Efectos no deseados de los inhibidores de moléculas pequeñas: por qué los datos que parecen prometedores aún pueden ser erróneos.

Los inhibidores de moléculas pequeñas son fáciles de usar: basta con añadir el compuesto y, tras un tiempo determinado, comprobar la señal. Este sencillo procedimiento es lo que los hace tan populares en la investigación para el descubrimiento de fármacos, la validación de dianas terapéuticas y la biología celular.

El problema comienza cuando el resultado parece más limpio de lo que realmente es.

Además de su diana principal, un compuesto puede unirse a numerosas proteínas. A bajas dosis, esto puede ser irrelevante. Sin embargo, a dosis más altas, estas interacciones pueden convertirse en la causa principal de los fenotipos observados. Esto significa que las células han cambiado, el ensayo ahora arroja señales intensas y, tras un tiempo, parecerá que se han obtenido resultados muy prometedores. No obstante, posteriormente, otros investigadores no podrán reproducir estos resultados.

Esto es lo que dificulta el análisis de los efectos fuera de objetivo. No siempre producen un error evidente. Con mayor frecuencia, generan datos creíbles con una explicación errónea.

Investigadores que trabajan con soluciones de investigación de moléculas pequeñas Es necesario considerar la actividad fuera del objetivo antes del primer experimento, no después de varios meses de trabajo de seguimiento.

¿Por qué los inhibidores de moléculas pequeñas actúan sobre más de una diana?

Las proteínas similares suelen tener sitios de unión similares.

Los inhibidores de moléculas pequeñas pueden unirse a los sitios de unión compartidos por miembros de la misma familia de proteínas. En el caso de las quinasas, los sitios de unión de ATP suelen ser similares, por lo que un compuesto desarrollado para inhibir una quinasa también puede inhibir varias otras quinasas de familias relacionadas.

SP600125 se usa comúnmente como inhibidor de JNK. Es útil, pero no es un compuesto perfecto para un solo objetivo. También puede afectar a PI3Kδ, S6K1 y otras quinasas, dependiendo de la dosis y las condiciones experimentales.

Si SP600125 altera la producción de citocinas, el crecimiento celular o la supervivencia, este resultado no debe atribuirse inmediatamente a JNK. Otro inhibidor de JNK con una estructura química diferente podría ser útil. La inactivación genética también resulta beneficiosa. Sin esta verificación cruzada, el mecanismo sigue siendo incierto.

Los investigadores pueden revisar compuestos de moléculas pequeñas por objetivo, vía de señalización y aplicación antes de seleccionar un compuesto de trabajo.

La estructura química puede generar enlaces no específicos.

Algunos compuestos tienen mayor tendencia a adherirse a membranas, proteínas séricas, superficies plásticas o proteínas no relacionadas. Una alta lipofilicidad es una señal de alerta.

La clofazimina posee una estructura hidrofóbica y aromática, con un elevado LogP. Puede asociarse fuertemente a las membranas lipídicas y a las proteínas séricas. La cantidad añadida al medio de cultivo puede ser muy diferente de la cantidad que llega al objetivo intracelular.

Esto es importante al comparar resultados entre distintas líneas celulares o condiciones de suero. Un compuesto puede parecer más activo en un sistema simplemente porque hay mayor cantidad de compuesto libre disponible. Antes de explicar el resultado biológico, se deben verificar la solubilidad, la agregación, el nivel de DMSO y la concentración en suero.

La selectividad cambia con la concentración.

La selectividad no es fija en todas las dosis.

Una dosis única de un compuesto puede mostrar una alta selectividad a 10 nM, pero resultar ser un compuesto de muy amplio espectro a 10 µM en experimentos posteriores basados ​​en células.

Alisertib se utiliza como inhibidor de la Aurora A. A una concentración nanomolar adecuada, puede mostrar una clara actividad de la Aurora A. A concentraciones superiores a su rango selectivo, aumenta la probabilidad de inhibición de la Aurora B y de efectos celulares más amplios.

Un fenotipo más marcado no siempre implica un mejor resultado. A veces, simplemente significa que el compuesto se ha salido de su rango selectivo.

¿Qué efectos puede tener una actividad no deseada en un experimento?

Puede producir un fenotipo falso positivo.

Una molécula pequeña puede reducir la viabilidad celular por razones no relacionadas con el objetivo previsto. El compuesto puede afectar, por ejemplo, las funciones mitocondriales, dañar las membranas, alterar los estados redox o afectar el citoesqueleto.

Las células pueden redondearse, desprenderse o dejar de crecer. Estos cambios pueden parecer específicos del objetivo, especialmente cuando este ya está relacionado con la supervivencia celular.

