Как выбрать правильную среду для заморозки клеток для лучшего их восстановления

Сохранение клеток в фиксированном состоянии кажется довольно тривиальной лабораторной задачей. Однако очень неприятно, когда ценная культура не восстанавливается после длительного хранения. Сначала размороженные клетки выглядят нормально в среде, которая размораживалась вместе с ними. Позже они начинают медленно прикрепляться ко дну чашки Петри, делиться, но неравномерно, или не делиться вовсе. Большинство людей винят в этом баллон с жидким азотом или способ размораживания клеток. Но часто причина всех проблем кроется гораздо глубже.

Состояние клеток до замораживания, криозащитная система, воздействие ДМСО, плотность замораживания и сама среда замораживания — все это влияет на то, что происходит после размораживания.

Именно поэтому среду для заморозки клеток не следует рассматривать как нечто второстепенное. Хорошая рецептура должна защищать клетки во время охлаждения, не создавая при этом дополнительного источника стресса. Компания Solarbio поставляет реагенты для клеточной биологии и сопутствующие продукты для культивирования клеток через свою широкую сеть. Ассортимент продукции Solarbioвключая различные составы для криоконсервации обычных клеточных линий, чувствительных клеток, иммунных клеток, стволовых клеток и других исследовательских моделей.

Почему среда для заморозки клеток так важна?

Повреждение от замерзания начинается еще до того, как клетки достигнут жидкого азота.

Клетки повреждаются не просто от охлаждения. Серьезной проблемой является образование льда.

Внутри клеток и в межклеточном пространстве могут образовываться кристаллы. Они могут нанести серьезный вред мембранам и внутренним структурам клеток. При охлаждении клетки подвергаются осмотическому стрессу. Вода перемещается внутрь и наружу клеток. Окружающий внеклеточный раствор становится все более концентрированным.

Криоконсервационная среда предназначена для снижения этих стрессовых факторов. Она повышает шансы клеток на выживание как при замораживании, так и при оттаивании.

Исследователи, желающие получить более полное представление о процессе замораживания, также могут ознакомиться с дополнительной информацией. Руководство по криоконсервации клеток: как заморозить клетки и сохранить резервную культуру в целости., которая охватывает состояние клеток, плотность заморозки, охлаждение, хранение и восстановление после размораживания.

ДМСО полезен, но требует осторожного обращения.

ДМСО является одним из наиболее распространенных криопротекторов в клеточных культурах. Solarbio DMSO (диметилсульфоксид) (для клеточных культур) ДМСО широко используется в клеточных культурах и может проникать в клетки, уменьшая образование вредного льда во время охлаждения. Именно поэтому многие классические формулы для заморозки содержат ДМСО.

Полезные и проблемные аспекты сочетаются друг с другом. ДМСО может защищать клетки при низких температурах, но длительное воздействие при комнатной температуре может снизить жизнеспособность клеток. После смешивания среды для замораживания, содержащей ДМСО, с клеточной суспензией, манипуляции с ней не должны затягиваться без необходимости.

Если вы предпочитаете готовый к применению, стандартный состав, Среда для криоконсервации Solarbio может использоваться в качестве компонента типичной процедуры создания банка клеток млекопитающих.

Какой тип среды для заморозки лучше выбрать: содержащую сыворотку или бессывороточную?

Формулы, содержащие сыворотку, хорошо известны, но недостаточно четко определены.

Среда для замораживания, содержащая сыворотку, по-прежнему широко используется. Хорошо известная комбинация сыворотки и ДМСО работает со многими известными линиями клеток млекопитающих и используется в лабораториях уже много лет.

Главным недостатком этой системы является изменчивость от партии к партии.

Сыворотка содержит белки, гормоны, факторы роста, липиды и многие другие биологические компоненты. Их содержание может различаться в зависимости от источника и партии. Клеточная линия, хорошо восстанавливающаяся после обработки одной партии, может вести себя иначе после перехода лаборатории на другую.

Существуют также проекты, где использование компонентов животного происхождения просто нежелательно. Исследования стволовых клеток, работа, связанная с клеточной терапией, исследования чувствительных иммунных клеток и более контролируемые системы культивирования часто выигрывают от более точно определенных условий заморозки.

Использование бессывороточных носителей упрощает управление системой.

Использование бессывороточной среды для заморозки исключает влияние сыворотки на вариативность процесса. Это упрощает стандартизацию протокола создания банка клеток для разных партий и операторов.

Это также экономит время. Нет необходимости каждый раз готовить смесь сыворотки и ДМСО при замораживании клеток. Готовая к использованию среда позволяет уменьшить количество мелких ошибок при приготовлении, которые легко допустить в напряженный день культивирования.

Для исследователей, которые хотят сохранить ДМСО в составе, удалив при этом сыворотку, Бессывороточная среда для заморозки клеток (с феноловым красным) Предоставляет определенный вариант с видимым индикатором pH.

