Cómo elegir el medio de congelación celular adecuado para una mejor recuperación celular.

Conservar células en estado fijo parece una tarea de laboratorio bastante sencilla. Resulta muy frustrante cuando un cultivo valioso no se recupera tras un almacenamiento prolongado. Al principio, las células descongeladas tienen buen aspecto en el medio que se descongeló con ellas. Más tarde, se adhieren lentamente al fondo de la placa, comienzan a dividirse de forma desigual o no se dividen en absoluto. La mayoría culpará al tanque de nitrógeno líquido o a la forma en que se descongelaron las células. Pero a menudo, la causa de todos los problemas se encuentra mucho más atrás.

El estado de las células antes de la congelación, el sistema crioprotector, la exposición al DMSO, la densidad de congelación y el propio medio de congelación influyen en lo que sucede después de la descongelación.

Por eso, el medio de congelación celular no debe considerarse un elemento secundario. Una buena formulación debe proteger las células durante la refrigeración sin generarles estrés adicional. Solarbio suministra reactivos para biología celular y productos de cultivo relacionados a través de su amplia red de distribución. Gama de productos Solarbio, incluyendo diferentes formulaciones de criopreservación para líneas celulares de rutina, células sensibles, células inmunitarias, células madre y otros modelos de investigación.

¿Por qué es tan importante el medio de congelación celular?

El daño por congelación comienza antes de que las células alcancen el nitrógeno líquido.

Las células no se dañan simplemente por enfriarse. Un problema importante es la formación de hielo.

Los cristales pueden formarse dentro de las células y en el espacio intercelular. Estos pueden causar daños graves a las membranas y a las estructuras internas de las células. Durante el enfriamiento, las células se ven sometidas a estrés osmótico. El agua entra y sale de las células, y la solución extracelular circundante se concentra cada vez más.

Un medio de criopreservación está diseñado para reducir estas tensiones. Proporciona a las células una mayor probabilidad de sobrevivir tanto a la congelación como a la descongelación.

Los investigadores que deseen una visión más amplia del proceso de congelación completo también pueden leer el Guía de criopreservación celular: Cómo congelar células y mantener a salvo su cultivo de respaldo, que abarca el estado de las células, la densidad de congelación, la refrigeración, el almacenamiento y la recuperación posterior a la descongelación.

El DMSO es útil, pero requiere un manejo cuidadoso.

El DMSO es uno de los crioprotectores más comunes en el cultivo celular. Solarbio DMSO (dimetilsulfóxido) (grado para cultivo celular) Se utiliza comúnmente en cultivos celulares y puede penetrar en las células para reducir la formación de hielo perjudicial durante el enfriamiento. Por eso, muchas fórmulas clásicas de congelación contienen DMSO.

Lo útil y lo problemático se combinan. El DMSO puede proteger las células a bajas temperaturas, pero una exposición prolongada a temperatura ambiente puede reducir su viabilidad. Una vez mezclado el medio de congelación con DMSO con la suspensión celular, no se debe prolongar innecesariamente su manipulación.

Si prefiere una fórmula lista para usar y de uso rutinario, Medio de criopreservación Solarbio Puede utilizarse como componente de un procedimiento típico de almacenamiento de células de mamíferos.

¿Debería elegir un medio de congelación con o sin suero?

Las fórmulas que contienen suero son conocidas pero están menos definidas.

El medio de congelación que contiene suero sigue siendo muy utilizado. La combinación habitual de suero y DMSO funciona con muchas líneas celulares de mamíferos ya establecidas y se ha utilizado en laboratorios durante años.

La principal limitación de este sistema es la variabilidad entre lotes.

El suero contiene proteínas, hormonas, factores de crecimiento, lípidos y muchos otros componentes biológicos. Sus niveles pueden variar según la fuente y el lote. Una línea celular que se recupera bien con un lote puede comportarse de manera diferente después de que el laboratorio cambie a otro.

También existen proyectos en los que simplemente no se desean componentes de origen animal. La investigación con células madre, el trabajo relacionado con la terapia celular, los estudios sensibles de células inmunitarias y los sistemas de cultivo más controlados suelen beneficiarse de un entorno de congelación más definido.

Los medios de cultivo sin suero facilitan el control del sistema.

Un medio de congelación sin suero elimina la variabilidad relacionada con el suero en el proceso. Esto facilita la estandarización de un protocolo de banco de células en diferentes lotes y por distintos operadores.

Además, ahorra tiempo. No es necesario preparar una mezcla de suero/DMSO cada vez que se congelan las células. Un medio listo para usar puede reducir los pequeños errores de preparación que son fáciles de cometer durante una jornada de cultivo ajetreada.

Para los investigadores que aún desean DMSO en la formulación mientras eliminan el suero, Medio de congelación celular sin suero (con rojo de fenol) Ofrece una opción definida con un indicador de pH visible.

