Руководство по криоконсервации клеток: как заморозить клетки и сохранить резервную культуру в целости.

В клеточных культурах длительное пассирование может вызывать фенотипический дрейф, связанный со старением, что приводит к снижению скорости пролиферации, изменению экспрессии поверхностных маркеров и значительному ухудшению воспроизводимости экспериментов. Бактериальное, грибковое и скрытое микоплазменное загрязнение часто распространяется без каких-либо видимых признаков. Кроме того, непредвиденные инциденты, такие как отключения электроэнергии, ошибки при приготовлении среды и случайное попадание или выбрасывание культур, происходят часто и трудно предотвратить.

Замораживание клеток дает лаборатории второй шанс. Оно сохраняет доступными клетки на ранних пассажах, защищает полезные клеточные линии от рисков, связанных с ежедневным культивированием, и помогает исследователям повторять эксперименты с более стабильной отправной точкой.

Компания Solarbio поставляет высококачественные реагенты, исследовательские наборы, лабораторные расходные материалы и инструменты для исследований в области клеточной биологии, иммунологии, молекулярной биологии и биохимии исследовательским лабораториям по всему миру. Исследователям, которым необходим более широкий обзор продукции, используемой в процессах культивирования клеток и криоконсервации, следует посетить [ссылка на сайт]. Платформа продукции Solarbio.

Почему стоит проводить криоконсервацию клеток на ранних стадиях

Это помогает замедлить старение клеток и фенотипический дрейф.

Клетки не остаются неизменными навсегда. После многократного пассирования некоторые клеточные линии начинают изменяться. Скорость роста может замедлиться. Форма может немного отличаться. Экспрессия маркеров или реакция на лечение также могут измениться. Иногда изменения незначительны, но их достаточно, чтобы повлиять на воспроизводимость результатов.

Именно поэтому многие лаборатории замораживают новые клеточные линии на ранней стадии культивирования. Для недавно полученной клеточной линии обычно лучше подготовить исходные запасы в течение первых 5 пассажей, если клетки хорошо растут. Это позволяет лаборатории получить более чистую резервную копию до того, как слишком много манипуляций изменит культуру.

Для лабораторий, создающих полноценный исследовательский процесс на основе клеточных моделей, это Центр решений Solarbio может использоваться в качестве отправной точки для выбора реагентов и планирования соответствующих экспериментов.

Это защищает вашу работу от загрязнения.

Заражение — это неприятная ситуация, поскольку часто приводит к порче нескольких колб. Бактерии и грибы легко обнаружить, но микоплазмы могут оставаться незамеченными в течение некоторого времени. Как только заражение распространяется, сохранение культуры обычно не стоит риска.

Замороженные запасы не заменяют чистую обработку, но обеспечивают возможность восстановления. Если активная культура утрачена, чистая криопробирка позволяет быстро возобновить работу. Это особенно важно, когда клеточная линия дорогая, ее получение занимает много времени или она используется в долгосрочном проекте.

Это обеспечивает лаборатории резервный вариант на случай аварий.

Работа с клеточными культурами зависит от людей, оборудования, времени и небольших ежедневных привычек. Отключение электроэнергии, ошибка в среде, пропущенный пассаж или колба, оставленная вне инкубатора слишком долго, — все это может привести к гибели клеток.

Грамотно составленный план криоконсервации позволяет сохранить важные клетки вне зоны ежедневного риска. Замороженный флакон — это не просто запасной образец. Это сохраненная копия для лаборатории.

Как проверить, готовы ли клетки к заморозке

Используйте здоровые клетки в логарифмической фазе роста.

Наилучшими для криоконсервации обычно являются клетки, находящиеся в логарифмической фазе роста. Для многих адгезивных клеток млекопитающих хорошим рабочим диапазоном является плотность около 80–90%. Клетки должны выглядеть нормально под микроскопом, прикрепляться или суспендироваться, как и ожидалось, и расти с постоянной скоростью.

Жизнеспособность клеток перед замораживанием должна быть выше 90%. Если клетки ослаблены до хранения, восстановление после размораживания будет неудовлетворительным. Замораживание не восстанавливает поврежденную культуру. Оно лишь сохраняет то состояние, в котором она находится в пробирке.

Для заморозки подходят клетки с нормальной морфологией, стабильным ростом, высокой жизнеспособностью и отсутствием бактериального, грибкового или микоплазменного заражения. Если состояние культуры вызывает сомнения, лучше провести повторное тестирование или пассаж, а не спешить с криоконсервацией.

