คู่มือการย้อมสีซีเรียสเรดฉบับปรับปรุง: หลักการ การเลือกตัวอย่าง การแก้ไขปัญหา และการเลือกผลิตภัณฑ์

การย้อมสีคอลลาเจนดูเหมือนจะง่ายบนกระดาษ แต่ใครก็ตามที่เคยทำงานกับชิ้นเนื้อจะรู้ว่ามันอาจผิดพลาดได้ในรายละเอียดเล็กๆ น้อยๆ สัญญาณคอลลาเจนอาจอ่อน พื้นหลังอาจเปลี่ยนเป็นสีแดง ชิ้นเนื้ออาจหลุดออก บางครั้งภาพที่ได้ภายใต้แสงสว่างปกติอาจดูดี แต่ผลลัพธ์จากแสงโพลาไรซ์กลับไม่แสดงลวดลายของเส้นใยอย่างชัดเจน

การย้อมสีด้วยซิริอุสเรดแบบดัดแปลงมักใช้ในการวิจัยเกี่ยวกับพังผืด การสมานแผล การซ่อมแซมผิวหนัง การวิเคราะห์รอยแผลเป็นในหัวใจ แบบจำลองการบาดเจ็บของตับ และการศึกษาเมทริกซ์นอกเซลล์ การย้อมสีนี้ให้สัญญาณคอลลาเจนที่ชัดเจน และเมื่อสังเกตภายใต้แสงโพลาไรซ์ จะช่วยแสดงการจัดเรียงของเส้นใยและการหักเหของแสง ขั้นตอนการสังเกตเพิ่มเติมนี้เป็นเหตุผลหนึ่งที่ห้องปฏิบัติการหลายแห่งยังคงใช้วิธีนี้ในการย้อมเนื้อเยื่อตามปกติ

โซลาร์บิโอ บริษัทจัดจำหน่ายน้ำยาสำหรับการย้อมสี สารเคมีชีวภาพ สารเคมีทางชีวโมเลกุล ผลิตภัณฑ์ทางภูมิคุ้มกันวิทยา และเครื่องมือวิจัยอื่น ๆ สำหรับงานวิจัยด้านวิทยาศาสตร์ชีวภาพ สำหรับนักวิจัยที่ใช้การย้อมสีคอลลาเจน การย้อมสีด้วย Modified Sirius Red เป็นวิธีที่ใช้งานได้จริงมากด้วยเหตุผลดังต่อไปนี้: สามารถมองเห็นได้ด้วยตาเปล่า เป็นวิธีที่ตรงไปตรงมา และสามารถเชื่อมโยงกับลักษณะทางสัณฐานวิทยาของเนื้อเยื่อได้

การย้อมสีซิริอุสแดงแบบดัดแปลงคืออะไร?

วิธีการย้อมสีที่เน้นคอลลาเจนสำหรับชิ้นเนื้อ

การย้อมสี Sirius Red แบบดัดแปลงส่วนใหญ่ใช้สำหรับย้อมเส้นใยคอลลาเจนในชิ้นเนื้อ Sirius Red เป็นสีย้อมที่มีฤทธิ์เป็นกรดสูง มันจะจับกับกลุ่มเบสในเส้นใยคอลลาเจน รวมถึงกลุ่มที่เกี่ยวข้องกับไลซีนและไฮดรอกซีโพรลีน หลังจากย้อมสีแล้ว เส้นใยคอลลาเจนมักจะปรากฏเป็นสีแดงภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบส่องสว่าง

ส่วนที่มีประโยชน์คือการสังเกตด้วยแสงโพลาไรซ์ เส้นใยคอลลาเจนสามารถแสดงการหักเหของแสงได้ ในการสังเกตทั่วไป คอลลาเจนชนิดที่ 1 มักปรากฏเป็นสีส้มแดง ในขณะที่คอลลาเจนชนิดที่ 3 อาจแสดงโทนสีเขียว สีที่แน่นอนยังคงได้รับผลกระทบจากความหนาของชิ้นเนื้อ เวลาในการย้อมสี สภาพของเนื้อเยื่อ และการตั้งค่ากล้องจุลทรรศน์ ดังนั้นจึงยังคงจำเป็นต้องใช้สไลด์ควบคุมที่เหมาะสม