Un único resultado de viabilidad no es suficiente. Se deben analizar conjuntamente la morfología, los marcadores de apoptosis, los datos del ciclo celular y la señalización posterior. base de datos de vías puede ayudar a los investigadores a elegir marcadores relacionados en lugar de depender de un único criterio de valoración.

Puede reaccionar con el método de detección.

Algunos compuestos interfieren con el ensayo en lugar de con las células.

Los ensayos basados ​​en resazurina son sensibles a los compuestos redox-activos. Un compuesto de prueba puede reducir el colorante directamente, incluso cuando el metabolismo celular no ha cambiado. Los compuestos fluorescentes pueden aumentar el ruido de fondo. Los compuestos coloreados pueden afectar las lecturas de absorbancia.

Este problema es fácil de pasar por alto porque el lector de placas sigue produciendo un número.

Un control sencillo con solo el compuesto puede revelar el problema. Añada el compuesto a la mezcla de ensayo sin células. Si la señal cambia, la química de detección se está viendo afectada. En ese caso, se debe utilizar un segundo ensayo basado en otro principio.

El más amplio Gama de productos Solarbio Incluye compuestos de moléculas pequeñas, ensayos celulares, anticuerpos y reactivos de detección que pueden combinarse durante la planificación del ensayo.

Puede llevar todo el proyecto en la dirección equivocada.

El mayor coste no suele ser el del primer experimento fallido, sino el del trabajo posterior basado en un mecanismo erróneo.

Un investigador puede concluir que una proteína controla una vía metabólica porque un inhibidor produjo un fenotipo claro. A continuación, se realizan más experimentos. Se tratan los animales, se ordena la secuenciación y se construye un modelo completo a partir del primer resultado.

Meses después, el mismo fenotipo no se puede reproducir con otro inhibidor ni mediante la eliminación del gen.

La inhibición química puede respaldar un mecanismo, pero no puede probarlo por sí sola.

¿Cómo se pueden detectar precozmente los efectos no deseados?

Prueba un rango de dosis real

Probar una sola concentración ahorra tiempo al principio, pero a menudo genera más trabajo después.

Una curva completa de dosis-respuesta muestra dónde comienza el efecto. También indica si la respuesta aparece cerca de la potencia conocida del fármaco objetivo o solo cuando la dosis es mucho mayor.

Si el objetivo esperado se inhibe a 20 nM, pero el fenotipo celular solo aparece a 5 µM, esta discrepancia requiere una explicación. Es posible que la penetración celular sea deficiente. También es posible que se produzca una actividad fuera del objetivo.

La dosis de trabajo normalmente debe ser la concentración más baja que proporcione un efecto estable y reproducible relacionado con el objetivo terapéutico.

 Comparar el compuesto con métodos genéticos

La eliminación génica mediante CRISPR, la interferencia con CRISPR, el shRNA y el siRNA ofrecen diferentes maneras de modificar el mismo objetivo.

El resultado químico no tiene por qué coincidir con el resultado genético en todos los detalles. Un fármaco actúa rápidamente, mientras que la pérdida de un gen puede desencadenar una adaptación a largo plazo. Aun así, la dirección principal debe tener sentido biológico.

Si un inhibidor mata las células, pero la eliminación del gen diana tiene poco efecto, es posible que el compuesto esté actuando en otro lugar. Si el inhibidor sigue funcionando en una línea celular sin el gen diana, esto constituye una señal de alerta aún mayor.

Los investigadores que necesiten apoyo adicional para el trabajo con proteínas, la preparación de anticuerpos o el desarrollo de ensayos pueden revisar Servicios técnicos de Solarbio.

Utilice más de una lectura

Un ensayo de viabilidad indica que las células cambiaron, pero no explica el motivo.

Una segunda lectura debería examinar el objetivo o un evento de la vía metabólica cercana. Esto puede incluir la fosforilación del objetivo, la fosforilación del sustrato, la localización de la proteína, el cambio en la transcripción, la actividad enzimática o la interacción directa con el objetivo.

Los dos ensayos no deben depender de la misma química de detección. Si ambos métodos pueden verse afectados por la misma propiedad del compuesto, no son realmente independientes.

¿Cómo se puede reducir el riesgo de impactos no deseados?

Utilice diferentes inhibidores para el mismo objetivo.

Dos compuestos con estructuras químicas diferentes son mucho más útiles que repetir el mismo inhibidor en varias dosis.

Para la investigación de BTK, Evobrutinib, Acalabrutinib y Zanubrutinib pueden compararse como herramientas independientes. Si generan un fenotipo similar dentro de sus rangos de actividad habituales, la conclusión se fortalece.

La misma lógica se aplica a los estudios sobre el EGFR. Osimertinib y Gefitinib se unen de forma diferente y presentan perfiles de selectividad distintos. Obtener resultados similares con ambos compuestos es más útil que una respuesta extrema con un tratamiento de dosis alta.