Исследователи, работающие с клеточными моделями и последующими анализами, могут ознакомиться с ними. Ресурсы пути Solarbio при сопоставлении работы с клеточными культурами с последующими исследованиями механизмов.

Не замораживайте клетки, находящиеся в состоянии стресса или нестабильные.

Некоторые культуры клеток замораживать не следует. Распространенный пример — клетки, находящиеся в условиях чрезмерной плотности. При слишком большом скоплении клеток они могут уже перейти в фазу плато и перестать хорошо делиться. Клетки, которые отделяются пластами или плавают комками, также не подходят для заморозки.

Размороженные клетки не следует сразу же замораживать повторно. Им нужно время для восстановления. В большинстве рутинных работ безопаснее провести их пассаж один или два раза перед приготовлением новых замороженных запасов.

Еще одна проблема — чрезмерное переваривание клеток. Если обработка трипсином была слишком длительной или пипетирование проводилось слишком интенсивно, состояние клеток может быть уже нарушено. Странную морфологию, внезапное замедление роста и большое количество клеточного мусора следует рассматривать как тревожные сигналы.

Для реагентов для культивирования клеток, растворов для ферментативного расщепления и сопутствующих расходных материалов лаборатории могут использовать следующие источники: глобальный сайт Solarbio Чтобы проверить доступные категории товаров и информацию о поддержке.

Выбор подходящей среды для криоконсервации

Реальный ущерб наносят ледяные кристаллы.

Клетки боятся не столько холода, сколько образования кристаллов льда во время замораживания. Крупные кристаллы льда могут повредить клеточные мембраны и внутренние структуры. После этого оттаивание уже не сможет полностью восстановить повреждение.

Криоконсервационная среда помогает клеткам медленнее терять воду и уменьшает повреждение, вызванное кристаллами льда. Диметилсульфоксид (ДМСО) широко используется, поскольку он может проникать в клетки и защищать их во время охлаждения. Проблема в том, что ДМСО также токсичен, поэтому клетки не следует слишком долго оставлять при комнатной температуре после его добавления.

Распространенные формулы, используемые в лабораториях

Для большинства клеток млекопитающих классическая среда для заморозки состоит из 90% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 10% диметилсульфоксида (DMSO). Она проста, хорошо известна и подходит для многих стандартных клеточных линий.

Для некоторых иммунных клеток соотношение сыворотки может быть немного скорректировано, например, 92% фетальной бычьей сыворотки (FBS) с 8% диметилсульфоксида (DMSO), в зависимости от лабораторного протокола и типа клеток.

Более экономичный вариант — 50% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 40% полной питательной среды и 10% диметилсульфоксида (DMSO). Эта формула может подойти для более сильных клеточных линий, но восстановление может быть менее эффективным, чем при использовании классической формулы с высоким содержанием сыворотки.

Для бессывороточных культуральных систем коммерческий бессывороточный криоконсервационный раствор часто является лучшим выбором. Он помогает уменьшить вариативность партий сыворотки и подходит для лабораторий, которым нужна более точная система. Если команде нужна помощь в сравнении реагентных систем или создании воспроизводимого рабочего процесса, Страница сервиса Solarbio является полезной отправной точкой.

Варианты криоконсервационных сред Solarbio для различных потребностей в культивировании клеток.

Для стандартного хранения клеток млекопитающих, Среда для криоконсервации Solarbio Может использоваться в качестве готовой к применению альтернативы ручному приготовлению FBS/DMSO. Для определенных бессывороточных систем, Среда для заморозки клеток Solarbio без сыворотки (с феноловым красным) помогает уменьшить вариативность партий сыворотки, сохраняя при этом визуальную индикацию pH. Если фенол красный может повлиять на визуализацию или цветовые анализы, Бессывороточная криоконсервация клеток (без фенолового красного) Более подходит для культивирования стволовых клеток или рабочих процессов, чувствительных к ДМСО. Среда для криоконсервации стволовых клеток (без ДМСО) Это можно рассмотреть после подтверждения эффективности восстановления. Для более строгих требований к отсутствию сыворотки, фенол-красного и ДМСО, Бессывороточная среда для заморозки клеток (без фенолового красного, без ДМСО) Это наиболее целенаправленный вариант.

Правильная настройка плотности клеток

Слишком мало клеток восстанавливаются медленно.

Восстановление клеток из замороженных запасов в большей степени зависит от плотности клеток, чем это представляют себе многие начинающие биологи. Очень низкое количество клеток в одном флаконе может означать «разреженную» культуру, для восстановления которой после размораживания до полной плотности, необходимой для экспериментов, потребуется много времени. Это значительно задерживает работу.