สำหรับห้องปฏิบัติการที่ทำการทดสอบเครื่องมือย้อมคอลลาเจน ผลิตภัณฑ์น้ำยาสำหรับย้อมสี เป็นจุดเริ่มต้นที่มีประโยชน์สำหรับการตรวจสอบตัวเลือกการย้อมเนื้อเยื่อด้วย Sirius Red, Masson-related, Herovici และตัวเลือกอื่นๆ

เหตุใดแสงโพลาไรซ์จึงมีความสำคัญ

การย้อมสีแบบส่องสว่างสามารถแสดงตำแหน่งของคอลลาเจนได้ แสงโพลาไรซ์สามารถให้ข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับเส้นใยคอลลาเจน รวมถึงการจัดเรียงตัวและความสมบูรณ์ของเส้นใย คุณสมบัตินี้มีประโยชน์สำหรับการจำแนกระดับของพังผืด ตลอดจนการศึกษาการซ่อมแซมเนื้อเยื่อ เนื้อเยื่อแผลเป็น และการศึกษาเนื้อเยื่อเกี่ยวพันโดยทั่วไป

การย้อมสี Sirius Red แบบดัดแปลงไม่สามารถใช้แทนการวิเคราะห์ระดับโมเลกุลหรือการตรวจจับระดับโปรตีนได้ มันไม่สามารถอธิบายกลไกทั้งหมดที่อยู่เบื้องหลังการสร้างคอลลาเจนได้ แต่สำหรับการตรวจสอบการสะสมของคอลลาเจนบนสไลด์นั้น รวดเร็ว อ่านง่าย และใช้งานได้จริง

การย้อมสีซิริอุสแดงแบบดัดแปลงเทียบกับการย้อมสีมาสสันไตรโครม

สองวิธีนี้ไม่เหมือนกัน

การย้อมสี Masson Trichrome เป็นที่นิยมใช้กันอย่างแพร่หลายในการสังเกตคอลลาเจน วิธีนี้ช่วยให้เห็นโครงสร้างของเนื้อเยื่อได้กว้างขึ้น โดยปกติแล้วคอลลาเจนในชิ้นเนื้อจะถูกย้อมเป็นสีน้ำเงินหรือสีเขียว ส่วนกล้ามเนื้อและไซโตพลาซึมจะถูกย้อมด้วยสีที่ตัดกัน ขึ้นอยู่กับชุดอุปกรณ์หรือขั้นตอนที่ใช้

การย้อมสี Modified Sirius Red เน้นที่เส้นใยคอลลาเจนเป็นหลัก ค่าการย้อมสีจะเข้มขึ้นเมื่อใช้แสงโพลาไรซ์ หากคำถามวิจัยเกี่ยวกับการกระจายตัวและการหักเหของแสงในเส้นใยคอลลาเจน การย้อมสี Modified Sirius Red มักจะเหมาะสมกว่า หากเป้าหมายคือการแสดงคอลลาเจนร่วมกับกล้ามเนื้อ ไซโตพลาซึม และโครงสร้างเนื้อเยื่อโดยทั่วไป การย้อมสี Masson Trichrome อาจแสดงผลได้ง่ายกว่า

สำหรับนักวิจัยที่เปรียบเทียบวิธีการวิเคราะห์เมทริกซ์นอกเซลล์ เส้นทางการวิจัย สามารถช่วยเชื่อมโยงวิธีการย้อมสีเข้ากับหัวข้อที่กว้างขึ้นเกี่ยวกับพังผืด การซ่อมแซมเนื้อเยื่อ และชีววิทยาของเซลล์ได้

ตัวอย่างใดบ้างที่เหมาะสม?

