Объяснение действия HDAC: как гистоновые деацетилазы контролируют экспрессию генов

Мутация изменяет функцию гена. Это хорошо известно большинству исследователей. Однако регуляция генов клеткой гораздо сложнее, поскольку гены могут быть активированы, подавлены или даже полностью репрессированы клеткой, и всё это без изменения последовательности ДНК.

В этом контроле участвуют гистоновые деацетилазы, обычно называемые HDAC. Они изменяют состояние ацетилирования гистонов и многих других белков. В результате это может влиять на упаковку хроматина, транскрипцию, рост клеток, метаболизм, иммунную сигнализацию и реакции на стресс.

Что такое HDAC и как он влияет на хроматин?

Ацетилирование гистонов ослабляет упаковку ДНК.

ДНК в ядре не растворяется в виде свободных молекул, а упаковывается в хроматин, который состоит из ДНК и гистоновых белков. Лизиновые остатки на гистоновых хвостах могут быть ацетилированы ацетильными группами. Чем больше ацетильных групп добавляется к гистоновым хвостам, тем слабее положительный заряд в этих областях.

В результате связь между гистонами и отрицательно заряженной ДНК ослабевает. Факторы транскрипции и РНК-полимераза имеют больше шансов достичь гена.

Следует отметить, что ацетилирование гистонов не активирует все гены в непосредственной близости. Дополнительные гены будут активированы соответствующими промоторами, факторами транскрипции и т. д. в соответствующих типах клеток. Дополнительные белки хроматина также будут преобладать над ацетилированными гистонами, открывая локальные участки хроматина. Это обеспечивает доступ для транскрипционного аппарата, но само по себе не определяет весь результат.

HDAC удаляют ацетильные группы

Ферменты HDAC обращают это изменение вспять. Они удаляют ацетильные группы из лизинов гистонов. После удаления ацетильной группы лизин снова приобретает более сильный положительный заряд. Гистоны могут более прочно удерживать ДНК, и доступ к хроматину может стать затруднен.

Именно поэтому HDAC часто связывают с более низкой транскрипцией генов. В некоторых статьях их называют ферментами, подавляющими гены. Это описание не совсем неверно, но несколько упрощено.

HDAC обычно взаимодействует с другими белками. Его эффект зависит от комплекса, к которому он присоединяется, и от клетки, в которой этот комплекс активен. Один и тот же ингибитор может давать один результат в линии опухолевых клеток и другой — в первичных иммунных клетках. Одного названия соединения недостаточно.

Гистоны — не единственные мишени.

HDAC также воздействуют на негистоновые белки. К ним относятся факторы транскрипции, белки цитоскелета, молекулярные шапероны и белки, участвующие в репарации ДНК. Удаление ацетильной группы может изменить стабильность, локализацию, связывающих партнеров или активность белка.

HDAC6 — хороший тому пример. Большая часть его работы связана с цитоплазматическими белками, такими как альфа-тубулин. Он также участвует в транспорте белков и контроле качества белков.

Исследователь, изучающий HDAC6, может получить очень мало информации, измеряя только ацетилирование гистонов. Более полезными могут оказаться ацетилированный альфа-тубулин, агрегация белков, движение клеток или маркеры связанных с ним сигнальных путей. Более широкий спектр возможностей Solarbio каталог исследовательской продукции Включает соединения, антитела, наборы и вспомогательные реагенты для этих комбинированных рабочих процессов.

Чем отличаются основные семейства HDAC?

HDAC класса I тесно связаны с транскрипцией.

HDAC1, 2, 3 и 8 относятся к классу I HDAC. Они преимущественно находятся в ядре и хорошо изучены с точки зрения их роли в транскрипции, а также в контроле клеточного цикла, пролиферации, дифференцировке и апоптозе.

HDAC1 и HDAC2 часто входят в состав крупных репрессорных комплексов. Для полной активности HDAC3 также необходимы взаимодействующие белки. Он не просто беспорядочно перемещается по ядру, удаляя ацетильные группы.

Это важно при анализе результатов воздействия ингибитора. Ингибитор класса I потенциально может модулировать экспрессию большого числа генов. Он может вызывать переход клеток в фазу замедленного роста по таким причинам, как остановка клеточного цикла, апоптоз или стресс, и эта фаза замедленного роста может быть вызвана множеством причин. Для того чтобы сделать окончательный вывод, необходимо более подробно изучить влияние ацетилатора гистонов на ацетилирование гистонов и экспрессию целевых генов.

