Guía de criopreservación celular: Cómo congelar células y mantener a salvo su cultivo de respaldo

En los cultivos celulares, los pases prolongados pueden inducir una deriva fenotípica asociada a la senescencia, lo que resulta en tasas de proliferación reducidas, expresión alterada de marcadores de superficie y una reproducibilidad experimental notablemente comprometida. La contaminación bacteriana, fúngica y por micoplasmas sigilosos a menudo se propaga sin señales de alerta visibles. Además, los incidentes imprevistos, como cortes de energía, errores en la preparación del medio y aspiración o descarte accidental de cultivos, son frecuentes y difíciles de prevenir.

La congelación de células ofrece al laboratorio una segunda oportunidad. Permite disponer de células de pases tempranos, protege las líneas celulares útiles de los riesgos del cultivo diario y ayuda a los investigadores a repetir experimentos con un punto de partida más estable.

Solarbio proporciona a laboratorios de investigación en ciencias de la vida de todo el mundo reactivos de alta calidad, kits de investigación, consumibles de laboratorio y herramientas de investigación para biología celular, inmunología, biología molecular y bioquímica. Para los investigadores que necesitan una visión más amplia de los productos utilizados en los flujos de trabajo de cultivo celular y criopreservación, visite la Plataforma de productos Solarbio.

Por qué vale la pena realizar la criopreservación celular cuanto antes.

Ayuda a reducir el envejecimiento celular y la deriva fenotípica.

Las células no permanecen iguales para siempre. Tras repetidos pases, algunas líneas celulares comienzan a cambiar. La tasa de crecimiento puede disminuir. La forma puede variar ligeramente. La expresión de marcadores o la respuesta al tratamiento también pueden cambiar. A veces, el cambio es pequeño, pero suficiente para afectar la repetibilidad.

Por eso, muchos laboratorios congelan las nuevas reservas celulares en las primeras fases de cultivo. Para una línea celular recién recibida, suele ser mejor preparar las reservas iniciales durante los primeros 5 pases si las células crecen bien. Esto proporciona al laboratorio una reserva más limpia antes de que una manipulación excesiva altere el cultivo.

Para los laboratorios que construyen un flujo de trabajo de investigación completo en torno a modelos celulares, el Centro de soluciones Solarbio Puede utilizarse como punto de referencia para la selección de reactivos y la planificación de experimentos relacionados.

Protege tu trabajo de la contaminación.

La contaminación es problemática porque suele provocar el desperdicio de más de un frasco. Las bacterias y los hongos pueden ser fáciles de detectar, pero el micoplasma puede permanecer oculto durante un tiempo. Una vez que la contaminación se propaga, salvar el cultivo generalmente no compensa el riesgo.

Las muestras congeladas no sustituyen la manipulación higiénica, pero ofrecen una vía de recuperación. Si se pierde el cultivo activo, un criovial limpio permite reiniciar el trabajo rápidamente. Esto es especialmente importante cuando la línea celular es costosa, de difícil obtención o está vinculada a un proyecto de larga duración.

Proporciona al laboratorio un sistema de respaldo en caso de accidentes.

El cultivo celular depende de las personas, el equipo, la sincronización y pequeños hábitos diarios. Un corte de luz, un error en el medio de cultivo, un subcultivo omitido o dejar un matraz fuera de la incubadora demasiado tiempo pueden provocar la pérdida de células.

Un buen plan de criopreservación mantiene las células importantes fuera de la zona de riesgo diaria. El vial congelado no es solo una muestra de repuesto; es la copia de seguridad del laboratorio.

Cómo comprobar si las células están listas para la congelación

Utilice células sanas en fase logarítmica

Las células más adecuadas para la criopreservación suelen estar en fase de crecimiento exponencial. Para muchas células de mamíferos adherentes, una confluencia de entre el 80 % y el 90 % es un buen rango de trabajo. Las células deben tener un aspecto normal al microscopio, adherirse o suspenderse como se espera y crecer a un ritmo constante.

La viabilidad celular debe ser superior al 90 % antes de la congelación. Si las células ya están debilitadas antes del almacenamiento, la recuperación tras la descongelación no será buena. La congelación no repara un cultivo dañado; solo conserva las condiciones en las que se introdujo en el vial.

Las células aptas para la criopreservación son aquellas que presentan una morfología normal, crecen de forma constante, tienen una alta viabilidad y no están contaminadas con bacterias, hongos o micoplasmas. Si el cultivo no es concluyente, es preferible realizar una nueva prueba o un subcultivo en lugar de proceder a la criopreservación de forma precipitada.

