Валидация пределов обнаружения (LOD) и количественного определения (LOQ) в ВЭЖХ: как обеспечить точные и соответствующие требованиям результаты.

В валидации методов ВЭЖХ пределы обнаружения (LOD) и количественного определения (LOQ) часто записываются как два простых значения чувствительности. В реальной лабораторной работе они значат гораздо больше. Эти два параметра показывают, может ли аналитический метод обнаруживать или количественно определять аналиты в низких концентрациях с достаточной степенью достоверности, особенно когда результаты будут использоваться для контроля качества, переноса метода, нормативного анализа или рутинного анализа проб.

Многие проблемы валидации возникают не из-за самой формулы. Обычно они проявляются на этапах подготовки образцов, выбора базовой линии, оценки матрицы или приготовления стандартных растворов. Метод может демонстрировать приемлемое соотношение сигнал/шум в чистом стандартном растворителе, но может оказаться неэффективным при добавлении реальных компонентов образца, потерь при извлечении, примесей или помех базовой линии.

Поэтому при валидации пределов обнаружения/количественного определения (LOD/LOQ) следует задавать не только вопрос о наличии пика. Более уместный вопрос: может ли данный метод обнаружить и количественно определить целевой аналит в низкой концентрации в исходной матрице образца?

В этой статье объясняется, как определять пределы обнаружения (LOD) и количественного определения (LOQ) в ВЭЖХ, как избегать распространенных ошибок и как создать более надежный рабочий процесс для получения точных хроматографических результатов.

Что такое LOD и LOQ в ВЭЖХ?

Предел обнаружения (LOD) — это наименьшая концентрация или количество аналита, которое может быть обнаружено в заданных аналитических условиях. В основном это качественный параметр. LOD подтверждает, что сигнал аналита можно отличить от фонового шума, но не доказывает, что аналит может быть измерен точно.

Проще говоря, предел обнаружения отвечает на один вопрос: можно ли обнаружить анализируемое вещество?

LOQ, или предел количественного определения, — это наименьшая концентрация или количество аналита, которое может быть количественно измерено с приемлемой точностью и прецизией. По сравнению с LOD, к LOQ предъявляются более высокие требования, поскольку он должен обеспечивать воспроизводимые и надежные числовые результаты.

LOQ отвечает на более строгий вопрос: можно ли точно количественно определить анализируемое вещество?

Основное различие заключается в том, что LOD (предел обнаружения) фокусируется на обнаруживаемости, а LOQ (предел количественного определения) — на количественной надежности. В валидации ВЭЖХ это различие важно, поскольку видимый пик не всегда подходит для определения концентрации.

LOD против LOQ: ключевые различия

Использование метода отношения сигнал/шум в ВЭЖХ

В хроматографическом анализе метод отношения сигнал/шум широко используется для оценки пределов обнаружения (LOD) и количественного определения (LOQ) на ранних этапах оценки метода. В типичном рабочем процессе ВЭЖХ аналитики готовят разбавленные стандартные растворы с низкой концентрацией, пропускают их через систему ВЭЖХ, просматривают хроматограммы и получают значение отношения сигнал/шум с помощью хроматографического программного обеспечения.

В качестве практического ориентира, предел обнаружения (LOD) обычно связан со значением отношения сигнал/шум примерно 3:1, тогда как предел количественного определения (LOQ) обычно связан со значением отношения сигнал/шум примерно 10:1.

Оценку можно записать в следующей форме:

Предел обнаружения (LOD) = Концентрация в исходном растворе × 3 / измеренное отношение сигнал/шум

LOQ = Концентрация в приготовленном растворе × 10 / измеренное отношение сигнал/шум

В ходе рутинной работы с ВЭЖХ аналитики часто проводят последовательное разбавление до тех пор, пока целевой пик не даст значение отношения сигнал/шум, близкое к 3 для предела обнаружения (LOD) или к 10 для предела количественного определения (LOQ). Это значение полезно для предварительной оценки, но его не следует рассматривать как окончательное доказательство надежности метода при данной концентрации.

Почему важен выбор исходного уровня

Распространенной причиной ошибок при определении LOD/LOQ является использование слишком сглаженного базового сегмента для измерения шума. Когда выбранное окно шума демонстрирует очень небольшие колебания, программное обеспечение может вычислить нереалистично низкое значение шума. Это может привести к тому, что сообщаемые значения LOD или LOQ будут казаться более чувствительными, чем реальные возможности метода.