Este tipo de formulación puede ser adecuada para cultivos celulares de rutina donde la variación del suero es un problema, pero la crioprotección con DMSO sigue siendo aceptable.

¿Importa el rojo fenol en un medio de criopreservación?

El rojo de fenol puede ser útil para el manejo rutinario.

El rojo de fenol es conocido por cualquiera que trabaje con medios de cultivo celular. Proporciona una indicación visual rápida de los cambios en el entorno del medio.

Para trabajos básicos de congelación y recuperación, esto puede resultar práctico. No sustituye un control adecuado del pH, pero proporciona al operario una referencia visual inmediata durante la manipulación rutinaria.

La elección cambia cuando la detección posterior es sensible al color de fondo.

Las fórmulas sin rojo de fenol se ajustan mejor a algunos métodos de detección.

Si las células recuperadas se van a utilizar para imágenes de fluorescencia, mediciones basadas en el color u otro ensayo en el que la interferencia de fondo sea importante, puede ser preferible un sistema libre de rojo de fenol.

Solarbio Congelación celular sin suero (sin rojo de fenol) Está diseñado para este tipo de requisitos, manteniendo el sistema de congelación libre de suero.

Lo importante no es elegir entre rojo fenol o no rojo fenol simplemente porque uno parezca más avanzado. Hay que adaptarlo al trabajo que se realizará después de la descongelación. Un experimento estándar de expansión celular y un ensayo óptico sensible no siempre requieren la misma formulación.

¿Cuándo tiene sentido la criopreservación celular sin DMSO?

Algunas células y flujos de trabajo necesitan un sistema crioprotector diferente.

El DMSO se utiliza ampliamente, pero eso no significa que todos los modelos celulares deban usarlo automáticamente.

Algunas células sensibles se recuperan mal tras la exposición al DMSO. En otros proyectos, los investigadores buscan reducir la cantidad de DMSO residual que llega al cultivo posterior. Esto puede ser importante en trabajos con células madre, aplicaciones con células inmunitarias o investigaciones donde la función celular posterior a la descongelación es más importante que simplemente contar las células supervivientes.

Un medio libre de DMSO utiliza una formulación protectora diferente en lugar del sistema estándar con DMSO. La elección final aún debe probarse con el tipo de célula específico, ya que "libre de DMSO" no significa automáticamente "mejor para todas las células".

Para los flujos de trabajo con células madre donde evitar el DMSO es un requisito real, Medio de criopreservación de células madre (sin DMSO) Es una opción que se puede evaluar mediante una pequeña prueba de recuperación antes de preparar bancos de células más grandes.

Las células sensibles deben evaluarse por la calidad de la recuperación, no por un solo número.

La viabilidad posterior a la descongelación es útil, pero no lo es todo.

Una población celular puede mostrar una alta viabilidad inmediatamente después de la descongelación, pero su crecimiento puede ser deficiente durante los dos días siguientes. Las células madre pueden sobrevivir, pero perder las características necesarias para la diferenciación posterior. Las células inmunitarias pueden permanecer vivas, aunque muestren respuestas funcionales más débiles.

Por eso, la recuperación debe comprobarse mediante la morfología celular, el comportamiento de adhesión o suspensión, la proliferación y el principal marcador funcional utilizado en el proyecto.

La identidad celular y el historial de pases también importan. El artículo publicado anteriormente Líneas celulares: El primer paso para una investigación in vitro fiable Esto explica por qué las primeras líneas de semillas, el control de los pases, la identidad celular y el estado de micoplasma están estrechamente ligados a la repetibilidad del trabajo in vitro.

¿Cómo elegir el medio de congelación adecuado para diferentes tipos de células?

Las líneas celulares de rutina generalmente necesitan simplicidad y repetibilidad.

Para las líneas celulares más utilizadas, como A549, CHO, Jurkat y muchas otras que se emplean con frecuencia en la investigación, el requisito principal es la recuperación de las células y la sencillez del proceso de congelación.

Un medio listo para usar puede ser útil cuando muchos operadores comparten el mismo banco de células. Todos siguen la misma fórmula, por lo que el resultado depende menos de quién preparó la solución de congelación ese día.

El estado inicial de las células sigue siendo importante. Las células sanas en fase logarítmica suelen congelarse mejor que los cultivos con crecimiento excesivo, contaminados o sometidos a mucho estrés. Un buen medio de cultivo no puede reparar un cultivo inicial deficiente.

Las células madre y las células inmunitarias necesitan más atención.

Las células iPSC, otras células madre, las células PBMC, las células NK, las células T αβ, las células T γδ y los modelos de células inmunitarias relacionados suelen ser menos tolerantes.

La cuestión no es solo si las células sobreviven. Los investigadores pueden necesitar preservar la pluripotencia, el potencial de diferenciación, los marcadores de superficie, la respuesta a las citoquinas, la capacidad de expansión u otras propiedades funcionales.