Подобный состав подходит для рутинного культивирования клеток, где вариабельность концентрации сыворотки вызывает опасения, но криозащита с использованием ДМСО остается приемлемой.

Имеет ли значение феноловый красный в среде для криоконсервации?

Феноловый красный может быть полезен для рутинных работ.

Феноловый красный знаком всем, кто работает с питательными средами для клеточных культур. Он позволяет быстро визуально оценить изменения в среде.

Для выполнения основных работ по заморозке и восстановлению это может быть удобно. Это не заменяет надлежащий контроль pH, но дает оператору мгновенную визуальную индикацию во время обычных манипуляций.

Выбор меняется, когда последующее обнаружение чувствительно к цвету фона.

Формулы, не содержащие фенол-красный, лучше подходят для некоторых методов обнаружения.

Если полученные клетки будут использоваться для флуоресцентной визуализации, цветовых измерений или другого анализа, где важны фоновые помехи, предпочтительнее может быть система без фенол-красного.

Соларбио Бессывороточная криоконсервация клеток (без фенолового красного) Данная система разработана для решения подобных задач, при этом в ней не используется сыворотка.

Важно не выбирать между феноловым красным и его отсутствием только потому, что это звучит более сложно. Необходимо учитывать особенности работы, которая будет проводиться после размораживания. Для стандартного эксперимента по размножению клеток и чувствительного оптического анализа не всегда требуется одинаковая рецептура.

В каких случаях криоконсервация клеток без ДМСО имеет смысл?

Для некоторых типов клеток и рабочих процессов требуется другая криозащитная система.

ДМСО широко используется, но это не означает, что его следует автоматически применять в каждой модели клеток.

Некоторые чувствительные клетки плохо восстанавливаются после воздействия ДМСО. В других проектах исследователи стремятся уменьшить количество остаточного ДМСО, попадающего в культуру. Это может иметь значение в работе со стволовыми клетками, в применении к иммунным клеткам или в исследованиях, где функция клеток после размораживания важнее, чем просто подсчет выживших клеток.

В среде без ДМСО используется другой защитный состав вместо стандартной системы с ДМСО. Окончательный выбор все же необходимо протестировать на конкретном типе клеток, поскольку «без ДМСО» не означает автоматически «лучше для всех клеток».

Для рабочих процессов с использованием стволовых клеток, где отказ от ДМСО является действительно необходимым условием, Среда для криоконсервации стволовых клеток (без ДМСО) Это один из вариантов, который можно оценить с помощью небольшого теста на восстановление клеток, прежде чем создавать более крупные банки клеток.

Чувствительные клетки следует оценивать по качеству восстановления, а не по какому-либо одному показателю.

Оценка жизнеспособности после размораживания полезна, но это еще не все.

Клеточная популяция может демонстрировать высокую жизнеспособность сразу после размораживания, но при этом плохо расти в течение следующих двух дней. Стволовые клетки могут выжить, но потерять характеристики, необходимые для дальнейшей дифференциации. Иммунные клетки могут оставаться живыми, демонстрируя при этом более слабые функциональные реакции.

Поэтому восстановление следует проверять по морфологии клеток, их поведению при прикреплении или подвешивании, пролиферации, а также по основному функциональному маркеру, используемому в проекте.

Идентичность клеток и история их пассажей также имеют значение. Ранее опубликованные данные Клеточные линии: первый шаг к надежным исследованиям in vitro. В статье объясняется, почему ранние посевные материалы, контроль пассажей, идентичность клеток и наличие микоплазмы тесно связаны с возможностью воспроизведения результатов исследований in vitro.

Как выбрать среду для заморозки для разных типов клеток?

Стандартные клеточные линии обычно должны быть простыми и воспроизводимыми.

Для наиболее часто используемых клеточных линий, таких как A549, CHO, Jurkat и многих других, которые часто применяются в исследованиях, основным требованием является восстановление клеток и простота процесса заморозки.

Использование готовой к применению среды может быть целесообразным, когда многие операторы используют один и тот же банк клеток. Все следуют одной и той же формуле, поэтому результат в меньшей степени зависит от того, кто именно приготовил раствор для заморозки в тот или иной день.

Исходное состояние клеток по-прежнему имеет значение. Здоровые клетки в логарифмической фазе роста обычно лучше переносят заморозку, чем переросшие, загрязненные или сильно подверженные стрессу культуры. Хорошая питательная среда не может восстановить плохое исходное состояние культуры.

Стволовые клетки и иммунные клетки нуждаются в большем внимании.

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC), другие стволовые клетки, периферические мононуклеарные клетки крови (PBMC), NK-клетки, αβ-Т-клетки, γδ-Т-клетки и связанные с ними модели иммунных клеток часто менее снисходительны.