Для надежного расчета отношения сигнал/шум шумовая область должна быть близка к времени удерживания целевого пика. Она должна быть свободна от мешающих пиков, но при этом отражать реальную хроматографическую базовую линию. Практическое шумовое окно часто составляет не менее пяти ширин пика, а во многих случаях используется 5–20 ширин пика.

Главное просто: не выбирайте базовую линию только потому, что она выглядит чистой. Выбранная область должна отражать фактический уровень шума вокруг пика аналита. В противном случае, окончательные значения LOD/LOQ могут выглядеть впечатляюще на бумаге, но оказаться неудовлетворительными при анализе реального образца.

Почему одного лишь серийного номера недостаточно для определения предела количественного определения (LOQ)

Соотношение сигнал/шум 10:1 не означает автоматически, что концентрация может быть принята в качестве предела количественного определения (LOQ). LOQ также должен соответствовать требованиям к точности и прецизионности. Если концентрация дает S/N = 10, но имеет низкую степень извлечения или нестабильные результаты повторных измерений, ее не следует использовать в качестве окончательного LOQ.

Эта проблема часто возникает при валидации методов ВЭЖХ, поскольку реальные образцы обычно содержат больше мешающих компонентов, чем стандартные растворители. В зависимости от типа образца, матрица может включать примеси, продукты разложения, эндогенные компоненты или соэлюирующие вещества. Эти компоненты могут изменять форму пика, сдвигать время удерживания, увеличивать шум базовой линии или изменять отклик детектора.

По этой причине проверка предела количественного определения (LOQ) не должна основываться только на оценке отношения сигнал/шум. Она также должна включать проверку степени извлечения с учетом матричного эффекта и проверку точности, чтобы подтвердить надежность количественного определения на низких уровнях концентрации в реальных образцах.

Как проверить точность определения предела количественного определения (LOQ) в ВЭЖХ

Используйте образцы с добавками, подобранные по матрице образца.

Стандартные растворы, приготовленные в чистом растворителе, полезны для первоначальной оценки, но они не могут в полной мере отражать реальные условия образца. Компоненты матрицы могут влиять на эффективность экстракции, стабильность аналита, хроматографическое разделение и отклик детектора.

Более практичный подход заключается в использовании контрольной матрицы, в которой подтверждено отсутствие целевого аналита. Затем в контрольную матрицу добавляется аналитический стандарт в предлагаемом уровне количественного определения (LOQ). После этого образец должен пройти полную процедуру пробоподготовки перед анализом методом ВЭЖХ.

Типичный рабочий процесс включает в себя:

Выберите подходящую пустую матрицу.

Добавьте целевой аналит в концентрации, соответствующей предлагаемому пределу количественного определения (LOQ).

Обработайте образец, используя полный метод подготовки.

Введите подготовленный образец в систему ВЭЖХ.

Рассчитайте восстановление и относительное стандартное отклонение.

К общепринятым практическим критериям приемлемости относятся степень извлечения в пределах 80–120% и относительное стандартное отклонение (RSD), как правило, не выше 10%. Однако эти значения не следует копировать механически. Окончательный диапазон приемлемости должен быть определен до начала валидации и должен соответствовать анализируемому веществу, матрице, назначению метода и нормативным требованиям.

Проверьте точность на уровне предела количественного определения (LOQ).

Воспроизводимость показывает, дает ли метод сопоставимые результаты в одинаковых лабораторных условиях. Обычно это означает использование одной и той же лаборатории, аналитика, прибора, в один и тот же день, при одном и том же типе образца и концентрации на уровне предела количественного определения (LOQ).

Для оценки воспроизводимости обычно используется не менее шести повторных измерений. Если относительное стандартное отклонение (RSD) слишком велико на предлагаемом уровне предела количественного определения (LOQ), LOQ следует повысить и повторно проверить до тех пор, пока точность не станет приемлемой.

При необходимости может также проводиться оценка промежуточной точности. Этот тест проверяет, сохраняет ли метод свою надежность при изменении условий, таких как разные дни, аналитики или приборы. Хотя промежуточная точность может допускать несколько больший разброс, чем повторяемость, метод все равно должен доказать, что количественное определение на низком уровне достаточно стабильно для его предполагаемого использования.