Mantenga el control del vehículo perfectamente sincronizado.

El DMSO suele considerarse inofensivo, pero las células pueden reaccionar ante él cuando la concentración final es demasiado alta.

Cada grupo de tratamiento debe contener el mismo nivel de DMSO. Una diferencia del 0,1 % puede parecer pequeña, pero las células sensibles pueden reaccionar a ella. La concentración de la solución madre debe planificarse de manera que la dosis de trabajo no requiera una gran cantidad de disolvente.

Compruebe la reversibilidad con un experimento de lavado.

Un experimento de lavado es sencillo y a menudo resulta informativo.

Tratar las células, retirar el compuesto, lavarlas y continuar el cultivo en un medio fresco. Si el fenotipo comienza a revertirse, es más probable que se trate de una inhibición directa y reversible.

Estos efectos duraderos pueden deberse a la unión irreversible a proteínas, a cambios persistentes en las vías de transducción de señales o a la toxicidad general. Esta prueba no demuestra efectos fuera de objetivo, sino que indica la necesidad de seguir investigando el mecanismo de acción del compuesto.

No ignore la calidad del compuesto.

La pureza, la identidad, el almacenamiento y los ciclos repetidos de congelación y descongelación pueden alterar el comportamiento de un compuesto.

Un stock degradado puede presentar una actividad no especificada en el perfil del producto. El material mal disuelto también puede generar una exposición desigual entre los pozos. Generalmente, es más seguro usar alícuotas pequeñas que abrir el mismo tubo de stock varias veces.

Solarbio trabaja en reactivos para ciencias de la vida desde 2004 y suministra compuestos de moléculas pequeñas, reactivos bioquímicos, anticuerpos, kits de ensayo y herramientas de investigación relacionadas. Puede encontrar información sobre la empresa y la calidad en el sitio web. Página de la empresa Solarbio, mientras que las actualizaciones de productos e investigaciones se comparten en el centro de noticias.

Conclusión

El problema habitual de los efectos fuera del objetivo no es que arruinen un experimento por completo, sino que conducen a conclusiones erróneas sobre el objetivo real. Por lo general, los resultados parecen correctos.

Las comprobaciones principales no son complicadas. Utilice una curva dosis-respuesta real. Manténgase cerca de la concentración mínima efectiva. Compare diferentes inhibidores. Añada controles genéticos cuando sea posible. Utilice un segundo ensayo basado en otro principio. Compruebe si el compuesto interfiere con la química de detección.

Estos pasos requieren más tiempo antes de que comience el estudio principal, pero suelen ser más económicos que reconstruir el proyecto posteriormente. Para obtener ayuda con la selección de compuestos, la correspondencia de ensayos o la validación de objetivos, los investigadores pueden Contacta con Solarbio.

Preguntas frecuentes

¿Qué es un efecto fuera de objetivo en un experimento con moléculas pequeñas?

Un efecto fuera de objetivo se produce cuando un compuesto interactúa con proteínas distintas de la diana prevista. Estas interacciones adicionales pueden alterar el crecimiento celular, la señalización, el metabolismo o los resultados de los ensayos.

¿Un fenotipo marcado significa que el inhibidor está funcionando bien?

No siempre. Un fenotipo marcado puede deberse a la toxicidad de dosis altas, a una inhibición generalizada de la quinasa, a daño mitocondrial o a interferencias en el ensayo. El resultado debe verificarse a concentraciones más bajas y con otro método de validación.

¿Cuántas concentraciones de inhibidores se deben analizar?

Una curva completa de dosis-respuesta es mejor que una o dos dosis. El rango debe abarcar concentraciones por debajo y por encima de la potencia objetivo esperada sin adentrarse demasiado en un rango claramente tóxico.

¿Puede la técnica CRISPR de eliminación génica sustituir la validación mediante moléculas pequeñas?

No. La inhibición química y la eliminación genética responden a preguntas relacionadas, pero diferentes. El uso de ambas ofrece una visión más completa, ya que los compuestos actúan con rapidez, mientras que la eliminación genética puede provocar una adaptación celular a largo plazo.

¿Por qué dos inhibidores deberían tener estructuras químicas diferentes?

Los inhibidores estructuralmente similares pueden presentar la misma actividad fuera de objetivo. Las diferentes estructuras reducen la probabilidad de que ambos compuestos generen el mismo fenotipo falso por la misma razón no relacionada.

¿Cómo puedo comprobar si un compuesto interfiere con un ensayo de viabilidad?

Realice un control solo con el compuesto, sin células. Si la señal del ensayo cambia, es posible que el compuesto esté reaccionando con el colorante o con el reactivo de detección. En ese caso, deberá utilizarse un segundo ensayo basado en otro método.