Классы II и IV работают по-разному.

HDAC класса IIa представляют собой подгруппу гистоновых деацетилаз класса II, включающую HDAC4, HDAC5, HDAC7 и HDAC9. Эти белки находятся в ядре или цитоплазме и могут быть очень подвижными и транзитными между двумя компартментами, особенно в ответ на сигнальные события. Эти ферменты являются относительно слабыми каталитическими единицами, но образуют стабильные мультибелковые комплексы с другими белками.

К классу IIb относятся ферменты HDAC6 и HDAC10. О HDAC6 известно больше, поскольку это единственный представитель семейства ферментов HDAC, обладающий двумя каталитическими доменами. Также известно, что он связан с альфа-тубулином микротрубочек и с различными этапами транспорта белков и белкового гомеостаза.

HDAC11 занимает особое место в IV классе. Его роль в регуляции иммунной системы и метаболизме все еще изучается. Когда проект фокусируется на одном классе HDAC, а не на общей деацетилазной активности, это помогает проверить связанные с ним аспекты. сигнальные пути перед выбором ингибитора и нижестоящих маркеров.

Сиртуины используют NAD+ вместо цинка.

SIRT1–SIRT7 в совокупности известны как HDAC класса III. Это деацетилазы, которые отличаются от других HDAC по механизму действия и химии реакции. Большинство других HDAC называют «цинкозависимыми», потому что их активный центр содержит ион цинка, который непосредственно участвует в удалении ацетильной группы из субстрата. Сиртуины же используют вместо этого NAD+.

Эта связь с НАД+ позволяет использовать сиртуины в исследованиях, посвященных питательному статусу, метаболизму глюкозы и липидов, окислительному стрессу, митохондриям и старению. Их локализация также варьируется. Некоторые в основном работают в ядре, в то время как другие более тесно связаны с цитоплазмой или митохондриями.

Эксперимент с SIRT1 не должен просто копировать эксперимент с SIRT3. Субстраты разные. Место проведения другое. Результаты также должны быть разными. Для SIRT3 могут быть полезны митохондриальное ацетилирование и маркеры дыхания. Для SIRT1 больше внимания следует уделить ядерным мишеням и метаболической сигнализации.

Как катализ HDAC влияет на выбор ингибитора?

Цинк-зависимые HDAC имеют общую основную реакцию.

HDAC I, II и IV классов в основном используют цинк в своем каталитическом кармане. Ацетилированный лизин входит в активный центр. Цинк помогает расположить ацетильную группу и молекулу воды. Аминокислоты в ферменте активируют воду, которая затем атакует ацетильную группу.

Высвобождается ацетат, и лизин возвращается в деацетилированное состояние.

Многие ингибиторы HDAC разработаны с учетом особенностей этого кармана. Одна часть молекулы взаимодействует с цинковым участком. Другие части помогают соединению проникнуть в канал и влияют на то, насколько хорошо оно взаимодействует с различными подтипами HDAC.

Два соединения могут иметь маркировку «ингибитор HDAC», но при этом вести себя в клетках совершенно по-разному. Сила связывания, охват подтипов, растворимость и клеточная проницаемость — все это может влиять на результат.

Сиртуины следуют другим химическим путем.

Сиртуины не используют ту же самую реакцию, центрированную на цинке. Они потребляют NAD+ в процессе деацетилирования. Проще говоря, NAD+ участвует в каталитических реакциях и подвергается разложению. Одновременно он переносит ацетильные группы с гистонов на свои собственные молекулы, в конечном итоге удаляя ацетильные группы. В результате процесса образуется никотинамид и продукт, родственный АДФ-рибозе.

Никотинамид часто используется в исследованиях, где ученые хотят снизить активность сиртуинов. Ресвератрол также встречается в работах, связанных с передачей сигналов и метаболизмом сиртуинов. Ни одно из этих соединений не следует рассматривать как идеальный переключатель, воздействующий только на одну мишень.

Клеточные соединения часто воздействуют на несколько белков одновременно. Доза также имеет значение. Низкая концентрация может вызывать достаточно сфокусированный ответ, в то время как более высокая концентрация приводит к несвязанному стрессу или нежелательным побочным эффектам.

Наиболее безопасный подход заключается в сочетании соединения с прямым целевым маркером или известным последующим ответом.