Контроль аналитического стандарта качества

Аналитический стандарт оказывает прямое влияние на валидацию пределов обнаружения (LOD) и количественного определения (LOQ). Если стандарт нечистый, нестабильный, неправильно взвешен, плохо растворен или деградировал, результат валидации будет ненадежным.

Для работы с пределами обнаружения/определения количественного определения (LOD/LOQ) в ВЭЖХ аналитические стандарты, как правило, должны иметь надлежащую чистоту, предпочтительно ≥98%, если это необходимо для конкретного применения. Они должны находиться в пределах срока годности, храниться в рекомендуемых условиях и точно взвешиваться с использованием подходящих аналитических весов. Стандарт также должен быть полностью растворен в совместимом растворителе.

Для соединений, чувствительных к свету, теплу, окислению или многократным циклам замораживания-оттаивания, рекомендуется использовать небольшие аликвоты. Это снижает риск деградации и повышает стабильность концентрации в процессе валидации.

Использование некачественных стандартов может привести к нестабильным калибровочным кривым, неточным показателям извлечения, ложным заявлениям о чувствительности и невоспроизводимым результатам определения предела количественного определения.

IDL против MDL: не путайте эти два понятия.

Предел обнаружения прибора (IDL) отражает возможности самого прибора по обнаружению. Обычно он определяется путем непосредственного введения разбавленных стандартных растворов. IDL в основном отвечает на вопрос: насколько чувствителен прибор в идеальных условиях?

Предел обнаружения метода (ПДМ) включает в себя весь аналитический процесс. Он учитывает экстракцию образца, очистку, разбавление, матричные помехи, отклик прибора и обработку данных. ПДМ обычно более актуален для анализа реальных образцов, поскольку отражает эффективность всего метода, а не только прибора.

Многие лаборатории указывают IDL, поскольку его проще получить, и он часто выглядит ниже. Однако IDL может быть недостижим в реальных образцах. Для практической валидации ВЭЖХ более информативным значением часто является MDL.

Распространенные ошибки при валидации пределов обнаружения/определения количественного определения (LOD/LOQ).

В процессе валидации ВЭЖХ неоднократно встречаются различные ошибки.

Первый способ — это указание только значений отношения сигнал/шум (S/N). S/N полезно, но предел количественного определения (LOQ) также должен подтверждаться данными о степени извлечения и точности.

Второй способ — использование стандартных растворителей вместо матричных образцов. Стандарты растворителей могут обеспечить более четкую базовую линию и лучшую форму пиков, чем реальные образцы, которые могут переоценивать чувствительность метода.

Третий фактор — выбор нереалистично спокойного базового диапазона. Это может привести к тому, что рассчитанные значения LOD и LOQ будут казаться ниже, чем они есть на самом деле.

Четвертая причина – игнорирование стабильности стандартов. Деградировавшие стандарты или многократно замороженные и размороженные растворы могут привести к неправильному определению концентрации.

Пятая ошибка заключается в путанице между IDL и MDL. Возможности прибора не равны возможностям всего метода.

Практический алгоритм валидации пределов обнаружения/определения (LOD/LOQ) методом ВЭЖХ

Надежный рабочий процесс может следовать следующему порядку:

Подготовьте высококачественный аналитический стандартный раствор.

Подготовьте серийные разведения вблизи ожидаемого диапазона низких концентраций.

Введите данные для каждого уровня и оцените форму пика и отношение сигнал/шум.

Оцените предел обнаружения (LOD) приблизительно при соотношении сигнал/шум (S/N) = 3.

Оцените предел количественного определения (LOQ) приблизительно при соотношении сигнал/шум (S/N) = 10.

Подготовьте образцы, соответствующие матрице образца, на предлагаемом уровне количественного определения (LOQ).

Проанализируйте не менее шести повторов.

Рассчитайте восстановление и относительное стандартное отклонение.

Подтвердите, соответствуют ли точность и достоверность заранее определенным критериям.

Если критерии не соблюдены, повысьте концентрацию, соответствующую пределу количественного определения (LOQ), и повторите проверку.

Этот алгоритм не сложен, но помогает предотвратить распространенную проблему: принятие низкой концентрации слишком рано просто потому, что на хроматограмме виден пик.

