اختبار نشاط مثبط التربسين: طريقة طيفية ضوئية بسيطة

يسهل ذكر نشاط مثبط التربسين، لكن ليس من السهل دائمًا قياسه بدقة. فقد يحتوي مستخلص فول الصويا ذو المظهر الصافي على كميات كبيرة من المثبط النشط. وقد تُظهر عينة نباتية مستويات عالية من البروتينات المرتبطة بالدفاع، لكن هذا لا يعني بالضرورة تثبيط نشاط التربسين فعليًا.

لهذا السبب يُعدّ اختبار النشاط مفيدًا. يقيس هذا الاختبار تأثير بروتين مثبط على إنزيم التربسين. فبدلًا من قياس كمية البروتين المثبط، يُقاس تأثيره على التربسين. تُقرأ نتيجة التفاعل اللوني باستخدام مطياف ضوئي أو قارئ لوحات دقيقة عند طول موجي 405 نانومتر.

تُعدّ هذه الطريقة عملية لعينات الطعام، والأنسجة النباتية، ومواد الأعلاف، والبروتينات النقية، وغيرها من عينات البحث. كما يمكن للمختبرات التي تحتاج إلى دمج هذا الاختبار مع قياسات أخرى للإنزيمات أو البروتينات مراجعة منتجات Solarbio. حلول أبحاث علوم الحياة للحصول على معلومات حول المنتجات ذات الصلة ودعم سير العمل.

ما هو مثبط التربسين؟

مثبط التربسين هو بروتين/ببتيد يرتبط بالتربسين ويقلل من نشاطه الإنزيمي. توجد مثبطات التربسين في النباتات والحيوانات والكائنات الدقيقة.

التربسين هو إنزيم سيرين بروتياز قادر على تحليل البروتينات الغذائية الكبيرة إلى ببتيدات أصغر. في الحيوانات، يُنتج التربسين في البنكرياس على شكل تربسينوجين، وهو الطليعة غير النشطة. يُنشط التربسينوجين إلى تربسين في الأمعاء الدقيقة للحيوانات.

تُعدّ خطوة التنشيط هذه بالغة الأهمية. يُعدّ إنزيم التربسين الموجود في جهازنا الهضمي مفيدًا للغاية، ولكن إذا ما نُشّط هذا الإنزيم في أنسجة أخرى من الجسم، فإنه سيُلحق الضرر بتلك الأنسجة. ويتم تثبيط هذا النشاط بشكل طبيعي بواسطة بروتينات أخرى.

في النباتات، تُعد مثبطات التربسين بروتينات دفاعية، يمكنها، على سبيل المثال، أن تتداخل مع الإنزيمات الهاضمة للحشرات والكائنات الحية الأخرى التي تتغذى على النبات. وبالتالي، يمكن دراسة هذا النوع من الجزيئات في سياق فسيولوجيا الهضم، ومعالجة الأغذية، وحماية النبات، وتنظيم البروتينات.

مثبطات التربسين من نوع كونيتز

مثبطات التربسين من نوع كونيتز هي بروتينات أكبر حجماً، إذ يبلغ وزنها الجزيئي 18-24 كيلو دالتون. تحتوي هذه المثبطات عادةً على موقع تفاعل واحد و2-3 مجموعات من روابط ثنائي الكبريتيد.

تشكل العديد من مثبطات البروتياز معقدًا بنسبة 1:1 مع جزيء واحد من التربسين. يتميز هذا المعقد بين المثبط والإنزيم بثباته العالي، مما يؤدي إلى فقدان الإنزيم جزءًا كبيرًا من نشاطه التحفيزي.

يُعد مثبط التربسين البنكرياسي البقري، والذي يُسمى أيضًا BPTI أو أبروتينين، مثالًا شائعًا. كما تنتمي العديد من مثبطات البروتياز المعزولة من البطاطا إلى عائلة كونيتز.

في أبحاث الأغذية والأعلاف، تُدرس هذه البروتينات بعد المعالجة الحرارية. ورغم بقاء كمية من البروتين المُثبِّط بعد المعالجة، إلا أن نشاطه قد ينخفض ​​بشكل حاد. لذا، يُعد اختبار النشاط أنسب من تحديد إجمالي البروتين.