Селективность зависит от на условия труда

Вориностат обычно используется в качестве ингибитора широкого спектра действия HDAC. Риколиностат фигурирует во многих исследованиях, посвященных HDAC6. TMP195 часто связывают с исследованиями HDAC класса IIa.

Эти описания полезны при скрининге продуктов, но они не отменяют необходимости валидации. Соединение, которое кажется селективным в биохимическом анализе, может стать менее селективным при увеличении клеточной дозы.

Уровень растворителя — ещё одна распространённая проблема. Многие ингибиторы HDAC готовят в ДМСО. При добавлении слишком большого количества исходного раствора конечная концентрация ДМСО может повлиять на поведение мембран, метаболизм или выживаемость клеток. Контрольный раствор должен содержать такое же количество растворителя, как и все экспериментальные группы.

Перед приготовлением первой чашки Петри необходимо четко определить диапазон концентраций, время обработки, уровень носителя и маркер механизма действия.

Почему HDAC изучаются в контексте заболеваний и нормальной клеточной биологии?

Рост клеток зависит от контролируемой активности генов.

HDAC — это нормальные ферменты. Здоровым клеткам они необходимы. Они помогают контролировать активность генов, участвующих в росте, дифференцировке и апоптозе.

В процессе развития различные ткани следуют разным генным программам. Клетки печени, нервные клетки, мышечные клетки и иммунные клетки не используют одни и те же гены одновременно. Члены семейства HDAC помогают поддерживать эти закономерности.

Проблемы начинаются, когда нарушается баланс. В некоторых раковых клетках высокая или неправильно распределенная активность HDAC может подавлять активность генов, контролирующих рост. Ингибитор может помочь возобновить работу этих программ. Он также может влиять на многие другие гены, поэтому снижение жизнеспособности клеток само по себе не может объяснить этот механизм.

Сиртуины играют важную роль в метаболических изменениях.

Сиртуины часто изучаются исследователями при изучении метаболизма или митохондрий. Их зависимость от NAD+ означает, что их активность может изменяться в зависимости от энергетического и окислительно-восстановительного состояния клетки.

SIRT1 часто связывают с ядерной и метаболической сигнализацией. SIRT3 часто исследуют посредством ацетилирования митохондриальных белков. Другие сиртуины имеют свои собственные локализации и функции.

Обобщенное утверждение, например, «это соединение улучшает процесс старения», не очень полезно в лабораторных условиях. Лучше спросить, что именно изменилось. Было ли это изменение в производстве АТФ, митохондриальном мембранном потенциале, активных формах кислорода, дыхании или белке, реагирующем на стресс? Как только конечный результат станет ясен, эксперимент будет легче повторить.

В иммунных реакциях также участвует активность HDAC.

HDAC участвуют в активации Т-клеток, поведении макрофагов, выработке цитокинов и передаче воспалительных сигналов. Как чрезмерная, так и недостаточная активность могут нарушить баланс.

Один и тот же ингибитор может снижать маркеры воспаления в одной модели и ухудшать выживаемость клеток в другой. Первичные клетки особенно чувствительны к различиям между донорами, методам выделения и состоянию активации.

Для проектов, объединяющих соединения, антитела, анализы цитокинов или несколько типов образцов, Solarbio предлагает решения. техническое обслуживание Это может помочь в выборе методов анализа и планировании рабочего процесса. Цель состоит не в том, чтобы добавлять больше тестов просто так. Каждый тест должен отвечать на четкую часть исследовательского вопроса.

Как можно организовать более чистый эксперимент по HDAC?

Определите целевую аудиторию перед покупкой данного актива.

«Изучить ингибирование HDAC» — это не слишком сложный экспериментальный вопрос. Он слишком открытый. Лучше было бы задать другой вопрос: увеличивает ли ингибирование HDAC6 ацетилирование альфа-тубулина до того, как оно изменит миграцию клеток?

Уже это предложение многое вам говорит. Вам потребуется соединение, связанное с HDAC6, анализ ацетилированного альфа-тубулина, как минимум две временные точки и анализ миграции.

Клеточная модель должна экспрессировать целевой белок. По возможности проверьте исходный уровень с помощью ПЦР в реальном времени или вестерн-блоттинга. Отрицательный результат, полученный в модели с практически полным отсутствием экспрессии целевого белка, не доказывает неэффективность ингибитора.