ชิ้นเนื้อเป็นตัวอย่างที่เหมาะสม

การย้อมสีด้วย Sirius Red แบบดัดแปลงนั้นเหมาะสำหรับชิ้นเนื้อที่ฝังในพาราฟินและชิ้นเนื้อแช่แข็ง แต่ไม่เหมาะสำหรับเซลล์เพาะเลี้ยง เซลล์ที่ป้ายลงบนสไลด์ หรือสไลด์ที่ใช้สำหรับทดสอบการเรียงตัวของเซลล์ จุดนี้สำคัญมาก บางครั้งผลการย้อมสีไม่สำเร็จก็เกิดขึ้นเพียงเพราะรูปแบบของตัวอย่างไม่ถูกต้องตั้งแต่เริ่มต้น

สำหรับชิ้นเนื้อที่เตรียมด้วยพาราฟิน ความหนา 3–5 ไมโครเมตรเป็นความหนาที่แนะนำโดยทั่วไป และ 3 ไมโครเมตรมักใช้สำหรับชิ้นเนื้อทั่วไป สำหรับกล้ามเนื้อหัวใจหรือเนื้อเยื่อแผลเป็น ความหนาประมาณ 6 ไมโครเมตรอาจเหมาะสมกว่า เนื่องจากคอลลาเจนมีการกระจายตัวหนาแน่นและไม่สม่ำเสมอ

สำหรับชิ้นเนื้อแช่แข็ง ความหนา 8–12 ไมโครเมตรเป็นความหนาที่แนะนำโดยทั่วไป หากชิ้นเนื้อหลุดออกง่าย การลดความหนาลงเหลือประมาณ 7–8 ไมโครเมตรอาจช่วยได้

บันทึกการตรึงและการฝัง

โดยทั่วไปแล้วไม่มีข้อกำหนดพิเศษเกี่ยวกับการตรึงสภาพ สามารถใช้สารตรึงสภาพทั่วไป เช่น พาราฟอร์มาลดีไฮด์ 4% และฟอร์มาลิน 10% ได้ นอกจากนี้ยังสามารถใช้สารตรึงสภาพของ Bouin และ Zenker ได้ แต่สารตรึงสภาพที่มีปรอทจำเป็นต้องกำจัดปรอทออกให้หมดก่อนการย้อมสี

การฝังในพาราฟินและการฝังแบบแช่แข็งนั้นใช้ได้ทั้งคู่ ไม่แนะนำให้ใช้การฝังในพลาสติก เช่น เมทิลเมทาคริเลต เพราะอาจลดการซึมผ่านของสีย้อมได้ เมื่อการซึมผ่านของสีย้อมไม่ดี สัญญาณคอลลาเจนสุดท้ายอาจดูจางลง แม้ว่าน้ำยาที่ใช้ในการย้อมสีจะทำงานได้ดีก็ตาม

สำหรับห้องปฏิบัติการที่กำลังสร้างขั้นตอนการทำงานด้านจุลพยาธิวิทยาแบบครบวงจร สารละลายย้อมสีทางพยาธิวิทยา อาจช่วยในการเลือกวิธีการย้อมเนื้อเยื่อระหว่างการย้อมคอลลาเจน การย้อม HE การย้อม Masson และวิธีการย้อมเนื้อเยื่ออื่นๆ

การเลือกผลิตภัณฑ์สำหรับการย้อมสีคอลลาเจน

ตัวเลือกผลิตภัณฑ์หลักสำหรับการย้อมสีที่เกี่ยวข้องกับคอลลาเจน

กลุ่มผลิตภัณฑ์ด้านล่างนี้ครอบคลุมการย้อมสี Modified Sirius Red และวิธีการย้อมสีเนื้อเยื่อเกี่ยวพันที่เกี่ยวข้องอีกหลายวิธี

หากเป้าหมายคือการย้อมสี Modified Sirius Red โดยตรง ชุดย้อมสี G1472 Modified Sirius Red Staining Kit คือตัวเลือกหลัก แต่หากห้องปฏิบัติการต้องการเพียงน้ำยาสำหรับย้อมสีหลักเท่านั้น สารละลายย้อมสีซีเรียสเรดดัดแปลง G1473 สำหรับย้อมเส้นใยคอลลาเจน คือสารละลายย้อมสีที่เกี่ยวข้อง