مثبطات التربسين من نوع بومان-بيرك

مثبطات بومان-بيرك أصغر حجماً، وغالباً ما يتراوح حجمها بين 6 و 10 كيلو دالتون. هيكلها مضغوط وعادة ما يحتوي على سبعة أزواج من روابط ثنائي الكبريتيد.

إحدى الميزات المفيدة لهذه المثبطات هي قدرتها على امتلاك موقعين تفاعليين منفصلين. قد يثبط أحد الموقعين إنزيم التربسين، بينما يثبط الآخر إنزيم الكيموتريبسين. وهذا يمنحها نطاق تثبيط أوسع من العديد من المثبطات أحادية الموقع.

توجد هذه المركبات في فول الصويا، واليقطين، والفاصوليا الخضراء، والفاصوليا الحمراء، وعباد الشمس، والحنطة السوداء، وغيرها من المواد النباتية. وقد حظي تركيبها المستقر باهتمام كبير في كل من علوم الأغذية وأبحاث المكونات الوظيفية.

لماذا تقيس المختبرات نشاط مثبط التربسين؟

يمكن للاختبار نفسه أن يجيب على أسئلة مختلفة تمامًا. قد يرغب مصنع أغذية في معرفة ما إذا كان التسخين قد قلل من النشاط المضاد للتغذية. وقد يرغب باحث نباتي في مقارنة مقاومة الحشرات بين العينات. وقد يقوم مختبر بروتينات بفحص نشاط دفعة من مثبطات مُنقّاة.

تبقى طريقة الاختبار متشابهة، لكن طريقة قراءة النتيجة تعتمد على المشروع.

معالجة الأغذية والأعلاف

قد تحتوي فول الصويا النيئة والبقوليات الأخرى على كمية ملحوظة من مثبط التربسين النشط. وعند تناول هذه المواد دون معالجتها حرارياً بشكل كافٍ، قد تقل كفاءة هضم البروتين.

قد يستجيب الجسم بإنتاج المزيد من الإنزيمات الهاضمة. وفي دراسات التغذية طويلة الأمد، رُبط تناول كميات كبيرة من المثبطات بتغيرات في نشاط البنكرياس.

يُقلل التسخين من فعالية المُثبِّط، ولكن زيادة الحرارة ليست دائمًا أفضل. فإذا كان العلاج ضعيفًا جدًا، تبقى كمية كبيرة من المُثبِّط النشط. أما إذا كان قويًا جدًا، فقد تتضرر البروتينات المفيدة، وقد تنخفض القيمة الغذائية.

يساعد اختبار نشاط مثبط التربسين المصنّعين على التحقق من هذا التوازن. فهو يعطي نتيجة مباشرة حول المثبط الذي لا يزال نشطًا بعد المعالجة.

توفر شركة Solarbio مجموعة أوسع من مجموعات التحليل البيوكيميائي للمختبرات التي تحتاج إلى قياس نشاط الإنزيم، أو المستقلبات، أو علامات الإجهاد التأكسدي، أو خصائص العينة ذات الصلة في نفس المشروع.

دراسات الدفاع النباتي

تستطيع النباتات زيادة إنتاج مثبط التربسين بعد تغذية الحشرات أو هجوم مسببات الأمراض. يدخل المثبط إلى الجهاز الهضمي للحشرة المتغذية ويمنع جزءًا من نشاط البروتياز لديها.

لا يؤدي هذا بالضرورة إلى قتل الحشرة مباشرة. في أغلب الأحيان، يُضعف عملية الهضم. وقد يتباطأ النمو، وتتغير أنماط التغذية، ويتأخر النمو.

قد يقارن الباحثون نشاط المثبط بين أصناف النباتات، أو مجموعات المعالجة، أو ظروف الإجهاد. ويمكن لبيانات التعبير الجيني أن تُظهر ما إذا كان جين المثبط مُفعّلاً. ويُبين اختبار النشاط ما إذا كان البروتين المُنتَج لا يزال فعالاً.

