планшета можно использовать 1 мл на лунку.

Плотность посева клеток следует тщательно проверять, особенно при первом запуске модели. Клетки, посеянные слишком редко, могут оставаться слишком редкими и через 48 часов. Клетки, посеянные слишком густо, могут стать скученными до завершения индукции.

В этом случае полезен контрольный образец без обработки. Он дает прямую точку отсчета как для плотности, так и для морфологии клеток.

Сохраняйте неизменными условия индукции в течение 48 часов.

Компоненты индукционной культуры из набора используются в конечной концентрации 1X в рекомендуемой системе культивирования RAW264.7.

После посева клетки помещают в условия 37°C с 5% CO2 и культивируют в течение 48 часов.

Желательно сохранять микроскопические снимки как через 24, так и через 48 часов. Это просто, но полезно. Если конечный результат выглядит необычно, эти снимки могут показать, когда клетки начали меняться.

Через 48 часов индукция завершается. Затем клетки можно собрать для проточной цитометрии, ПЦР или других клеточных анализов. Надосадочную жидкость можно сохранить для измерения уровня цитокинов.

Для лабораторий, использующих цитокины в качестве части окончательного результата анализа, это Руководство по определению цитокинов с помощью наборов ELISA может помочь с обработкой образцов и планированием анализа.

Как подтвердить, что клетки RAW264.7 достигли состояния, подобного M1?

В том, чтобы полагаться только на один результат, нет реальной выгоды.

Если изменяется морфология, повышается уровень CD86 и увеличиваются провоспалительные цитокины, оценить модель становится гораздо проще. Если изменяется только один из этих показателей, стоит повторно проверить условия культивирования и индукции.

Сначала проверьте морфологические изменения.

Необработанные клетки RAW264.7 в обычных условиях культивирования часто имеют довольно округлую форму.

После индукции М1 клетки могут стать более неправильной формы. Могут появиться многоугольные и амебовидные клетки. Филоподии и ламеллиподии могут стать более заметными, а цитоплазма может выглядеть более зернистой.

Эти изменения легко зафиксировать с помощью обычной микроскопии.

Тем не менее, морфология — это лишь первая проверка. Клетка, находящаяся в состоянии стресса, также может выглядеть иначе. То же самое относится и к перенаселенной культуре. Рассматривайте изображение как часть результата, а не как весь результат целиком.

Используйте проточную цитометрию для проверки фенотипа M1.

Проточная цитометрия позволяет более непосредственно изучить фенотип клеток.

Один из эффективных подходов заключается в использовании F4/80 и CD11b для определения популяции макрофагов, а затем в проверке экспрессии CD86 внутри этой популяции.

После успешной 48-часовой индукции экспрессия CD86 должна увеличиться по сравнению с необработанным контролем.

Это помогает отличить истинную поляризационную реакцию от простого изменения формы клетки.

Лаборатории, которые все еще работают над стандартными методами контроля качества клеточных культур, также могут обнаружить Клеточные линии: первый шаг к надежным исследованиям in vitro. Полезно. Идентичность клеток и основные условия культивирования могут повлиять на все последующие этапы.

Измерение высвобождения провоспалительных цитокинов

Секреция цитокинов добавляет еще один элемент к общей картине.

В экспериментах с RAW264.7 M1 обычно проверяют уровни IL-1β, IL-6 и TNF-α. После индукции культуральную надосадочную жидкость можно собрать и протестировать с помощью мышиных ИФА-наборов.

Компания Solarbio предлагает наборы для ИФА SEKM-0002 Mouse IL-1β, SEKM-0007 Mouse IL-6 и SEKM-0034 Mouse TNF-α. Линейка продуктов Solarbio ELISA Kit.

Если модель М1 была создана должным образом, то уровни этих воспалительных цитокинов должны повыситься по сравнению с группой, не получавшей лечения.

Точный уровень может варьироваться в зависимости от состояния клеток и экспериментальной установки. Поэтому контрольную группу следует готовить и собирать таким же образом, как и группу индукции.

Какие продукты можно комбинировать для создания полноценного рабочего процесса RAW264.7 M1?

Индукционный реагент — это лишь одна часть работы.

Эксперимент с RAW264.7 M1 начинается с самих клеток, затем следует стандартное культивирование, индукция и, наконец, подтверждение фенотипа. Если рассматривать эти этапы как отдельные задачи, устранение неполадок становится сложнее.

Культивирование клеток и индукция М1

Клетки SCC211800 RAW264.7 можно использовать совместно со специфической для клеток культуральной средой C211800 RAW264.7.

Набор для индукции поляризации макрофагов M1 CA4980 RAW264.7 включает этап индукции. Индуктор поляризации макрофагов M1 CA4981 RAW264.7 доступен, если индукционный реагент необходим отдельно.

Использование фиксированной клеточной культуры и индукционной установки также упрощает сравнение результатов повторных экспериментов. Когда слишком много основных материалов меняется между партиями, становится трудно определить, обусловлены ли различия в результатах биологическими процессами или просто особенностями экспериментальной установки.

Валидация ИФА и проточной цитометрии

Для тестирования цитокинов используются тест-системы SEKM-0002, SEKM-0007 и SEKM-0034, охватывающие мышиные IL-1β, IL-6 и TNF-α.

