Руководство по модифицированному окрашиванию красителем Сириус Ред: принцип действия, выбор образца, устранение неполадок и подбор продукта.

Окрашивание коллагена на бумаге выглядит простым, но любой, кто работал с тканевыми срезами, знает, что могут быть допущены даже незначительные ошибки. Сигнал коллагена может быть слабым. Фон может стать красным. Срез может отслоиться. Иногда изображение в светлом поле выглядит приемлемо, но результат в поляризованном свете не позволяет четко увидеть структуру волокон.

Модифицированное окрашивание Сириус Ред часто используется в исследованиях фиброза, заживления ран, восстановления кожи, анализа рубцов на сердце, моделей повреждения печени и исследований внеклеточного матрикса. Оно дает четкий сигнал коллагена и, при наблюдении в поляризованном свете, помогает показать расположение волокон и двойное лучепреломление. Этот дополнительный этап наблюдения является одной из причин, по которой многие лаборатории до сих пор используют этот метод в рутинной работе по окрашиванию тканей.

Соларбио Компания предлагает реагенты для окрашивания, биохимические реагенты, реагенты для молекулярной биологии, иммунологические продукты и другие исследовательские инструменты для биологических исследований. Для исследователей, использующих окрашивание коллагена, модифицированное окрашивание Сириусом красным является очень практичным методом по следующим причинам: оно визуально, непосредственно и может быть соотнесено с морфологией ткани.

Что такое модифицированное окрашивание сириусом красным?

Метод окрашивания срезов тканей с акцентом на коллаген

Модифицированное окрашивание Сириус Ред в основном используется для окрашивания коллагеновых волокон в срезах тканей. Сириус Ред — это сильный кислый краситель. Он связывается с основными группами в коллагеновых волокнах, включая группы, связанные с лизином и гидроксипролином. После окрашивания коллагеновые волокна обычно выглядят красными при световой микроскопии.

Полезным моментом является наблюдение в поляризованном свете. Коллагеновые волокна могут проявлять двойное лучепреломление. При обычном наблюдении коллаген I типа часто выглядит оранжево-красным, тогда как коллаген III типа может иметь зеленоватые оттенки. Точный цвет все еще может зависеть от толщины среза, времени окрашивания, состояния ткани и настроек микроскопа, поэтому по-прежнему необходим соответствующий контрольный препарат.

Для лабораторий, проводящих скрининг инструментов для окрашивания коллагена, продукты для окрашивания являются полезной отправной точкой для проверки красителей Sirius Red, Masson-related, Herovici и других вариантов окрашивания тканей.

Почему поляризованный свет важен

Окрашивание в светлом поле позволяет определить местоположение коллагена. Поляризованный свет дает больше информации о коллагеновых волокнах, включая их расположение, а также степень зрелости. Это свойство может быть полезно для оценки степени фиброза, а также для исследований регенерации тканей, рубцовой ткани и соединительной ткани в целом.

Модифицированное окрашивание Сириус Ред не заменяет молекулярные анализы или обнаружение на уровне белка. Оно не может объяснить все механизмы образования коллагена. Но для наглядного представления процесса отложения коллагена на предметном стекле это быстрый, понятный и практичный метод.

Модифицированное окрашивание Сириус Ред против окрашивания по Массону Трихромом

Эти два метода не идентичны.

Окрашивание по Массону-Трихрому также широко используется для наблюдения за коллагеном. Оно позволяет получить более полное представление о структуре ткани. Коллаген в срезе обычно окрашивается в синий или зеленый цвет, а мышцы и цитоплазма — в контрастный цвет в зависимости от используемого набора реагентов или протокола.

Модифицированное окрашивание Сириус Ред более эффективно для выявления коллагеновых волокон. Его эффективность возрастает при использовании поляризованного света. Если исследовательский вопрос касается распределения коллагеновых волокон и двойного лучепреломления, модифицированное окрашивание Сириус Ред часто является более подходящим вариантом. Если же цель состоит в том, чтобы показать коллаген вместе с мышцами, цитоплазмой и общей структурой ткани, то окрашивание по Массону может быть более удобным для представления результатов.