Ahí es donde resultan útiles los medios de congelación específicos para cada tipo de célula o aplicación. Solarbio ofrece diferentes formulaciones que cubren las necesidades de criopreservación celular rutinaria, sin suero, con DMSO, sin DMSO y especializada.

Cuando el modelo es inusual o varias formulaciones podrían funcionar, una pequeña comparación es más barata que descubrir un problema después de que un gran banco de células ya ha sido congelado. Los investigadores pueden utilizar Servicio técnico de Solarbio para la selección de productos y el soporte de aplicaciones al momento de adaptar un sistema de criopreservación a un modelo celular específico.

Conclusión

Un buen medio de congelación celular hace más que mantener las células vivas durante el almacenamiento. Ayuda a preservar un punto de partida útil para el siguiente experimento.

Las fórmulas con suero siguen siendo prácticas para muchas líneas celulares de uso común. Los medios sin suero reducen la variabilidad asociada al suero y hacen que la preparación sea más consistente. Los productos sin rojo de fenol son adecuados para flujos de trabajo donde no se desea color de fondo. Las formulaciones sin DMSO ofrecen a los laboratorios otra opción para células sensibles o proyectos donde se necesita reducir la exposición al DMSO.

No existe un único medio de congelación que sea la mejor opción para todas las células.

Comience con el tipo de célula y el experimento posterior. Verifique el estado del cultivo antes de congelarlo. Mantenga controlada la exposición al DMSO cuando esté presente. Luego, evalúe el resultado después de la descongelación considerando más que solo la viabilidad inmediata.

Cuando se utilizan el medio adecuado y se manipulan las células correctamente, las existencias congeladas se convierten en lo que deberían ser: una reserva fiable en lugar de otra fuente de incertidumbre.

Preguntas frecuentes

P1: ¿Cuál es el propósito principal del medio de congelación celular?

A1: El medio de congelación celular protege a las células de la formación de cristales de hielo, el estrés osmótico y otros daños durante el enfriamiento y el almacenamiento en congelación. Su propósito es mejorar la supervivencia y la recuperación funcional después de la descongelación.

P2: ¿Es mejor el medio de congelación celular sin suero que el medio que contiene suero?

A2: No en todos los casos. Los medios sin suero ofrecen una formulación más definida y reducen la variabilidad entre lotes de suero. Las fórmulas con suero pueden funcionar bien para muchas líneas celulares de uso común. La mejor opción depende del modelo celular y de la aplicación posterior requerida.

P3: ¿Por qué se utiliza DMSO en la criopreservación celular?

A3: El DMSO actúa como crioprotector. Penetra en las células y ayuda a reducir la formación de cristales de hielo dañinos durante el enfriamiento. Dado que el DMSO también puede afectar la viabilidad celular durante una exposición prolongada a temperaturas elevadas, la manipulación de las células debe realizarse con cuidado después de su adición.

P4: ¿Cuándo debería considerar un medio de congelación sin DMSO?

A4: Una formulación sin DMSO puede ser útil para células sensibles al DMSO, investigación con células madre, flujos de trabajo con células inmunitarias o experimentos donde el DMSO residual pueda afectar aplicaciones posteriores. La recuperación debe validarse con el tipo de célula específico.

P5: ¿Afecta el rojo de fenol a la congelación celular?

A5: El rojo de fenol es principalmente un indicador de pH, más que el componente crioprotector principal. Puede ser preferible una formulación sin rojo de fenol cuando las células recuperadas se vayan a utilizar en ensayos sensibles al color o basados ​​en fluorescencia.

P6: ¿Se puede utilizar el mismo medio de congelación para células iPSC, PBMC, células NK y líneas celulares comunes?

A6: Algunas formulaciones generales pueden funcionar en varios tipos de células, pero las células sensibles suelen requerir condiciones más específicas. Antes de preparar un banco de células de gran tamaño, se debe evaluar la viabilidad y la función de las células iPSC, PBMC, NK, T y otros modelos especializados tras la descongelación.

P7: ¿Por qué las células pueden recuperarse mal incluso cuando se utiliza un buen medio de congelación?

A7: El problema puede comenzar antes de la congelación. La confluencia excesiva de células, la contaminación, la baja viabilidad previa a la congelación, la digestión excesiva, la densidad celular inadecuada, la exposición prolongada al DMSO, un control deficiente del enfriamiento o una descongelación incorrecta pueden reducir la recuperación.

P8: ¿Qué se debe comprobar después de descongelar las células?

A8: Compruebe la viabilidad inmediata, la morfología, la adhesión o el comportamiento en suspensión, la proliferación y cualquier marcador funcional importante. Las células sensibles pueden necesitar de 24 a 72 horas antes de que se observe claramente su estado de recuperación.