بالنسبة للمشاريع التي تربط نشاط المثبطات بإشارات الإجهاد أو التغيرات الأيضية، فإن Solarbio موارد البحث في المسارات يمكن أن يساعد في اختيار المركبات والأجسام المضادة ومنتجات الفحص ذات الصلة.

التحكم في البروتياز في النماذج البيولوجية

تؤدي مثبطات التربسين أيضاً دوراً وقائياً في الأنظمة الحيوانية. يُعدّ SPINK1 مثالاً على ذلك، فهو يحدّ من التنشيط المبكر للتربسين داخل البنكرياس.

عندما يفشل هذا التحكم، قد يتعرض نسيج البنكرياس للإنزيمات الهاضمة النشطة. وهذا أحد الأسباب التي تجعل تنظيم التربسين موضوعًا متكررًا في أبحاث التهاب البنكرياس.

تمت دراسة الأبروتينين ومثبطات البروتياز الأخرى في حالات الالتهاب، ونقص التروية، والوذمة، وغيرها من النماذج. تتطلب هذه الدراسات عادةً أكثر من قراءة واحدة. قد تشير إشارة إنزيمية منخفضة إلى تثبيط، لكنها لا تفسر كل التغيرات البيولوجية اللاحقة.

كيف تعمل طريقة قياس الطيف الضوئي؟

الكيمياء الأساسية ليست معقدة. يتفاعل التربسين مع مادة ملونة. ينتج عن التفاعل منتج أصفر اللون. وعندما يمنع مثبط التربسين، يقلّ تكوّن المنتج الأصفر.

سولاربيو مجموعة اختبار نشاط مثبط التربسين BC6860/BC6865 وهو مبني على هذا المبدأ.

BAPNA كركيزة مولدة للون

يُستخدم BAPNA كركيزة للتريبسين. عندما يقوم التريبسين بتحليل BAPNA، يتم إطلاق p-nitroaniline.

يتميز مركب بارا-نيتروأنيلين، الذي يُكتب غالبًا بـ p-NA، بلونه الأصفر ويمكن قياسه عند 405 نانومتر. ينتج عن زيادة نشاط التربسين كمية أكبر من p-NA، وبالتالي يزداد الامتصاص.

عندما تحتوي العينة على مثبط للتريبسين، يتم حجب جزء من الإنزيم. وبالتالي، تقل كمية BAPNA المتحللة، مما يؤدي إلى انخفاض كمية p-NA، وانخفاض قراءة الامتصاص.

لذا، يقيس هذا الفحص النشاط المتبقي للتريبسين بعد ملامسته للعينة، ولا يقوم بتلوينها أو قياس المثبط بشكل مباشر.

ماذا يعني انخفاض القراءة؟

عادةً ما يعني انخفاض الامتصاص تثبيطًا أقوى، بشرط أن تكون تفاعلات الفراغ والتحكم صحيحة.

يُبقي المُثبِّط الضعيف معظم إنزيم التربسين نشطًا، فيبقى لون التفاعل أصفرًا، مما يُعطي قراءة أعلى. أما المُثبِّط القوي فيُثبِّط المزيد من الإنزيم، فيظهر ناتج أصفر أقل.

تُقارن الحسابات النهائية تفاعل العينة مع الضوابط المطلوبة. ويمكن الإبلاغ عن النتائج كنشاط مثبط، أو وحدات تثبيط، أو نشاط مُقاس بالنسبة لوزن العينة أو محتواها من البروتين.

ينبغي تخفيف العينات التي تقع خارج نطاق القياس الموصى به وإعادة اختبارها. استخدام قيمة امتصاص خارج النطاق الخطي قد يُنتج حسابًا يبدو جيدًا ظاهريًا ولكنه غير موثوق.

ما الذي يسبب عادةً ضعف التكرارية؟

معظم المشاكل لا تنبع من الفكرة الكامنة وراء الاختبار، بل من طريقة التعامل مع العينات.

استخلاص العينات غير المتكافئ

يجب طحن عينات النباتات والأغذية جيداً. فالعينات الخشنة أو غير المتجانسة قد تطلق كميات مختلفة من المثبط من جزء إلى آخر.