วิธีง่ายๆ ในการเลือกคือเริ่มต้นจากคำถาม หากห้องปฏิบัติการต้องการการหักเหของแสงในเส้นใยคอลลาเจนภายใต้แสงโพลาไรซ์ การย้อมสี Modified Sirius Red จะเหมาะสมกว่า หากห้องปฏิบัติการต้องการภาพโครงสร้างเนื้อเยื่อทั่วไปที่มีความแตกต่างของคอลลาเจน การย้อมสี Masson Trichrome อาจเหมาะสมกว่า หากความสมบูรณ์ของคอลลาเจนเป็นส่วนหนึ่งของการออกแบบการวิจัย การย้อมสีคอลลาเจน Herovici สามารถนำมาพิจารณาได้

การแก้ไขปัญหาคราบสกปรกที่พบได้ทั่วไป

พื้นหลังแดงเกินไป

พื้นหลังสีแดงอาจเกิดจากการย้อมสีเข้มเกินไป การตัดชิ้นเนื้อหนาเกินไป การล้างไม่เพียงพอ การแยกเซลล์ไม่สมบูรณ์ หรือปัญหาในการเตรียมเนื้อเยื่อก่อนการย้อมสี ซึ่งเป็นเรื่องปกติ โดยเฉพาะในเนื้อเยื่อที่ดูดซับสีได้ดี

การปรับแต่งครั้งแรกควรทำได้ง่ายๆ คือ ลดเวลาการย้อมสี ปรับปรุงการล้าง และตรวจสอบความหนาของชิ้นเนื้อ อย่าเปลี่ยนเงื่อนไขหลายอย่างพร้อมกัน หากชิ้นเนื้อหนาเกินไป การควบคุมการย้อมสีพื้นหลังมักจะทำได้ยากขึ้น สำหรับชิ้นเนื้อพาราฟินทั่วไป การเริ่มต้นที่ความหนาประมาณ 3 ไมโครเมตรมักจะปลอดภัยกว่า

เส้นใยคอลลาเจนมีสีซีดเกินไป

การย้อมสีคอลลาเจนที่อ่อนอาจเกิดจากระยะเวลาการย้อมสั้น การตรึงตัวอย่างไม่ดี การล้างมากเกินไป การแทรกซึมของสีย้อมไม่ดี หรือปริมาณคอลลาเจนในตัวอย่างต่ำ อีกปัญหาเล็กน้อยแต่สำคัญคือการตั้งค่าแสงโพลาไรซ์ หากไม่ได้ปรับกล้องจุลทรรศน์อย่างถูกต้อง สไลด์อาจดูไม่ชัดเจนเท่าที่ควร

การควบคุมเชิงบวกเป็นสิ่งที่มีประโยชน์ในที่นี้ เนื้อเยื่อที่มีคอลลาเจนสูง เช่น เนื้อเยื่อแผลเป็นหรือเนื้อเยื่อพังผืด จะช่วยตัดสินว่าระบบการย้อมสีทำงานได้หรือไม่ หากตัวควบคุมก็อ่อนแอเช่นกัน ให้ปรับเวลาการย้อมสีและสภาวะการล้าง หากมีเพียงตัวอย่างทดสอบเท่านั้นที่อ่อนแอ ผลลัพธ์อาจสะท้อนถึงชีววิทยาของตัวอย่างนั้น

นิวเคลียสจะปรากฏเป็นสีแดงหลังจากย้อมสี

หากไม่ได้ใช้ฮีมาทอกซิลินเหล็กของไวเกิร์ต อาจพบการย้อมนิวเคลียสเป็นสีแดงอ่อน ซึ่งถือเป็นเรื่องปกติในระบบ G1472 ชุดตรวจนี้ใช้สีย้อมสีเหลืองชนิดใหม่ที่ไม่เป็นพิษแทนกรดพิคริก แม้ว่าจะช่วยในการแยกแยะคอลลาเจนและเส้นใยกล้ามเนื้อได้ แต่ก็อาจทำให้เกิดการย้อมนิวเคลียสสีอ่อนได้บ้าง ในกรณีส่วนใหญ่ สิ่งนี้ไม่ส่งผลต่อการประเมินคอลลาเจน

