Comment choisir le milieu de congélation cellulaire adapté pour une meilleure récupération cellulaire

La conservation de cellules fixées semble être une tâche de laboratoire relativement simple. Il est très frustrant de constater qu'une culture précieuse ne se rétablit pas après une conservation prolongée. Au début, les cellules décongelées paraissent en bon état dans le milieu qui a décongelé avec elles. Plus tard, elles adhèrent lentement au fond de la boîte de culture, commencent à se diviser de façon irrégulière, voire pas du tout. La plupart des chercheurs incriminent le réservoir d'azote liquide ou la méthode de décongélation. Mais bien souvent, la cause de tous les problèmes se situe bien plus loin.

L'état des cellules avant la congélation, le système cryoprotecteur, l'exposition au DMSO, la densité de congélation et le milieu de congélation lui-même influencent tous ce qui se passe après la décongélation.

C’est pourquoi le milieu de congélation cellulaire ne doit pas être négligé. Une bonne formulation doit protéger les cellules pendant le refroidissement sans créer de stress supplémentaire. Solarbio fournit des réactifs de biologie cellulaire et des produits de culture associés via son vaste réseau de distribution. Gamme de produits Solarbio, y compris différentes formulations de cryoconservation pour les lignées cellulaires de routine, les cellules sensibles, les cellules immunitaires, les cellules souches et d'autres modèles de recherche.

Pourquoi le milieu de congélation cellulaire est-il si important ?

Les dommages causés par le gel commencent avant même que les cellules n'atteignent l'azote liquide.

Les cellules ne sont pas endommagées simplement parce qu'elles refroidissent. La formation de glace constitue un problème majeur.

Des cristaux peuvent se former à l'intérieur des cellules et dans l'espace intercellulaire. Ils peuvent causer de graves dommages aux membranes et aux structures internes des cellules. Lors du refroidissement, les cellules subissent un stress osmotique. L'eau entre et sort des cellules. La solution extracellulaire environnante se concentre progressivement.

Un milieu de cryoconservation est conçu pour réduire ces stress. Il offre aux cellules de meilleures chances de survie lors de la congélation et de la décongélation.

Les chercheurs qui souhaitent une vue d'ensemble du processus de congélation complet peuvent également consulter le Guide de cryoconservation cellulaire : Comment congeler des cellules et préserver votre culture de sauvegarde, qui couvre l'état des cellules, la densité de congélation, le refroidissement, le stockage et la récupération après décongélation.

Le DMSO est utile, mais il nécessite une manipulation soigneuse.

Le DMSO est l'un des cryoprotecteurs les plus courants en culture cellulaire. Solarbio DMSO (diméthylsulfoxyde) (qualité culture cellulaire) Il est couramment utilisé en culture cellulaire et peut pénétrer dans les cellules pour limiter la formation de glace lors du refroidissement. C'est pourquoi de nombreuses solutions de congélation classiques contiennent du DMSO.

Le DMSO présente à la fois des avantages et des inconvénients. Il protège les cellules à basse température, mais une exposition prolongée à température ambiante peut réduire leur viabilité. Une fois le milieu de congélation contenant du DMSO mélangé à la suspension cellulaire, il convient d'éviter toute manipulation inutile.

Si vous préférez une formulation prête à l'emploi et standardisée, Milieu de cryoconservation Solarbio peut être utilisé comme composant d'une procédure typique de conservation de cellules de mammifères.

Faut-il choisir un milieu de congélation contenant du sérum ou un milieu sans sérum ?

Les formules contenant du sérum sont familières mais moins bien définies.

Un milieu de congélation contenant du sérum reste largement utilisé. L'association classique de sérum et de DMSO est compatible avec de nombreuses lignées cellulaires de mammifères et est employée en laboratoire depuis des années.

La principale limite de ce système est la variabilité d'un lot à l'autre.

