Определение активности ингибитора трипсина: простой спектрофотометрический метод.

Об активности ингибитора трипсина легко упомянуть, но измерить её точно не всегда просто. Даже прозрачный экстракт сои может содержать большое количество активного ингибитора. В образце растения может быть высокий уровень белков, связанных с защитными механизмами, но это не означает фактическую блокировку активности трипсина.

Именно поэтому анализ активности полезен. Этот тест измеряет влияние ингибиторного белка на трипсин. Вместо измерения количества ингибиторного белка измеряется его влияние на трипсин. Цветовая реакция считывается с помощью спектрофотометра или микропланшетного ридера при длине волны 405 нм.

Данный метод подходит для анализа образцов пищевых продуктов, растительных тканей, кормовых материалов, очищенных белков и других исследовательских образцов. Лаборатории, которым необходимо сочетать этот тест с другими измерениями ферментов или белков, также могут ознакомиться с продукцией Solarbio. Решения для исследований в области биологических наук для сопутствующих товаров и поддержки рабочих процессов.

Что такое ингибитор трипсина?

Ингибитор трипсина — это белок/пептид, который может связываться с трипсином, снижая его ферментативную активность. Ингибиторы трипсина встречаются в растениях, животных и микроорганизмах.

Трипсин — это сериновая протеаза, способная расщеплять крупные пищевые белки на более мелкие пептиды. У животных трипсин вырабатывается поджелудочной железой в виде трипсиногена, неактивного предшественника. Трипсиноген активируется до трипсина в тонком кишечнике животных.

Эта стадия активации имеет значение. Трипсин в нашей пищеварительной системе очень полезен, но если бы этот фермент активировался в тканях других частей тела, он бы повредил эти ткани. Естественно, другие белки подавляют этот процесс.

У растений ингибиторы трипсина — это защитные белки, которые, например, могут препятствовать работе пищеварительных ферментов насекомых и других организмов, питающихся этим растением. Таким образом, молекулы этого типа могут изучаться в рамках физиологии пищеварения, пищевой промышленности, защиты растений и регуляции белков.

Ингибиторы трипсина типа Кунитца

Ингибиторы трипсина типа Кунитца представляют собой более крупные белки. Их молекулярная масса составляет 18-24 кДа. Эти ингибиторы обычно имеют один реактивный центр и 2-3 набора дисульфидных связей.

Многие ингибиторы протеиназ образуют комплекс 1:1 с одной молекулой трипсина. Комплекс между ингибитором и ферментом очень стабилен. Фермент в таком комплексе теряет значительную часть своей каталитической активности.

Бычий панкреатический трипсиновый ингибитор, также называемый BPTI или апротинином, является распространенным примером. Несколько ингибиторов протеиназ, выделенных из картофеля, также относятся к семейству Кунитца.

В исследованиях пищевых продуктов и кормов эти белки изучаются после термической обработки. Хотя количество ингибирующего белка сохраняется и после обработки, его активность может резко снизиться. Поэтому определение активности более целесообразно, чем определение общего содержания белка.

Ингибиторы трипсина Боумена-Бирка

Ингибиторы Боумена-Бирка имеют меньший размер, часто около 6–10 кДа. Их структура компактна и обычно содержит семь пар дисульфидных связей.

Одной из полезных особенностей является то, что они могут иметь два отдельных активных центра. Один центр может ингибировать трипсин, а другой — химотрипсин. Это обеспечивает им более широкий диапазон ингибирующего действия, чем многим ингибиторам с одним активным центром.

Они содержатся в сое, тыкве, маше, красной фасоли, подсолнечнике, гречихе и других растительных материалах. Их стабильная структура привлекла внимание как в пищевой науке, так и в исследованиях функциональных ингредиентов.

Зачем лабораториям измеряют активность ингибиторов трипсина?

Один и тот же тест может ответить на совершенно разные вопросы. Производитель продуктов питания может захотеть узнать, снизилась ли антипитательная активность при нагревании. Исследователь растений может захотеть сравнить устойчивость образцов к насекомым. Белковая лаборатория может проверять активность партии очищенного ингибитора.

Метод тестирования остается тем же, но способ интерпретации результатов зависит от проекта.

Переработка пищевых продуктов и кормов

Сырые соевые бобы и другие бобовые могут содержать заметное количество активного ингибитора трипсина. При употреблении этих продуктов без достаточной термической обработки эффективность переваривания белка может снизиться.

В ответ организм может начать вырабатывать больше пищеварительных ферментов. В долгосрочных исследованиях питания высокое потребление ингибиторов также связывали с изменениями в активности поджелудочной железы.

Нагревание снижает активность ингибитора, но большее количество тепла не всегда лучше. Если обработка слишком слабая, остается слишком много активного ингибитора. Если же она слишком сильная, полезные белки могут быть повреждены, а их питательная ценность может снизиться.

Анализ активности ингибитора трипсина помогает производителям контролировать этот баланс. Он дает прямой результат о том, какой ингибитор остается активным после обработки.