Los investigadores que trabajan con modelos celulares y ensayos posteriores pueden explorar Recursos de la vía Solarbio al conectar el trabajo con cultivos celulares con estudios posteriores de mecanismos.

No congele las células estresadas o inestables.

Algunos cultivos no deben congelarse. Un ejemplo común son las células confluentes en exceso. Cuando las células están demasiado apiñadas, pueden entrar en una fase de meseta y dejar de dividirse correctamente. Las células que se desprenden en láminas o flotan en grumos tampoco son buenas candidatas.

Las células recién descongeladas no deben volver a congelarse inmediatamente. Necesitan tiempo para recuperarse. En la mayoría de los casos, es más seguro realizar uno o dos subcultivos antes de preparar nuevas muestras congeladas.

Las células sobredigeridas representan otro problema. Si el tratamiento con tripsina fue demasiado prolongado o el pipeteo demasiado agresivo, es posible que las células ya estén dañadas. La morfología extraña, el crecimiento lento repentino y la presencia de abundantes restos celulares deben considerarse señales de alerta.

Para reactivos de cultivo celular, soluciones de digestión y consumibles relacionados, los laboratorios pueden utilizar el Sitio web global de Solarbio para consultar las categorías de productos disponibles y la información de soporte.

Cómo elegir el medio de criopreservación adecuado

El verdadero daño proviene de los cristales de hielo.

Las células no temen principalmente al frío. El verdadero peligro reside en la formación de cristales de hielo durante la congelación. Los cristales de hielo grandes pueden dañar las membranas celulares y las estructuras internas. Una vez que esto ocurre, la descongelación posterior no puede reparar completamente el daño.

El medio de criopreservación ayuda a que las células pierdan agua más lentamente y reduce el daño causado por los cristales de hielo. El DMSO se usa ampliamente porque puede penetrar en las células y protegerlas durante la refrigeración. El problema es que el DMSO también es tóxico, por lo que las células no deben permanecer demasiado tiempo a temperatura ambiente después de agregarlo.

Fórmulas comunes utilizadas en laboratorios

Para la mayoría de las células de mamíferos, un medio de congelación clásico consiste en un 90 % de suero fetal bovino (FBS) y un 10 % de DMSO. Es sencillo, familiar y funciona para muchas líneas celulares de uso común.

Para algunas células inmunitarias, la proporción de suero puede ajustarse ligeramente, por ejemplo, a un 92 % de FBS con un 8 % de DMSO, dependiendo del protocolo de laboratorio y del tipo de célula.

Una opción más económica consiste en una mezcla de 50 % de suero fetal bovino (FBS), 40 % de medio completo y 10 % de DMSO. Esta fórmula puede funcionar para líneas celulares más resistentes, pero la recuperación puede ser menor que con la fórmula clásica rica en suero.

Para sistemas de cultivo sin suero, el medio de criopreservación comercial sin suero suele ser una mejor opción. Ayuda a reducir la variación entre lotes de suero y se adapta a laboratorios que desean un sistema más definido. Si un equipo necesita ayuda para comparar sistemas de reactivos o para crear un flujo de trabajo repetible, el Página de servicio Solarbio es un punto de partida útil.

Opciones de medios de criopreservación de Solarbio para diferentes necesidades de cultivo celular

Para el almacenamiento rutinario de células de mamíferos, Medio de criopreservación Solarbio puede utilizarse como una alternativa lista para usar a la preparación manual de FBS/DMSO. Para sistemas definidos libres de suero, Medio de congelación celular Solarbio sin suero (con rojo de fenol) ayuda a reducir la variación de los lotes de suero manteniendo la indicación visual del pH. Si el rojo de fenol puede afectar las imágenes o los ensayos basados ​​en el color, Congelación celular sin suero (sin rojo de fenol) es más adecuado. Para cultivos de células madre o flujos de trabajo sensibles al DMSO, Medio de criopreservación de células madre (sin DMSO) puede considerarse después de la validación de recuperación. Para requisitos más estrictos sin suero, sin rojo de fenol y sin DMSO, Medio de congelación celular sin suero (sin rojo de fenol, sin DMSO) es la opción más específica.

Cómo lograr la densidad celular adecuada

Muy pocas células se recuperan lentamente

La recuperación de células a partir de muestras congeladas se ve afectada por la densidad celular más de lo que la mayoría de los biólogos noveles creen. Un número muy bajo de células en un solo vial puede significar un cultivo poco denso que tarda mucho tiempo en recuperarse tras la descongelación y alcanzar la densidad adecuada para los experimentos. Esto retrasa considerablemente el trabajo.