Для большинства клеток млекопитающих обычная плотность заморозки составляет 2–5 × 10⁶ клеток/мл. Обычно используется 1 мл замороженного объема в криопробирке объемом 1,8–2 мл.

Для иммунных клеток плотность часто выше, обычно около 5–10 × 10⁶ клеток/мл. Для суспензионных клеток может потребоваться более тщательная корректировка, поскольку восстановление в значительной степени зависит от исходной плотности и состояния клеток.

Слишком много клеток не лучше

Упаковка слишком большого количества клеток в один флакон также не является оптимальным вариантом. Замораживающая среда может не обеспечить равномерную защиту каждой клетки. Стресс от ДМСО может усилиться. Кроме того, суспензия может стать неоднородной во время аликвотирования.

Многие опытные специалисты используют простую привычку при работе с адгезивными клетками. Одна колба Т25 часто помещается в одну криопробирку, а одна чашка Петри диаметром 10 см — в две криопробирки. Это не строгое правило, но оно служит практическим ориентиром, когда состояние клеток нормальное.

Чтобы быть в курсе обновлений продукции и получать практические материалы для лабораторных работ, читатели могут подписаться на обновления. Новости Solarbio для получения новых примечаний к заявкам и информации о компании.

Практический алгоритм заморозки клеток

Аккуратно соберите клетки.

Начните со здоровых клеток в логарифмической фазе роста. Удалите старую культуральную среду, промойте клетки, если это требуется по вашему протоколу, затем отделите или соберите клетки, используя метод, подходящий для данного типа клеток.

Обращайтесь с клетками бережно. Сильное нажатие пипетки никак не ускоряет процесс, а лишь создает дополнительный стресс.

После сбора образцов центрифугируйте в щадящих условиях. Обычно используется скорость 1000–1200 об/мин в течение 5 минут, однако каждая лаборатория должна корректировать ее в зависимости от центрифуги и типа клеток. После центрифугирования аккуратно удалите надосадочную жидкость, не потревожив осадок.

Немедленно ресуспендируйте и разделите на аликвоты.

Добавьте приготовленную среду для заморозки и равномерно ресуспендируйте осадок. Избегайте перемешивания на вихревом смесителе. После контакта с клетками с ДМСО не оставляйте суспензию надолго при комнатной температуре.

Разлейте суспензию по промаркированным криопробиркам, обычно по 1 мл на пробирку. При использовании коммерческого реагента для криоконсервации следуйте инструкциям производителя, а не смешивайте методы из разных протоколов.

Четкая маркировка имеет значение. На каждом флаконе должно быть указано название клеточной линии, номер пассажа, дата заморозки и код оператора или проекта. Полезный клеточный материал может стать бесполезным, если его невозможно будет идентифицировать позже.

Для получения информации о компании, системе качества и ассортименте продукции читатели могут посетить [ссылка]. О компании Solarbio (страница "О нас").

Охлаждение и долговременное хранение

Контролируемое охлаждение безопаснее.

Идеальная скорость охлаждения составляет примерно -1°C в минуту, пока образцы не достигнут температуры -80°C. Во многих лабораториях для этого этапа используют контейнер для заморозки в изопропаноле или бокс для заморозки с регулируемой скоростью. Это простой и достаточно надежный метод для рутинного культивирования клеток.

В некоторых лабораториях используется ступенчатое охлаждение: образцы перемещают из температуры 4°C в -20°C, а затем в -80°C в течение ночи. Это может сработать, но больше зависит от времени и привычек оператора.

Прямой перенос в морозильную камеру при -80°C допустим только в том случае, если на упаковке коммерческой криоконсервационной среды четко указано, что этот метод приемлем. Если среда не предназначена для прямого замораживания, жизнеспособность клеток может резко снизиться.

Жидкий азот предназначен для длительного хранения.

Температура -80°C обычно является переходным этапом и не лучшим местом для длительного хранения ценных клеток. После охлаждения в течение ночи криопробирки следует поместить в жидкий азот для стабильного хранения.

Хранение в жидком азоте в парообразной фазе часто используется для снижения риска загрязнения при сохранении очень низкой температуры. Для важных банков клеток необходимо регулярно проверять записи о хранении.

Если лаборатории нужна помощь в выборе реагентов, оформлении документации или технической коммуникации, то... Страница контактов Solarbio может использоваться для связи с командой.