Первичные клетки требуют дополнительного внимания. Происхождение донора, номер пассажа, условия выделения и состояние активации — все это может влиять на реакцию.

Используйте более одного индикатора показаний.

Жизнеспособность клеток легко измерить, но этот показатель не является специфическим. Более низкий сигнал может быть обусловлен апоптозом, остановкой клеточного цикла, подавлением метаболизма, повреждением мембраны или интерференцией в анализе.

В эксперименте с HDAC следует использовать маркер, более близкий к целевому. Для исследования класса I это может быть ацетилирование гистонов и экспрессия целевого гена. Для HDAC6 часто более полезен ацетилированный альфа-тубулин. Для сиртуинов лучше подойдут митохондриальные или связанные с NAD+ маркеры.

Для общего обнаружения гистонов используется Анти-гистонное H3.1 моноклональное антитело Может поддерживать рабочие процессы WB, IP, IF, IHC или ELISA в соответствии с перечисленными областями применения. Если эксперимент сосредоточен на конкретном сайте ацетилирования, по-прежнему требуется антитело, специфичное к модификации.

Сохраните простые элементы управления и полный.

Начните с разумного диапазона концентраций, а не с одной высокой дозы. Включите раннюю точку отсчета для ацетилирования и более позднюю точку отсчета для экспрессии генов или поведения клеток.

Необходимо наличие как необработанного контрольного образца, так и контрольного образца с растворителем. По возможности добавьте известный положительный контрольный образец. Второй ингибитор с другой химической структурой может помочь показать, соответствует ли результат целевому действию, а не является ли он результатом нецелевого действия одного из соединений.

Наиболее точные данные обычно показывают определенную последовательность. Сначала изменяется маркер ацетилирования. Затем изменяется метаболический путь. Позже проявляется клеточный фенотип.

Даже незначительные ошибки при обработке могут испортить всю последовательность. Повторные циклы замораживания-оттаивания, неправильный порядок разведения, длительное воздействие комнатной температуры или неравномерная плотность клеток могут привести к результату, который выглядит как биологический, но на самом деле является результатом технической обработки. Solarbio технические статьи и примечания по применению Перед первым запуском можно уточнить информацию о правилах обращения с продуктом и деталях анализа.

Поскольку проект по изучению HDAC редко сводится к простому приобретению одного ингибитора и измерению жизнеспособности клеток, вам, скорее всего, также понадобятся другие антитела, другие соединения, модулирующие сигнальные пути, и ряд анализов для мониторинга изменений в апоптозе, высвобождении цитокинов или маркерах митохондрий, и это лишь некоторые из них, прежде чем ваши данные начнут рассказывать вам связную историю.

Пекинская компания Solarbio Science & Technology Co., Ltd. Компания поставляет реагенты для биологических исследований с 2004 года. Ее каталог включает в себя низкомолекулярные соединения, антитела, наборы для ИФА, наборы для биохимических анализов, реагенты для клеточной биологии и сопутствующие услуги. Для исследователей, планирующих работу с несколькими вариантами результатов, компания предлагает широкий спектр услуг. Решения для исследований в области биологических наук Предоставьте полезную отправную точку.

Вывод

HDAC — это не простая группа ферментов, подавляющих экспрессию генов. Их работа зависит от класса фермента, клеточной локализации, каталитического механизма, белков-партнеров и модели, используемой в исследовании.

Надежный эксперимент с HDAC начинается с четко определенной мишени. Затем соединение сопоставляется с прямым молекулярным анализом, соответствующими контрольными образцами и последующим функциональным результатом. Когда эти части следуют одной и той же биологической линии, данные легче объяснить и гораздо легче воспроизвести.

ФАКВ

В1: Что означает HDAC?

A1: HDAC расшифровывается как гистоновая деацетилаза. Эти ферменты удаляют ацетильные группы из гистонов и других белков. Это может изменить структуру хроматина, поведение белков и экспрессию генов.

В2: Почему HDAC важны в эпигенетике?

A2: HDAC могут изменять активность генов, не изменяя последовательность ДНК. Удаляя ацетильные группы из гистонов, они часто делают хроматин более компактным и ограничивают доступ к определенным генам.

В3: Все ли HDAC одинаковы?

A3: Нет. HDAC делятся на несколько классов. Классы I, II и IV в основном используют каталитический механизм, зависящий от цинка. HDAC класса III, известные как сиртуины, зависят от NAD+.