ينبغي أن يظل وزن العينة وحجم الاستخلاص ووقت الخلط ودرجة حرارة الاستخلاص وظروف الطرد المركزي ثابتة بين المجموعات. تغيير أي من هذه العوامل في منتصف عملية التحضير قد يؤثر على النتيجة.

قد تُضيف المستخلصات الداكنة أو المعكرة امتصاصًا خلفيًا. لذا، يُنصح باستخدام عينة مرجعية. فبدونها، قد يُظن أن اللون الطبيعي للعينة هو ناتج التفاعل.

اختلافات التوقيت بين الآبار

تستمر تفاعلات الإنزيم أثناء التعامل مع الصفيحة أو الأنبوب. إذا تلقت العينة الأولى الركيزة قبل عدة دقائق من العينة الأخيرة، فقد يظهر الفرق في الامتصاص النهائي.

بالنسبة للألواح الكبيرة، عادةً ما تُسهّل الماصة متعددة القنوات التحكم في التوقيت. أما بالنسبة للعينات الأنبوبية، فقد يكون من الأفضل تشغيل مجموعات أصغر بدلاً من بدء كل عينة في وقت واحد.

تؤثر درجة الحرارة أيضاً. قد يتغير نشاط التربسين عندما تبقى الكواشف على طاولة العمل لفترة طويلة جداً أو عندما لا تُحفظ أنابيب التفاعل في نفس الظروف.

يمكن للمختبرات التي تعمل مع أنواع عينات غير عادية أن تسأل شركة Solarbio فريق الدعم الفني حول الاستخلاص والتخفيف وإعداد الفحص.

عناصر تحكم مفقودة

لا يكفي أنبوب العينة وحده. يحتاج الاختبار إلى ضوابط لنشاط الإنزيم، وخلفية الركيزة، ولون العينة، والتغيرات الأخرى غير الإنزيمية في الامتصاص.

قد يميل البعض إلى إزالة عنصر تحكم لتوفير الآبار، خاصةً عندما تكون اللوحة شبه ممتلئة. لكن هذا عادةً ما يُسبب مشاكل لاحقاً. يصعب تفسير النتيجة عندما يكون تأثير الخلفية غير معروف.

ينبغي أيضاً تضمين نسخ متماثلة من البيانات التقنية. عندما تكون قيم النسخ المتماثلة متباعدة، فإن أول ما يجب التحقق منه هو عملية المعايرة، والخلط، والتوقيت، ووضوح العينة.

ما هي الفحوصات ذات الصلة التي يمكن استخدامها جنبًا إلى جنب مع هذا الاختبار؟

غالباً ما يكون نشاط مثبط التربسين جزءاً واحداً فقط من العمل.

تُعدّ مجموعة اختبار نشاط التربسين BC2310/BC2315 مفيدةً عندما يتطلب المشروع قياس التربسين نفسه. يساعد قياس نشاط الإنزيم ونشاط المُثبِّط جنبًا إلى جنب على التمييز بين حالتين مختلفتين: انخفاض نشاط التربسين وتثبيط قوي لنشاط التربسين الطبيعي.

تشمل المنتجات الأخرى ذات الصلة مجموعة اختبار نشاط مثبط أكسيداز الزانثين BC1020/BC1025، ومجموعة اختبار نشاط مثبط ألفا جلوكوزيداز BC6380/BC6385، ومجموعة اختبار نشاط مثبط بيتا جالاكتوزيداز BC6450/BC6455.

تُعدّ هذه الاختبارات مفيدة في أعمال الفحص التي تُقارن فيها مثبطات إنزيمية متعددة في ظل نفس العينة أو ظروف الاستخلاص. كما تُشارك Solarbio تحديثات المنتجات ومعلومات التطبيقات من خلال موقعها الإلكتروني. قسم أخبار الأبحاث.