Для исследователей, сравнивающих методы анализа внеклеточного матрикса, направления исследований может помочь связать методы окрашивания с более широким кругом тем, касающихся фиброза, регенерации тканей и клеточной биологии.

Какие образцы подходят?

Образцы тканей в виде срезов — это подходящий тип образцов.

Модифицированное окрашивание Сириус Ред подходит для парафиновых и замороженных срезов тканей. Оно не подходит для культивируемых клеток, мазков клеток или препаратов для клеточного лазания. Этот момент важен. Некоторые неудачные результаты окрашивания возникают просто потому, что формат образца изначально был неправильным.

Для парафиновых срезов обычно рекомендуется толщина 3–5 микрометров, а для стандартных срезов тканей часто используется 3 микрометра. Для миокарда или рубцовой ткани лучше подойдет толщина около 6 микрометров, поскольку распределение коллагена может быть плотным и неравномерным.

Для замороженных срезов часто рекомендуется толщина 8–12 микрометров. Если срез легко отслаивается, уменьшение толщины до 7–8 микрометров может помочь.

Примечания по фиксации и встраиванию

Обычно особых требований к фиксации нет. Можно использовать распространенные фиксаторы, такие как 4% параформальдегид и 10% формалин. Также можно использовать фиксатор Буэна и фиксатор Ценкера, но для фиксации, содержащей ртуть, перед окрашиванием необходимо полностью удалить ртуть.

Парафиновая и замороженная заливка — оба варианта приемлемы. Пластиковая заливка, например, метилметакрилатом, не рекомендуется, поскольку она может снизить проникновение красителя. При плохом проникновении красителя конечный сигнал коллагена может выглядеть слабым, даже если сам красящий реагент работает.

Для лабораторий, создающих полный рабочий процесс гистологического исследования, растворы для патологического окрашивания Это может помочь при выборе между окрашиванием коллагена, окрашиванием гематоксилином и эозином, окрашиванием по Массону и другими методами окрашивания тканей.

Выбор продукта для окрашивания коллагена

Основные варианты продуктов для окрашивания коллагена

В представленной ниже группе товаров описаны модифицированный метод окрашивания Сириусом красным и несколько связанных с ним методов окрашивания соединительной ткани.

Если цель состоит в непосредственном окрашивании модифицированным красителем Сириус Ред, то основным вариантом набора является набор для окрашивания модифицированным красителем Сириус Ред G1472. Если лаборатории нужен только основной раствор для окрашивания, Модифицированный раствор красителя Сириус Ред G1473 для окрашивания коллагеновых волокон является соответствующим раствором для окрашивания.

Простой способ выбора — начать с вопроса. Если лаборатории необходимо двулучепреломление коллагеновых волокон в поляризованном свете, лучше подойдет модифицированное окрашивание Сириус Ред. Если лаборатории требуется изображение общей структуры ткани с контрастом коллагена, более подходящим может быть окрашивание по Массону-Трихрому. Если зрелость коллагена является частью плана исследования, можно рассмотреть окрашивание коллагена по Херовичи.

Устранение распространенных проблем, связанных с окрашиванием тканей.

Фон слишком красный.

Красный фон может быть следствием чрезмерного окрашивания, толстых срезов, недостаточной промывки, неполной дифференциации или проблем с подготовкой ткани перед окрашиванием. Это распространенное явление, особенно для типов тканей, которые сильно удерживают краситель.

Первая корректировка должна быть простой. Сократите время окрашивания, улучшите промывку и проверьте толщину среза. Не меняйте слишком много условий одновременно. Если срез слишком толстый, контроль фонового окрашивания часто становится сложнее. Для обычных парафиновых срезов обычно безопаснее начинать с толщины около 3 микрометров.

Коллагеновые волокна слишком светлые.

Слабое окрашивание коллагена может быть вызвано коротким временем окрашивания, плохой фиксацией, чрезмерным промыванием, плохим проникновением красителя или низким содержанием коллагена в самом образце. Еще одна небольшая, но реальная проблема — настройка поляризационного освещения. Если микроскоп настроен неправильно, препарат может выглядеть менее четким, чем ожидалось.