Как аналитические стандарты обеспечивают надежную валидацию ВЭЖХ.

Надежные аналитические стандарты необходимы для точного определения пределов обнаружения (LOD) и количественного определения (LOQ). При разработке методов ВЭЖХ стандарты используются для калибровки, проверки степени извлечения, оценки пригодности системы и проверки чувствительности.

Компания Solarbio предоставляет аналитические стандарты. стандартные решения, Стандарты, меченные стабильными изотопами, и соответствующая техническая поддержка для хроматографического анализа. Для исследовательских и испытательных лабораторий стандарты высокой чистоты с прослеживаемой документацией качества могут помочь снизить неопределенность при валидации метода.

Аналитические стандарты Solarbio поддерживаются многомерными методами оценки качества, такими как ВЭЖХ, ЯМР и МС. Компания также оказывает техническую поддержку в выборе стандартов и проведении ВЭЖХ. услуги тестирования для сложных образцов. Эти ресурсы полезны, когда лабораториям необходимо получить более достоверные хроматографические данные низкого уровня.

Почему стоит выбрать аналитические стандарты Solarbio?

Соларбио Компания предлагает широкий выбор аналитических стандартов и постоянно разрабатывает продукцию в соответствии с меняющимися потребностями лабораторий. Стандарты оцениваются с помощью различных методов, таких как ВЭЖХ, ЯМР и МС, для обеспечения контроля качества.

Для лабораторий, нуждающихся в помощи с настройкой методики, Solarbio также может оказать поддержку в выборе стандартов, растворителей, предоставлении рекомендаций по подготовке образцов и оптимизации хроматографических условий. Для сложных образцов доступны услуги ВЭЖХ-анализа, которые помогут получить более точные и надежные данные.

Solarbio центр диагностики Компания получила сертификат ISO/IEC 17025, что подтверждает более высокое качество аналитических данных и гарантию качества.

Вывод

Валидация пределов обнаружения (LOD) и количественного определения (LOQ) в ВЭЖХ не должна сводиться к простому расчету отношения сигнал/шум. Надежный процесс валидации должен включать правильный выбор базовой линии, оценку отношения сигнал/шум, определение степени извлечения с учетом матричного эффекта, проверку точности и контроль качества аналитических стандартов.

Предел обнаружения (LOD) показывает, может ли аналит быть обнаружен. Предел количественного определения (LOQ) доказывает, может ли аналит быть количественно определен с приемлемой точностью и прецизией. Для анализа реальных образцов способность метода к обнаружению важнее, чем идеальная чувствительность прибора.

Используя подходящие матрицы, стабильные стандарты и полный рабочий процесс валидации, лаборатории могут избежать распространенных ошибок определения пределов обнаружения/определения количественного определения и получать хроматографические данные, которые являются более точными, воспроизводимыми и легче поддаются проверке. Для получения дополнительной информации о валидации хроматографии и обновлениях рабочих процессов лабораторий посетите раздел технических статей Solarbio или связаться с Solarbio для выбора продукции и поддержки тестирования.

Часто задаваемые вопросы

В1: Почему предел количественного определения (LOQ) следует проверять с помощью образцов, соответствующих матрице образца?

A1: Реальные матрицы образцов могут влиять на эффективность экстракции, форму пика, уровень фонового шума и отклик детектора. Образцы, соответствующие матрице образца, позволяют приблизить проверку предела количественного определения к реальным условиям тестирования.

В2: Какой диапазон восстановления обычно считается приемлемым на уровне предела количественного определения (LOQ)?

A2: Практический диапазон извлечения часто составляет 80–120%, но окончательные критерии должны быть определены в соответствии с анализируемым веществом, матрицей, целью метода и нормативными требованиями.

В3: Сколько повторных измерений рекомендуется для достижения точности LOQ?

A3: Для оценки воспроизводимости и расчета относительного стандартного отклонения (RSD) обычно используется не менее шести повторных измерений на уровне LOQ.

В4: Что делать, если относительное стандартное отклонение на уровне предела количественного определения слишком высокое?

A4: Предлагаемую концентрацию LOQ следует увеличивать и повторно проверять до тех пор, пока точность не будет соответствовать заранее определенным критериям приемлемости.