لماذا نستخدم Solarbio لهذا النوع من التحليل؟

تقوم شركة Solarbio بتوريد منتجات أبحاث علوم الحياة منذ عام 2004. وتشمل مجموعة منتجاتها مجموعات الفحص الكيميائي الحيوي، والأجسام المضادة، ومجموعات ELISA، وكواشف بيولوجيا الخلية، ومنتجات التلوين، والمعايير التحليلية، ووحدات البناء الجزيئية، ومركبات الجزيئات الصغيرة.

تعمل الشركة وفقًا لأنظمة إدارة الجودة ISO 13485 وISO 9001 وISO 14001 وISO 45001. ويحمل مركز الاختبارات التابع لها اعتماد CNAS. تتوفر تفاصيل إضافية حول الشركة وتطوير المنتجات ونظام الجودة على الموقع الإلكتروني. حول Solarbio صفحة.

في التحليل الإنزيمي الروتيني، تكون العناصر الأساسية بسيطة للغاية: كواشف مستقرة، وبروتوكول واضح، وضوابط فعّالة، وشخص قادر على تحديد ما إذا كانت العينة لا تتصرف كما هو متوقع. هذا ما يحدد عادةً ما إذا كانت نتيجة التشغيل الثاني مطابقة للأولى.

استنتاج

يقيس اختبار نشاط مثبط التربسين مدى قدرة العينة على تثبيط التربسين. يقوم التربسين بتحليل BAPNA وإطلاق p-NA الأصفر. كلما زاد التثبيط، قلّت كمية p-NA، وبالتالي ينخفض ​​الامتصاص عند 405 نانومتر.

يمكن استخدام هذه الطريقة مع فول الصويا، والبقوليات، والأنسجة النباتية، والأغذية، والأعلاف، ومستحضرات المثبطات النقية، والعينات البيولوجية. يتطلب تحضير العينة وتوقيتها عناية خاصة، وكذلك تفاعلات المقارنة والتحكم.

توفر مجموعة اختبار نشاط مثبط التربسين BC6860/BC6865 للمختبرات خيارًا بسيطًا لقياس الطيف الضوئي لهذا العمل. يمكن للباحثين الذين لديهم شكوك حول توافق العينة أو ظروف الاستخلاص أو المنتجات ذات الصلة تواصل مع سولاربيو قبل إعداد التشغيل الأول.

أسئلة متكررة

س1: ما الذي يقيسه اختبار نشاط مثبط التربسين؟

أ1: يقيس هذا الاختبار قدرة العينة على تقليل نشاط التربسين. وتعكس النتيجة التثبيط الوظيفي وليس الكمية الإجمالية لبروتين المثبط.

س2: لماذا يتم استخدام BAPNA في الاختبار؟

A2: BAPNA هو ركيزة ملونة للتريبسين. يقوم التريبسين بتحليله وإطلاق مادة p-nitroaniline الصفراء، والتي يمكن قياسها عند 405 نانومتر.

س3: هل يعني انخفاض الامتصاص تثبيطًا أقوى؟

ج٣: نعم. عندما يتم تثبيط المزيد من التربسين، يقل تحلل BAPNA ويقل إنتاج p-nitroaniline. وبالتالي، ينخفض ​​الامتصاص.

س4: هل يمكن اختبار فول الصويا والبقوليات الأخرى؟

ج٤: نعم. يمكن اختبار فول الصويا، والفاصوليا الخضراء، والفاصوليا الحمراء، وغيرها من المواد النباتية بعد استخلاصها بشكل صحيح. يجب أن تتضمن العينات الملونة أو المعكرة عينة مرجعية مناسبة.

س5: لماذا تختلف القراءات المتكررة؟

A5: تشمل الأسباب الشائعة الطحن غير المتساوي، وأخطاء استخدام الماصة، وأوقات التفاعل المختلفة، وتغيرات درجة الحرارة، وضعف الخلط، وعكارة العينة، أو إعدادات الفراغ غير الصحيحة.

س6: هل نشاط مثبط التربسين هو نفسه نشاط التربسين؟

ج٦: لا. يقيس نشاط التربسين مدى كفاءة الإنزيم في تحليل المادة المتفاعلة معه. أما نشاط مثبط التربسين فيقيس مدى قدرة العينة على تقليل نشاط هذا الإنزيم.