Le sérum contient des protéines, des hormones, des facteurs de croissance, des lipides et de nombreux autres composants biologiques. Leur concentration peut varier selon la source et le lot. Une lignée cellulaire qui se développe bien avec un lot donné peut réagir différemment après un changement de lot en laboratoire.

Il existe aussi des projets où l'utilisation de composants d'origine animale est tout simplement proscrite. La recherche sur les cellules souches, les travaux liés à la thérapie cellulaire, les études sur les cellules immunitaires sensibles et les systèmes de culture plus contrôlés bénéficient souvent d'un environnement de congélation plus précis.

Les milieux sans sérum facilitent le contrôle du système.

Un milieu de congélation sans sérum élimine la variabilité liée au sérum. Cela facilite la standardisation du protocole de conservation cellulaire entre différents lots et opérateurs.

Cela permet également de gagner du temps. Il n'est plus nécessaire de préparer un mélange sérum/DMSO à chaque congélation cellulaire. Un milieu prêt à l'emploi réduit les petites erreurs de préparation, fréquentes lors d'une journée de culture chargée.

Pour les chercheurs qui souhaitent conserver le DMSO dans la formulation tout en éliminant le sérum, Milieu de congélation cellulaire sans sérum (avec rouge de phénol) offre une option définie avec un indicateur de pH visible.

Ce type de formulation peut convenir à la culture cellulaire de routine où la variation du sérum est un problème, mais où la cryoprotection par DMSO reste acceptable.

Le rouge de phénol est-il important dans un milieu de cryoconservation ?

Le rouge de phénol peut être utile pour les manipulations courantes.

Le rouge de phénol est bien connu de tous ceux qui travaillent avec des milieux de culture cellulaire. Il permet de visualiser rapidement les changements dans l'environnement du milieu.

Pour les opérations de congélation et de décongélation de base, cela peut s'avérer pratique. Cela ne remplace pas un contrôle rigoureux du pH, mais offre à l'opérateur un repère visuel immédiat lors des manipulations courantes.

Le choix devient différent lorsque la détection en aval est sensible à la couleur de fond.

Les formules sans rouge de phénol sont plus performantes dans certains cas de détection.

Si les cellules récupérées doivent être utilisées pour l'imagerie par fluorescence, des mesures basées sur la couleur ou un autre test où les interférences de fond sont importantes, un système sans rouge de phénol peut être préférable.

Solarbio Congélation cellulaire sans sérum (sans rouge de phénol) il est conçu pour répondre à ce type d'exigence tout en maintenant le système de congélation exempt de sérum.

L'important n'est pas de choisir le rouge de phénol ou son absence simplement parce que l'un semble plus sophistiqué. Il faut l'adapter à l'étape suivante, après décongélation. Une expérience standard d'expansion cellulaire et un dosage optique sensible ne nécessitent pas toujours la même formulation.

Quand la cryoconservation cellulaire sans DMSO est-elle judicieuse ?

Certaines cellules et certains flux de travail nécessitent un système cryoprotecteur différent

Le DMSO est largement utilisé, mais cela ne signifie pas que chaque modèle de cellule doive automatiquement l'utiliser.

Certaines cellules sensibles récupèrent mal après une exposition au DMSO. Dans d'autres projets, les chercheurs souhaitent réduire la quantité de DMSO résiduel dans les cultures ultérieures. Ceci peut s'avérer crucial dans les travaux sur les cellules souches, les applications sur les cellules immunitaires ou les recherches où la fonction cellulaire post-décongélation est plus importante que le simple comptage des cellules survivantes.

Un milieu sans DMSO utilise une autre formulation protectrice au lieu du système DMSO standard. Le choix final doit néanmoins être testé sur le type cellulaire concerné, car « sans DMSO » ne signifie pas automatiquement « meilleur pour toutes les cellules ».

Pour les flux de travail sur les cellules souches où l'évitement du DMSO est une véritable exigence, Milieu de cryoconservation des cellules souches (sans DMSO) est une option qui peut être évaluée par un petit test de récupération avant la préparation de banques de cellules plus importantes.