В данном случае полезен положительный контроль. Ткань, богатая коллагеном, например, рубцовая или фиброзная ткань, помогает определить, работает ли система окрашивания. Если контрольный образец также слаб, следует скорректировать время окрашивания и условия промывки. Если слаб только тестовый образец, результат может отражать биологические особенности образца.

После окрашивания ядра приобретают красный цвет.

Если не используется гематоксилин Вейгерта, окрашивание ядер может привести к появлению светло-красного окрашивания. В системе G1472 это может быть нормой. В наборе используется новый нетоксичный желтый краситель вместо пикриновой кислоты. Хотя он способствует дифференцировке коллагена и мышечных волокон, он также может привести к некоторому светлому окрашиванию ядер. В большинстве случаев это не влияет на определение коллагена.

Если необходимо получить более четкое изображение ядер, перед окрашиванием Сириус Ред можно добавить гематоксилин Вейгерта, содержащий железо.

Необходимо ли использовать гематоксилин железа?

Если окрашивание ядер не требуется, гематоксилин железа не нужен. Срез можно сразу окрашивать Сириусом красным. Обычный гематоксилин, например, гематоксилин Майера, в качестве замены не рекомендуется. Гематоксилин железа Вейгерта кислотоустойчив и лучше переносит кислую среду при окрашивании Сириусом красным. Это помогает уменьшить обесцвечивание ядер.

Для лабораторий, которые часто сталкиваются с проблемами окрашивания, техническая поддержка может помочь с выбором продукта и устранением основных неполадок до того, как будет использована целая партия ценных образцов тканей.

Простые проверки перед началом окрашивания

Небольшие проверки позволяют сократить количество неудачных слайдов.

Перед окрашиванием всей партии образцов сначала проверьте их тип. Это должен быть парафиновый или замороженный срез ткани, а не образец культивированных клеток. Затем проверьте толщину, фиксацию, адгезию к предметному стеклу и положительный контрольный образец.

Стоит провести несколько практических проверок:

Тип образца должен соответствовать методу.

Толщина среза должна соответствовать типу ткани.

Фиксация должна быть полной, но не препятствовать проникновению красителя.

В качестве положительного контроля следует использовать образец, богатый коллагеном.

Перед окончательной съемкой следует проверить настройки поляризованного света.

Промывание должно быть достаточным для снижения фонового шума, но не настолько интенсивным, чтобы потерять слабый сигнал коллагена.

Это обычные шаги, но они предотвращают множество неудачных попыток окрашивания. Конечно, набор реагентов имеет значение. Тем не менее, конечный результат также зависит от качества среза, фиксации, времени окрашивания, промывки и настроек микроскопа.

Для получения информации об обновлениях продукта и методических указаниях пользователи могут проверить следующее: Новости и технические статьи о Solarbio.

Вывод

Модифицированное окрашивание Сириус Ред — полезный метод для наблюдения за коллагеновыми волокнами, особенно при исследовании окрашенного среза в поляризованном свете. Оно помогает выявить отложение коллагена, распределение волокон и картину двойного лучепреломления в срезах тканей.

Метод работает лучше всего, когда тип образца правильный. Парафиновые и замороженные срезы тканей подходят. Культивированные клетки — нет. Толщина среза, фиксация, промывка, время окрашивания и настройки поляризационного света — все это влияет на конечное изображение. Если фон становится слишком красным или коллаген выглядит слабым, первым шагом должна быть проверка среза и условий протокола, а не замена всего сразу.

Для выбора продукта можно использовать набор для окрашивания модифицированным красителем Сириус Ред G1472. В зависимости от цели окрашивания можно выбрать следующие наборы: раствор для окрашивания модифицированным красителем Сириус Ред G1473 для окрашивания коллагеновых волокон, набор для окрашивания коллагена Геровичи G1475, набор для окрашивания модифицированным анилиновым синим G1476, набор для окрашивания трихромом Массона G1340, набор для окрашивания трихромом Массона G1343 и набор для окрашивания трихромом Массона G1346.