Что посмотреть после размораживания

Низкая жизнеспособность обычно начинается еще до заморозки.

Если клетки плохо восстанавливаются после размораживания, проблема не всегда заключается в самом этапе размораживания. Многие проблемы начинаются еще до замораживания. Исходная культура могла быть слишком старой, слишком переполненной, загрязненной, чрезмерно переваренной или слишком долго подвергаться воздействию ДМСО.

Обычно предпочтительнее быстрое размораживание. Быстро прогрейте флакон в водяной бане при температуре 37°C до образования лишь небольших кристаллов льда, затем перенесите клетки в предварительно подогретую среду. Для чувствительных клеток после разведения может потребоваться удаление ДМСО центрифугированием.

Дайте клеткам время восстановиться.

Свежеразмороженные клетки поначалу могут расти медленно. Это не всегда означает неудачу. Многим клеткам требуется 24–72 часа для восстановления после замораживания.

Не стоит сразу переходить к формальным экспериментам, если протокол этого не позволяет. По возможности, проведите пассаж клеток один или два раза перед сбором ключевых данных.

Вывод

Криоконсервация клеток — несложная задача, но важны мелкие детали. Здоровые клетки, подходящая среда для замораживания, правильная плотность, быстрая обработка после добавления ДМСО, контролируемое охлаждение и хранение в жидком азоте — все это влияет на возможность восстановления.

Для обычных лабораторий замороженные запасы экономят время и деньги. Для долгосрочных исследований они обеспечивают воспроизводимость результатов. Для групп, работающих с ценными или трудновоспроизводимыми клеточными линиями, они являются частью экспериментального плана, а не второстепенным элементом.

Solarbio предоставляет инструменты для исследований в области биологических наук, включая клеточную биологию, иммунологию, молекулярную биологию и биохимию. При создании более стабильного процесса культивирования клеток стоит ознакомиться с продуктами и услугами Solarbio, доступными по ссылкам, прежде чем готовить следующий банк клеток.

Часто задаваемые вопросы

В1: Когда лучше всего замораживать клетки?
A1: Лучшее время — когда клетки находятся в логарифмической фазе роста. Для многих адгезивных клеток млекопитающих оптимальным диапазоном является плотность около 80–90%.

В2: Какой уровень жизнеспособности клеток рекомендуется определять перед замораживанием?
A2: Жизнеспособность клеток обычно должна быть выше 90%. Слабые клетки до замораживания обычно плохо восстанавливаются после размораживания.

В3: Можно ли сразу же заморозить размороженные клетки повторно?
A3: Лучше этого не делать. Размороженные клетки должны восстановиться и пройти один или два этапа заморозки, прежде чем перейти к следующему этапу.

Вопрос 4: Зачем используется ДМСО в среде для заморозки?
A4: ДМСО помогает уменьшить повреждение кристаллов льда во время замораживания. Он защищает клетки во время охлаждения, но длительное воздействие при комнатной температуре может нанести им вред.

В5: Какова распространенная формула среды для заморозки клеток млекопитающих?
A5: Обычно используется формула 90% FBS плюс 10% DMSO. В некоторых лабораториях для получения более сильных клеточных линий используют 50% FBS, 40% полной среды и 10% DMSO.

В6: Какую плотность следует использовать для заморозки клеток?
A6: Большинство клеток млекопитающих обычно замораживают при концентрации 2–5 × 10⁶ клеток/мл. Иммуническим клеткам может потребоваться 5–10 × 10⁶ клеток/мл.

Вопрос 7: Допустима ли прямая заморозка при температуре -80°C?
A7: Это допустимо только в том случае, если среда для криоконсервации явно поддерживает этот метод. В противном случае, контролируемое охлаждение безопаснее.

Вопрос 8: Как долго клетки следует хранить при температуре -80°C перед помещением в жидкий азот?
A8: Во многих лабораториях пробирки хранят при температуре -80°C в течение ночи после контролируемого охлаждения, а затем на следующий день переносят в жидкий азот.

В9: Почему клетки растут медленно после размораживания?
A9: Замедленный рост может быть вызван плохими исходными условиями, низкой плотностью заморозки, стрессом от ДМСО, нестабильным охлаждением или нормальной задержкой восстановления у чувствительных клеток.

В10: Что следует написать на этикетке криопробирки?
A10: На этикетке должны быть указаны название клеточной линии, номер пассажа, дата заморозки и код оператора или проекта. Четкие этикетки предотвращают путаницу с образцами в дальнейшем.