Les cellules sensibles doivent être évaluées selon la qualité de leur récupération, et non selon un seul chiffre.

La viabilité après décongélation est utile, mais elle ne fait pas tout.

Une population cellulaire peut présenter une viabilité élevée immédiatement après décongélation, tout en continuant à se développer faiblement au cours des deux jours suivants. Les cellules souches peuvent survivre, mais perdre les caractéristiques nécessaires à leur différenciation ultérieure. Les cellules immunitaires peuvent rester viables, mais présenter des réponses fonctionnelles affaiblies.

C’est pourquoi la récupération doit être vérifiée par l’analyse de la morphologie cellulaire, du comportement d’attachement ou de suspension, de la prolifération et du principal marqueur fonctionnel utilisé dans le projet.

L'identité cellulaire et l'historique des passages sont également importants. Les données précédemment publiées Lignées cellulaires : la première étape vers une recherche in vitro fiable explique pourquoi les semences précoces, le contrôle des passages, l'identité cellulaire et le statut mycoplasmique sont étroitement liés à un travail in vitro reproductible.

Comment choisir un milieu de congélation pour différentes cellules ?

Les lignées cellulaires de routine nécessitent généralement simplicité et reproductibilité.

Pour les lignées cellulaires les plus couramment utilisées comme A549, CHO, Jurkat et bien d'autres fréquemment utilisées en recherche, l'exigence principale est la récupération des cellules et la simplicité du processus de congélation.

Un milieu prêt à l'emploi peut s'avérer judicieux lorsque plusieurs opérateurs partagent la même banque de cellules. Comme tous suivent la même formule, le résultat dépend moins de la personne qui a préparé la solution de congélation ce jour-là.

L'état initial des cellules reste important. Les cellules saines en phase de croissance exponentielle se congèlent généralement mieux que les cultures surpeuplées, contaminées ou fortement stressées. Un bon milieu de culture ne peut pas compenser une mauvaise culture initiale.

Les cellules souches et les cellules immunitaires méritent une attention accrue.

Les iPSC, les autres cellules souches, les PBMC, les cellules NK, les cellules αβ-T, les cellules γδ-T et les modèles de cellules immunitaires apparentés sont souvent moins tolérants.

La question ne se limite pas à la survie des cellules. Les chercheurs peuvent avoir besoin de préserver leur caractère souche, leur potentiel de différenciation, leurs marqueurs de surface, leur réponse aux cytokines, leur capacité d'expansion ou d'autres propriétés fonctionnelles.

C’est là que les milieux de congélation spécifiques à un type cellulaire ou à une application particulière prennent toute leur importance. Solarbio propose différentes formulations répondant aux besoins de cryoconservation cellulaire de routine, sans sérum, avec ou sans DMSO, ainsi qu’aux besoins spécifiques.

Lorsque le modèle est inhabituel ou que plusieurs formulations sont envisageables, une comparaison à petite échelle est moins coûteuse que la découverte d'un problème après la congélation d'une vaste banque de cellules. Les chercheurs peuvent utiliser Service technique Solarbio pour la sélection des produits et l'assistance à l'application lors de l'adaptation d'un système de cryoconservation à un modèle cellulaire spécifique.

Conclusion

Un bon milieu de congélation cellulaire ne se contente pas de maintenir les cellules en vie pendant le stockage. Il permet de préserver un point de départ utilisable pour l'expérience suivante.

Les milieux contenant du sérum restent pratiques pour de nombreuses lignées cellulaires courantes. Les milieux sans sérum réduisent la variabilité liée au sérum et assurent une préparation plus homogène. Les produits sans rouge de phénol conviennent aux protocoles où la coloration de fond est indésirable. Les formulations sans DMSO offrent aux laboratoires une alternative pour les cellules sensibles ou les projets nécessitant une réduction de l'exposition au DMSO.