Para la mayoría de las células de mamíferos, una densidad de congelación común es de 2–5 × 10⁶ células/mL. El volumen de congelación habitual es de 1 mL en un criovial de 1,8–2 mL.

En el caso de las células inmunitarias, la densidad suele ser mayor, generalmente alrededor de 5–10 × 10⁶ células/mL. Las células en suspensión pueden requerir un ajuste más preciso, ya que la recuperación depende en gran medida de la densidad inicial y del estado celular.

Demasiadas células no son mejores

Tampoco es recomendable introducir demasiadas células en un solo vial. El medio de congelación podría no proteger todas las células de manera uniforme. El estrés causado por el DMSO podría intensificarse. Además, la suspensión podría volverse irregular durante el proceso de alicuotado.

Muchos técnicos experimentados utilizan una práctica sencilla para el cultivo rutinario de células adherentes. Un frasco T25 suele colocarse en un criovial, y una placa de 10 cm en dos crioviales. Si bien no es una regla fija, sirve como referencia práctica cuando las células se encuentran en condiciones normales.

Para obtener actualizaciones de productos y contenido práctico de laboratorio, los lectores pueden seguir Noticias de Solarbio para nuevas notas de aplicación e información de la empresa.

Un flujo de trabajo práctico para la congelación de células

Coseche las células con cuidado

Comience con células sanas en fase logarítmica. Retire el medio de cultivo antiguo, lave las células si su protocolo lo requiere y, a continuación, separe o recoja las células utilizando un método adecuado para ese tipo de célula.

Manipule las células con cuidado. Pipetear con fuerza no acelera el proceso de ninguna manera útil. Solo aumenta el estrés.

Tras la recolección, centrifugar en condiciones suaves. Un ajuste común es de 1000 a 1200 rpm durante 5 minutos, aunque cada laboratorio debe ajustarlo según la centrífuga y el tipo de célula. Después de la centrifugación, retirar el sobrenadante con cuidado, evitando remover el sedimento.

Resuspender y alicuotar sin demora

Agregue el medio de congelación preparado y resuspenda el precipitado de manera uniforme. Evite agitar en vórtex. Una vez que el DMSO haya entrado en contacto con las células, no deje la suspensión a temperatura ambiente durante mucho tiempo.

Divida la suspensión en crioviales etiquetados, generalmente 1 ml por vial. Si utiliza un reactivo de criopreservación comercial, siga las instrucciones del producto en lugar de mezclar prácticas de distintos protocolos.

Un etiquetado claro es fundamental. Cada vial debe indicar el nombre de la línea celular, el número de paso, la fecha de congelación y el código del operador o proyecto. Un cultivo celular útil puede volverse inservible si nadie puede identificarlo posteriormente.

Para obtener información sobre la empresa, el sistema de calidad y el alcance del producto, los lectores pueden visitar el sitio web. Página de información de Solarbio.

Refrigeración y almacenamiento a largo plazo

La refrigeración controlada es más segura.

La velocidad de enfriamiento ideal es de aproximadamente -1 °C por minuto hasta que las muestras alcancen los -80 °C. Muchos laboratorios utilizan un contenedor de congelación con isopropanol o una caja de congelación de velocidad controlada para este paso. Es un método sencillo y suficientemente fiable para el cultivo celular rutinario.

Algunos laboratorios utilizan un enfriamiento gradual, trasladando las muestras de 4 °C a -20 °C y luego a -80 °C durante la noche. Esto puede funcionar, pero depende más del tiempo y de los hábitos del operador.

La transferencia directa a -80 °C solo es adecuada si el medio de criopreservación comercial indica claramente que este método es aceptable. Si el medio no está diseñado para la congelación directa, la viabilidad celular puede disminuir considerablemente.

El nitrógeno líquido se utiliza para el almacenamiento a largo plazo.

-80 °C suele ser una temperatura de transición, no la más adecuada para el almacenamiento a largo plazo de células valiosas. Tras enfriar durante la noche, los crioviales deben transferirse a nitrógeno líquido para un almacenamiento estable.

El almacenamiento en nitrógeno líquido en fase gaseosa se utiliza a menudo para reducir el riesgo de contaminación manteniendo una temperatura muy baja. En el caso de bancos de células importantes, se deben revisar periódicamente los registros de almacenamiento.

Si un laboratorio necesita ayuda con la selección de reactivos, la documentación o la comunicación técnica, el Página de contacto de Solarbio Se puede utilizar para contactar con el equipo.

Qué ver después del deshielo

La baja viabilidad suele comenzar antes de la congelación.