Лаборатории, занимающиеся изучением фиброза, внеклеточного матрикса, регенерации тканей или морфологии коллагена, могут связаться с Solarbio с учетом типа образца, толщины среза, метода фиксации и потребностей в наблюдении.

Часто задаваемые вопросы

В1: В чем заключается принцип реакции при окрашивании модифицированным красителем Сириус Ред?

A1: Сириус красный — это сильный кислотный краситель. Он связывается с основными группами в коллагеновых волокнах, включая группы, связанные с лизином и гидроксипролином. В поляризованном свете коллагеновые волокна проявляют двойное лучепреломление, что помогает исследователям более четко наблюдать за типом коллагена и расположением волокон.

В2: Для чего используется модифицированный набор для окрашивания Сириус Ред G1472?

A2: Модифицированный набор для окрашивания сириусом красным G1472 используется для окрашивания коллагеновых волокон в срезах тканей. Он подходит для парафиновых и замороженных срезов и может использоваться для наблюдения за коллагеном под световым и поляризационным микроскопом.

В3: В чем разница между модифицированным окрашиванием Сириусом красным и окрашиванием по Массону трихромом?

A3: Модифицированное окрашивание Сириус Ред позволяет более непосредственно выявлять коллагеновые волокна и демонстрировать двойное лучепреломление в поляризованном свете. Окрашивание по Массону дает более широкое представление о структуре ткани, обычно показывая коллаген и мышечную ткань или цитоплазму в разных цветах.

Вопрос 4: Какие образцы подходят для окрашивания модифицированным красителем Сириус Ред?

A4: Данный метод подходит для парафиновых и замороженных срезов тканей. Он не подходит для культивируемых клеток, клеточных мазков или препаратов для клеточного лазания.

В5: Требуется ли специальный фиксатор для модифицированного окрашивания Сириус Ред?

A5: В большинстве случаев специальный фиксатор не требуется. Можно использовать обычные фиксаторы, такие как 4% параформальдегид и 10% формалин. Также можно использовать фиксатор Буэна и фиксатор Зенкера, но для фиксации, содержащей ртуть, необходимо надлежащее удаление ртути.

В6: Какая рекомендуемая толщина сечения?

A6: Парафиновые срезы обычно имеют толщину 3–5 микрометров, при этом чаще всего используется 3 микрометра. Для миокарда или рубцовой ткани может потребоваться около 6 микрометров. Замороженные срезы обычно имеют толщину 8–12 микрометров. Если срезы легко отслаиваются, можно попробовать использовать 7–8 микрометров.

В7: Почему после окрашивания фон становится слишком красным?

A7: Красный фон может быть следствием чрезмерного окрашивания, толстых срезов, недостаточной промывки, неполной дифференциации или проблем с подготовкой ткани. Сокращение времени окрашивания и улучшение промывки — распространенные первоначальные корректировки.

В8: Почему коллагеновые волокна бледные или нечеткие?

A8: Причиной может быть короткое время окрашивания, низкое содержание коллагена, чрезмерное промывание, плохая фиксация, плохое проникновение красителя или неподходящие настройки поляризованного света. Для проверки работоспособности системы окрашивания следует использовать положительный контрольный образец с высоким содержанием коллагена.

В9: Нормально ли красное окрашивание ядер, если не используется гематоксилин Вейгерта с добавлением железа?

A9: Да. В системе G1472 при пропуске окрашивания гематоксилином Вейгерта может наблюдаться слабое ядерное окрашивание. Обычно это не влияет на оценку коллагена. Если необходимы более четкие ядра, гематоксилин Вейгерта можно использовать перед окрашиванием Сириус Ред.

В10: Может ли обычный гематоксилин заменить гематоксилин Вейгерта на основе железа?

A10: Не рекомендуется. Железосодержащий гематоксилин Вейгерта более кислотоустойчив и лучше переносит этап окрашивания кислой средой Сириус Ред. Обычный гематоксилин, например, гематоксилин Майера, может обесцвечиваться легче.