Il n'existe pas de milieu de congélation unique optimal pour toutes les cellules.

Commencez par identifier le type cellulaire et l'expérience en aval. Vérifiez l'état de la culture avant congélation. Si du DMSO est présent, contrôlez son exposition. Après décongélation, évaluez le résultat en prenant en compte d'autres critères que la seule viabilité immédiate.

Lorsque le bon milieu de culture et une bonne manipulation des cellules sont utilisés conjointement, les stocks congelés deviennent ce qu'ils sont censés être : une sauvegarde fiable au lieu d'une autre source d'incertitude.

FAQ (questions fréquentes)

Q1 : Quel est l'objectif principal du milieu de congélation cellulaire ?

A1 : Le milieu de congélation cellulaire protège les cellules de la formation de cristaux de glace, du stress osmotique et d’autres dommages pendant le refroidissement et la conservation à l’état congelé. Son but est d’améliorer la survie et la récupération fonctionnelle après décongélation.

Q2 : Un milieu de congélation cellulaire sans sérum est-il meilleur qu'un milieu contenant du sérum ?

A2 : Pas systématiquement. Les milieux sans sérum offrent une formulation plus précise et réduisent la variabilité entre les lots de sérum. Les milieux contenant du sérum peuvent néanmoins convenir à de nombreuses lignées cellulaires courantes. Le choix optimal dépend du modèle cellulaire et de l’application en aval souhaitée.

Q3 : Pourquoi utilise-t-on du DMSO dans la cryoconservation cellulaire ?

A3 : Le DMSO agit comme cryoprotecteur. Il pénètre dans les cellules et contribue à réduire la formation de cristaux de glace nocifs lors du refroidissement. Le DMSO pouvant également affecter la viabilité cellulaire lors d’une exposition prolongée à des températures plus élevées, la manipulation des cellules doit être effectuée avec précaution après son ajout.

Q4 : Quand dois-je envisager un milieu de congélation sans DMSO ?

A4 : Une formulation sans DMSO peut s’avérer utile pour les cellules sensibles au DMSO, la recherche sur les cellules souches, les protocoles de manipulation de cellules immunitaires ou les expériences où des résidus de DMSO pourraient affecter les applications ultérieures. La récupération doit néanmoins être validée avec le type cellulaire utilisé.

Q5 : Le rouge de phénol a-t-il un effet sur la congélation cellulaire ?

A5 : Le rouge de phénol est principalement un indicateur de pH et non le principal agent cryoprotecteur. Une formulation sans rouge de phénol peut être préférable lorsque les cellules récupérées sont utilisées dans des tests colorimétriques ou de fluorescence.

Q6 : Le même milieu de congélation peut-il être utilisé pour les iPSC, les PBMC, les cellules NK et les lignées cellulaires courantes ?

A6 : Certaines formulations générales peuvent convenir à plusieurs types cellulaires, mais les cellules sensibles nécessitent souvent des conditions plus spécifiques. La viabilité et la fonction des cellules iPSC, PBMC, NK, T et autres modèles spécialisés doivent être testées après décongélation avant la constitution d’une banque cellulaire de grande envergure.

Q7 : Pourquoi les cellules peuvent-elles encore mal récupérer même lorsqu'un bon milieu de congélation est utilisé ?

A7 : Le problème peut survenir avant la congélation. Une confluence cellulaire excessive, une contamination, une faible viabilité avant congélation, une digestion excessive, une densité cellulaire inadaptée, une exposition prolongée au DMSO, un mauvais contrôle du refroidissement ou une décongélation incorrecte peuvent tous réduire la récupération.

Q8 : Que faut-il vérifier après la décongélation des cellules ?

A8 : Vérifier immédiatement la viabilité, la morphologie, l’adhérence ou le comportement en suspension, la prolifération et tout marqueur fonctionnel important. Les cellules sensibles peuvent nécessiter de 24 à 72 heures avant que leur état de récupération ne soit pleinement visible.