Cuando las células no se recuperan bien tras la descongelación, el problema no siempre reside en el proceso de descongelación en sí. Muchos problemas comienzan antes de la congelación. El cultivo original puede haber sido demasiado antiguo, estar demasiado congestionado, contaminado, sobredigerido o haber estado expuesto a DMSO durante demasiado tiempo.

Generalmente se prefiere la descongelación rápida. Caliente el vial rápidamente en un baño de agua a 37 °C hasta que solo quede un pequeño cristal de hielo; luego, transfiera las células al medio precalentado. Las células sensibles pueden requerir la eliminación de DMSO mediante centrifugación después de la dilución.

Dale tiempo a las células para recuperarse.

Las células recién descongeladas pueden crecer lentamente al principio. Esto no siempre significa que hayan fracasado. Muchas células necesitan entre 24 y 72 horas para recuperarse del estrés causado por la congelación.

No se apresure a realizar experimentos formales a menos que el protocolo lo permita. Siempre que sea posible, realice uno o dos pases celulares antes de recopilar datos clave.

Conclusión

La criopreservación celular no es una idea complicada, pero los pequeños detalles importan. La salud de las células, un medio de congelación adecuado, la densidad correcta, la manipulación rápida tras la adición de DMSO, la refrigeración controlada y el almacenamiento en nitrógeno líquido influyen en la recuperación.

Para los laboratorios que realizan análisis rutinarios, las muestras congeladas ahorran tiempo y dinero. Para la investigación a largo plazo, garantizan la repetibilidad. Para los equipos que manejan líneas celulares valiosas o difíciles de reemplazar, forman parte del plan experimental, no son un añadido posterior.

Solarbio ofrece herramientas de investigación en ciencias de la vida para biología celular, inmunología, biología molecular y bioquímica. Al desarrollar un flujo de trabajo de cultivo celular más estable, conviene consultar los recursos de productos y servicios de Solarbio antes de preparar el próximo banco de células.

Preguntas frecuentes

P1: ¿Cuál es el mejor momento para congelar las células?
A1: El mejor momento es cuando las células están en fase de crecimiento exponencial. Para muchas células de mamíferos adherentes, una confluencia de entre el 80 % y el 90 % es un buen rango.

P2: ¿Qué viabilidad se recomienda antes de congelar las células?
A2: La viabilidad generalmente debe ser superior al 90%. Las células débiles antes de la congelación suelen recuperarse mal después de la descongelación.

P3: ¿Se pueden volver a congelar inmediatamente las células recién descongeladas?
A3: Es mejor no hacerlo. Las células recién descongeladas deben recuperarse y pasar una o dos veces antes de volver a congelarlas.

P4: ¿Por qué se utiliza DMSO en el medio de congelación?
A4: El DMSO ayuda a reducir el daño causado por los cristales de hielo durante la congelación. Protege las células durante el enfriamiento, pero una exposición prolongada a temperatura ambiente puede dañarlas.

P5: ¿Cuál es la fórmula común del medio de congelación para células de mamíferos?
A5: Una fórmula común es 90% FBS más 10% DMSO. Algunos laboratorios utilizan 50% FBS, 40% medio completo y 10% DMSO para líneas celulares más resistentes.

P6: ¿Qué densidad se debe utilizar para la congelación de células?
A6: La mayoría de las células de mamíferos se congelan a menudo a una concentración de 2–5 × 10⁶ células/mL. Las células inmunitarias pueden necesitar de 5–10 × 10⁶ células/mL.

P7: ¿Es aceptable la congelación directa a -80 °C?
A7: Solo es aceptable cuando el medio de criopreservación claramente admite ese método. De lo contrario, el enfriamiento controlado es más seguro.

P8: ¿Cuánto tiempo deben permanecer las células a -80 °C antes de almacenarlas en nitrógeno líquido?
A8: Muchos laboratorios mantienen los viales a -80 °C durante la noche después de un enfriamiento controlado y luego los transfieren a nitrógeno líquido al día siguiente.

P9: ¿Por qué las células crecen lentamente después de descongelarse?
A9: El crecimiento lento puede deberse a malas condiciones iniciales, baja densidad de congelación, estrés por DMSO, enfriamiento inestable o retraso normal en la recuperación de células sensibles.

P10: ¿Qué debe escribirse en la etiqueta de un criovial?
A10: La etiqueta debe incluir el nombre de la línea celular, el número de pasaje, la fecha de congelación y el código del operador o proyecto. Las etiquetas claras evitan confusiones posteriores con las muestras.