Для проточной цитометрии, если в исследование входит идентификация фенотипа, можно добавить набор для проточной цитометрии SFCMZ-008 RAW 264.7 Cell M1 Macrophage Polarization Induction and Identification Flow Cytometry Kit.

Исследователи, работающие над сигнальной стороной модели, также могут ознакомиться с ней. пути Solarbio искать связанные с ними мишени, соединения и исследовательские инструменты.

Последовательное выполнение этих шагов немного упрощает поиск и устранение неисправностей. Если морфология выглядит нормальной, но результат анализа цитокинов — нет, проблему можно проверить со стороны валидации. Если клетки уже выглядят плохо до индукции, нет особых оснований винить результат ELISA позже.

На что следует обратить внимание перед проведением эксперимента?

Набор может упростить процедуру индукции. Он не может восстановить нездоровые клетки.

Перед началом культивирования проверьте культуру RAW264.7. Если клетки уже перенаселены, испытывают стресс или растут неравномерно, обычно лучше начать заново с более здоровой культуры.

Используйте контрольный образец без обработки. Плотность посева должна быть одинаковой от партии к партии. Делайте снимки под микроскопом в фиксированные моменты времени, а не только тогда, когда что-то выглядит необычно.

При исследовании цитокинов надосадочную жидкость следует собирать в один и тот же момент времени для каждой группы. Небольшие различия во времени могут внести дополнительные вариации.

Для проточной цитометрии также необходим фиксированный подход к гейтированию. Изменение гейта после анализа результата может привести к тому, что две группы будут выглядеть более разными, чем они есть на самом деле.

Полезно определиться с показателями до начала индукции. Если CD86, IL-1β, IL-6 и TNF-α уже включены в план, то сбор клеток и супернатанта можно организовать надлежащим образом с самого начала.

Для проектов, которым требуется дополнительная поддержка в выборе продукции, антител, белков или других исследовательских услуг, Технические услуги Solarbio Может использоваться в рамках стандартного рабочего процесса с продуктом.

Вывод

Клетки RAW264.7 являются практичным выбором для исследований поляризации макрофагов M1. Они легко культивируются, реагируют на воспалительную стимуляцию и могут быть исследованы с помощью методов, уже используемых в большинстве лабораторий клеточной биологии.

Сам 48-часовой процесс индукции несложен. Именно детали, связанные с ним, обычно определяют, будет ли результат чистым.

Начните со здоровых клеток. Поддерживайте постоянную плотность. Проведите контрольный эксперимент без обработки. Сохраните изображения через 24 и 48 часов.

Затем проверьте более одной конечной точки.

Морфология дает первую подсказку. F4/80, CD11b и CD86 дают результаты проточной цитометрии. IL-1β, IL-6 и TNF-α добавляют данные о цитокинах.

Когда эти результаты указывают в одном направлении, модель RAW264.7 M1 становится гораздо проще использовать в последующих экспериментах по изучению воспаления, иммунного ответа и функции макрофагов.

Для получения помощи в подборе культуральных продуктов, реагентов для индукции, наборов ELISA или инструментов для проточной цитометрии в соответствии с запланированным экспериментом исследователи могут обратиться к нам. связаться с Solarbio прежде чем собрать весь рабочий процесс воедино.

Часто задаваемые вопросы

В1: Сколько времени занимает поляризация макрофагов RAW264.7 M1?

A1: В схеме лечения с использованием CA4980 используется 48-часовой индукционный период. Целесообразно сохранять микроскопические изображения через 24 и 48 часов, чтобы можно было сравнивать изменения в клетках в процессе лечения.

В2: Какую плотность клеток можно использовать перед индукцией M1?

A2: В качестве рабочей начальной плотности можно использовать примерно 2 × 10^5 клеток/мл после сбора и подсчета здоровых клеток RAW264.7 в логарифмической фазе роста. Конечную плотность следует дополнительно проверить с учетом формата чашки Петри и условий культивирования клеток.

В3: Может ли морфология клетки сама по себе подтвердить поляризацию M1?

A3: Нет. Морфологическое исследование полезно для быстрой проверки, но само по себе его недостаточно. Маркеры проточной цитометрии и измерения воспалительных цитокинов дают более убедительные доказательства для окончательного результата.

В4: Какие маркеры для проточной цитометрии можно использовать для поляризации RAW264.7 M1?

A4: F4/80 и CD11b можно использовать для идентификации популяции макрофагов. Затем можно проверить CD86 как маркер, ассоциированный с M1. Повышение уровня CD86 после индукции подтверждает результат поляризации M1.

В5: Какие цитокины можно измерить после индукции RAW264.7 M1?

A5: Наиболее распространенные варианты — IL-1β, IL-6 и TNF-α. Супернатант культуры, собранный после индукции, можно исследовать с помощью наборов ELISA для мышей.

В6: Какие последующие эксперименты можно провести после индукции М1?

A6: Индуцированные клетки RAW264.7 можно использовать для ИФА, ПЦР, проточной цитометрии, исследований совместного культивирования, анализа фагоцитоза и других экспериментов, связанных с воспалением макрофагов и иммунной функцией.