Компания Solarbio предлагает более широкий ассортимент продукции. наборы для биохимического анализа для лабораторий, которым необходимо измерять активность ферментов, метаболиты, маркеры окислительного стресса или другие свойства образцов в рамках одного проекта.

Исследования защиты растений

Растения могут увеличивать выработку ингибитора трипсина после питания насекомых или атаки патогенов. Ингибитор попадает в пищеварительную систему питающегося насекомого и блокирует часть его протеазной активности.

Это не всегда убивает насекомое напрямую. Чаще всего это снижает эффективность пищеварения. Рост может замедлиться, питание может измениться, а развитие может задержаться.

Исследователи могут сравнивать активность ингибиторов между сортами растений, группами обработки или в условиях стресса. Данные об экспрессии генов могут показать, активируется ли ген-ингибитор. Анализ активности показывает, остается ли продуцируемый белок функциональным.

Для проектов, связывающих активность ингибиторов с сигналами стресса или метаболическими изменениями, Solarbio предлагает решения. ресурсы для исследования путей может помочь в выборе родственных соединений, антител и реагентов для анализа.

Контроль протеаз в биологических моделях

Ингибиторы трипсина также играют защитную роль в организмах животных. SPINK1 — один из таких примеров. Он ограничивает преждевременную активацию трипсина в поджелудочной железе.

Когда этот механизм контроля нарушается, ткани поджелудочной железы могут подвергаться воздействию активных пищеварительных ферментов. Именно поэтому регуляция трипсина часто обсуждается в исследованиях панкреатита.

Апротинин и другие ингибиторы протеаз также изучались в условиях воспаления, ишемии, отека и других моделях. Для таких исследований обычно требуется более одного показателя. Более низкий уровень активности фермента может указывать на ингибирование, но это не объясняет всех последующих биологических изменений.

Как работает спектрофотометрический метод?

В основе химических реакций лежит несложная механика. Трипсин реагирует с хромогенным субстратом. В результате реакции образуется желтый продукт. Когда ингибитор блокирует трипсин, образуется меньше желтого продукта.

Солнечная биотехнология Набор для определения активности ингибитора трипсина BC6860/BC6865 основано на этом принципе.

BAPNA как хромогенный субстрат

BAPNA используется в качестве субстрата для трипсина. При гидролизе BAPNA трипсином высвобождается п-нитроанилин.

П-нитроанилин, часто обозначаемый как п-НА, имеет желтый цвет и может быть измерен при длине волны 405 нм. Более активный трипсин производит больше п-НА, поэтому поглощение становится выше.

Когда образец содержит ингибитор трипсина, часть фермента блокируется. Гидролизуется меньше BAPNA. Количество p-NA уменьшается, и показания абсорбции становятся ниже.

Таким образом, анализ измеряет остаточную активность трипсина после контакта с образцом. Он не окрашивает и не измеряет ингибитор напрямую.

Что означает низкий балл за чтение?

Более низкое значение поглощения обычно означает более сильное ингибирование, при условии, что контрольные реакции и реакции в холостом случае выполнены корректно.

Слабый ингибитор оставляет большую часть трипсина активной. Реакция сохраняет желтый цвет и дает более высокое значение. Сильный ингибитор блокирует больше фермента, поэтому образуется меньше желтого продукта.

В заключительном расчете проводится сравнение результатов реакции образца с необходимыми контрольными образцами. Результаты могут быть представлены в виде активности ингибитора, единиц ингибирования или активности, нормированной по массе образца или содержанию белка.

Образцы, выходящие за пределы рекомендуемого диапазона измерений, следует разбавить и протестировать повторно. Использование значения абсорбции, выходящего за пределы линейного диапазона, может привести к аккуратному, но ненадежному расчету.

Что обычно приводит к низкой воспроизводимости результатов?

Большинство проблем возникает не из-за самой идеи теста, а из-за неправильной обработки образцов.

Неравномерная экстракция образцов

Образцы растений и пищевых продуктов необходимо тщательно измельчить. Крупнозернистый или неравномерно измельченный образец может выделять различное количество ингибитора в разных частях.

Масса образца, объем экстракции, время перемешивания, температура экстракции и условия центрифугирования должны оставаться одинаковыми для всех групп. Изменение одного из этих параметров в середине партии может повлиять на результат.

Темные или мутные экстракты могут увеличивать фоновое поглощение. В этом случае полезен контрольный образец. Без него естественный цвет образца может быть ошибочно принят за продукт реакции.

Разница во времени между скважинами

Ферментативные реакции продолжаются во время манипуляций с планшетом или пробиркой. Если первый образец получает субстрат на несколько минут раньше последнего, разница может отразиться на конечном значении абсорбции.

Для больших планшетов многоканальная пипетка обычно упрощает контроль времени. При работе с пробирками может быть лучше обрабатывать меньшие группы образцов, а не начинать анализ всех образцов одновременно.

Температура тоже имеет значение. Активность трипсина может изменяться, если реагенты слишком долго находятся на столе или если пробирки с реагентами хранятся в разных условиях.