Вопрос не только в том, выживут ли клетки. Исследователям может потребоваться сохранить стволовые свойства, потенциал дифференцировки, поверхностные маркеры, реакцию на цитокины, способность к размножению или другие функциональные характеристики.

Именно здесь на помощь приходят среды для криоконсервации, специфичные для конкретных клеток или областей применения. Компания Solarbio предлагает различные составы, охватывающие стандартные, бессывороточные, содержащие ДМСО, не содержащие ДМСО, а также специализированные потребности в криоконсервации клеток.

Когда модель необычна или может подойти несколько вариантов, небольшое сравнение обходится дешевле, чем обнаружение проблемы после того, как большой банк клеток уже заморожен. Исследователи могут использовать Техническое обслуживание Solarbio для выбора продукции и оказания технической поддержки при подборе системы криоконсервации к конкретной модели клеток.

Вывод

Качественная среда для заморозки клеток делает больше, чем просто сохраняет клетки живыми при хранении. Она помогает сохранить пригодную для использования исходную точку для следующего эксперимента.

Составы, содержащие сыворотку, остаются практичными для многих стандартных клеточных линий. Бессывороточные среды уменьшают вариабельность, связанную с сывороткой, и делают приготовление более стабильным. Продукты без фенол-красного подходят для рабочих процессов, где нежелателен фоновый цвет. Составы без ДМСО предоставляют лабораториям еще один вариант для чувствительных клеток или проектов, где необходимо снизить воздействие ДМСО.

Не существует универсальной среды заморозки, которая была бы оптимальным выбором для всех типов клеток.

Начните с типа клеток и последующего эксперимента. Проверьте состояние культуры перед замораживанием. Контролируйте воздействие ДМСО, когда он присутствует. Затем оцените результат после размораживания, основываясь не только на непосредственной жизнеспособности.

При использовании подходящей питательной среды и правильных методов работы с клетками замороженные запасы становятся тем, чем они и должны быть: надежным резервным вариантом, а не еще одним источником неопределенности.

Часто задаваемые вопросы

В1: Каково основное назначение среды для заморозки клеток?

A1: Среда для заморозки клеток защищает клетки от образования кристаллов льда, осмотического стресса и других повреждений во время охлаждения и замораживания. Ее цель — улучшить выживаемость и функциональное восстановление после размораживания.

В2: Является ли бессывороточная среда для заморозки клеток лучше, чем среда, содержащая сыворотку?

A2: Не во всех случаях. Бессывороточные среды обеспечивают более четкий состав и уменьшают вариативность партий сыворотки. Однако формулы, содержащие сыворотку, могут хорошо работать для многих стандартных клеточных линий. Оптимальный выбор зависит от модели клеток и требуемого последующего применения.

В3: Зачем используется ДМСО при криоконсервации клеток?

A3: ДМСО действует как криопротектор. Он проникает в клетки и помогает уменьшить образование вредных кристаллов льда во время охлаждения. Поскольку ДМСО также может влиять на жизнеспособность клеток при длительном воздействии более высоких температур, после его добавления необходимо эффективно работать с клетками.

В4: Когда следует рассматривать использование среды для заморозки без ДМСО?

A4: Состав без ДМСО может быть полезен для чувствительных к ДМСО клеток, исследований стволовых клеток, рабочих процессов с иммунными клетками или экспериментов, где остаточное содержание ДМСО может повлиять на последующее применение. Однако восстановление необходимо подтвердить с использованием конкретного типа клеток.

Вопрос 5: Влияет ли фенол красный на замораживание клеток?

A5: Фенол красный в основном является индикатором pH, а не основным криозащитным компонентом. При использовании восстановленных клеток в цветочувствительных или флуоресцентных анализах предпочтительнее использовать состав без фенола красного.

В6: Можно ли использовать одну и ту же среду для заморозки для iPSC, PBMC, NK-клеток и распространенных клеточных линий?

A6: Некоторые общие составы могут работать с несколькими типами клеток, но чувствительные клетки часто требуют более специфических условий. Перед созданием большого банка клеток следует проверить жизнеспособность и функцию iPSC, PBMC, NK-клеток, Т-клеток и других специализированных моделей после размораживания.

В7: Почему клетки плохо восстанавливаются даже при использовании качественной среды для замораживания?

A7: Проблема может возникнуть еще до заморозки. Слишком высокая плотность клеток, загрязнение, низкая жизнеспособность до заморозки, чрезмерное переваривание, неподходящая плотность клеток, длительное воздействие ДМСО, плохой контроль охлаждения или неправильное размораживание — все это может снизить эффективность восстановления.

В8: Что следует проверить после размораживания клеток?

A8: Проверьте непосредственную жизнеспособность, морфологию, поведение при прикреплении или подвешивании, пролиферацию и любые важные функциональные маркеры. Чувствительным клеткам может потребоваться от 24 до 72 часов, прежде чем станет ясно их истинное состояние восстановления.