Лаборатории, работающие с необычными типами образцов, могут обратиться в компанию Solarbio. группа технического обслуживания о методах экстракции, разведения и подготовке к анализу.

Отсутствующие элементы управления

Одной пробирки недостаточно. Для проведения теста необходимы контрольные образцы для определения активности фермента, фонового содержания субстрата, цвета образца и других неферментативных изменений абсорбции.

Возникает соблазн удалить контрольный образец, чтобы сохранить лунки, особенно когда планшет почти заполнен. Обычно это приводит к проблемам в дальнейшем. Результат гораздо сложнее объяснить, когда вклад фонового излучения неизвестен.

Также следует включить технические повторы. Если значения в повторах сильно различаются, в первую очередь следует проверить пипетирование, перемешивание, время и прозрачность образца.

Какие сопутствующие анализы можно использовать вместе с этим тестом?

Активность ингибиторов трипсина зачастую является лишь одной из составляющих работы.

Набор для определения активности трипсина BC2310/BC2315 может быть полезен, когда в проекте необходимо измерить сам трипсин. Одновременное измерение активности фермента и активности ингибитора помогает разделить две разные ситуации: низкую активность трипсина и сильное ингибирование нормальной активности трипсина.

К другим сопутствующим продуктам относятся наборы для определения активности ингибитора ксантиноксидазы BC1020/BC1025, ингибитора α-глюкозидазы BC6380/BC6385 и ингибитора β-галактозидазы BC6450/BC6455.

Эти анализы полезны при скрининговых исследованиях, где сравниваются несколько ингибиторов ферментов в одних и тех же условиях анализа образцов или экстракции. Компания Solarbio также делится обновлениями продукции и информацией о применении через свои сервисы. раздел новостей исследований.

Почему для этого типа анализа следует использовать Solarbio?

Компания Solarbio поставляет продукцию для медико-биологических исследований с 2004 года. Ассортимент продукции включает в себя наборы для биохимических анализов, антитела, наборы ELISA, реагенты для клеточной биологии, красители, аналитические стандарты, молекулярные строительные блоки и низкомолекулярные соединения.

Компания работает в соответствии с системами управления ISO 13485, ISO 9001, ISO 14001 и ISO 45001. Ее испытательный центр имеет аккредитацию CNAS. Более подробная информация о компании, разработке продукции и системе качества доступна на сайте. О Solarbio страница.

Для стандартного ферментного анализа важны самые простые вещи: стабильные реагенты, понятный протокол, работоспособные контрольные образцы и специалист, способный ответить на вопросы, если образец ведет себя не так, как ожидалось. Именно это обычно определяет, будет ли второй анализ соответствовать первому.

Вывод

Анализ активности ингибитора трипсина измеряет, насколько образец блокирует трипсин. Трипсин гидролизует BAPNA и высвобождает желтый p-NA. Более сильное ингибирование означает меньшее количество p-NA, поэтому поглощение при 405 нм становится ниже.

Данный метод может быть использован для анализа сои, бобовых, растительной ткани, пищевых продуктов, кормов, очищенных ингибиторных препаратов и биологических образцов. Необходимо уделить внимание подготовке образцов и времени проведения реакции. То же самое касается контрольных реакций и холостых проб.

Набор для определения активности ингибитора трипсина BC6860/BC6865 предоставляет лабораториям простой спектрофотометрический вариант для этой работы. Исследователи, которые не уверены в совместимости образцов, условиях экстракции или аналогичных продуктах, могут обратиться за помощью. связаться с Solarbio перед настройкой первого запуска.

Часто задаваемые вопросы

В1: Что измеряет анализ активности ингибитора трипсина?

A1: Этот метод измеряет способность образца снижать активность трипсина. Результат отражает функциональное ингибирование, а не общее количество ингибирующего белка.

В2: Почему в тесте используется BAPNA?

A2: BAPNA является хромогенным субстратом для трипсина. Трипсин гидролизует его и высвобождает желтый п-нитроанилин, который можно измерить при длине волны 405 нм.

В3: Означает ли более низкое поглощение более сильное ингибирование?

A3: Да. При усилении ингибирования трипсина гидролизуется меньше BAPNA и образуется меньше п-нитроанилина. Следовательно, поглощение снижается.

Вопрос 4: Можно ли проводить анализ сои и других бобовых культур?

A4: Да. Сою, маш, красную фасоль и другие растительные материалы можно анализировать после соответствующей экстракции. Для образцов с измененным цветом или мутных образцов следует использовать подходящий контрольный образец.

В5: Почему результаты повторных измерений отличаются?

A5: К распространенным причинам относятся неравномерное измельчение, ошибки пипетирования, различное время реакции, изменения температуры, плохое перемешивание, мутность образца или неправильные настройки холостого образца.

В6: Является ли активность ингибитора трипсина тем же самым, что и активность трипсина?

A6: Нет. Активность трипсина измеряет, насколько хорошо фермент расщепляет свой субстрат. Активность ингибитора трипсина измеряет, насколько сильно образец снижает активность этого фермента.