หากต้องการให้การย้อมนิวเคลียสชัดเจนยิ่งขึ้น สามารถเติมฮีมาทอกซิลินเหล็กของไวเกิร์ตก่อนการย้อมด้วยซีเรียสเรดได้

จำเป็นต้องใช้ฮีมาทอกซิลินที่มีธาตุเหล็กหรือไม่?

หากไม่จำเป็นต้องย้อมนิวเคลียส ไม่จำเป็นต้องใช้ฮีมาทอกซิลินที่มีธาตุเหล็ก สามารถนำชิ้นเนื้อไปย้อมด้วยซีเรียสเรดได้โดยตรง ไม่แนะนำให้ใช้ฮีมาทอกซิลินทั่วไป เช่น ฮีมาทอกซิลินของเมเยอร์ แทน ฮีมาทอกซิลินที่มีธาตุเหล็กของไวเกิร์ตนั้นทนต่อกรดได้ดีกว่าและทนต่อขั้นตอนการย้อมซีเรียสเรดที่เป็นกรดได้ดีกว่า ซึ่งจะช่วยลดการซีดจางของสีนิวเคลียส

สำหรับห้องปฏิบัติการที่มักพบปัญหาเกี่ยวกับการย้อมสี การสนับสนุนบริการทางเทคนิค สามารถช่วยในการเลือกผลิตภัณฑ์และการแก้ไขปัญหาเบื้องต้นก่อนที่จะนำชิ้นเนื้อที่มีค่าจำนวนมากไปใช้

ตรวจสอบเบื้องต้นก่อนเริ่มลงสี

การตรวจสอบเล็กๆ ช่วยลดจำนวนสไลด์ที่ล้มเหลว

ก่อนที่จะย้อมชิ้นเนื้อทั้งหมด ให้ตรวจสอบชนิดของตัวอย่างก่อน ควรเป็นชิ้นเนื้อที่ฝังในพาราฟินหรือชิ้นเนื้อแช่แข็ง ไม่ใช่ตัวอย่างเซลล์เพาะเลี้ยง จากนั้นตรวจสอบความหนา การตรึง การยึดเกาะของสไลด์ และตัวควบคุมเชิงบวก

มีข้อควรระวังที่สำคัญบางประการที่ควรคำนึงถึง:

ประเภทของตัวอย่างควรสอดคล้องกับวิธีการ

ความหนาของชิ้นเนื้อควรสอดคล้องกับชนิดของเนื้อเยื่อ

การตรึงสภาพควรสมบูรณ์แต่ไม่ขัดขวางการซึมผ่านของสีย้อม

ควรรวมตัวอย่างควบคุมเชิงบวกที่มีคอลลาเจนสูงไว้ด้วย

ควรตรวจสอบการตั้งค่าแสงโพลาไรซ์ก่อนทำการถ่ายภาพขั้นสุดท้าย

การล้างควรเพียงพอที่จะลดสัญญาณรบกวน แต่ไม่ควรล้างแรงเกินไปจนทำให้สัญญาณคอลลาเจนที่อ่อนแอหายไป

ขั้นตอนเหล่านี้เป็นขั้นตอนพื้นฐาน แต่ช่วยป้องกันความล้มเหลวในการย้อมสีได้หลายครั้ง ชุดอุปกรณ์มีความสำคัญแน่นอน แต่สไลด์สุดท้ายก็ขึ้นอยู่กับคุณภาพของชิ้นเนื้อ การตรึง การกำหนดเวลา การล้าง และการตั้งค่ากล้องจุลทรรศน์ด้วย

สำหรับข้อมูลอัปเดตผลิตภัณฑ์และหมายเหตุวิธีการใช้งานที่เกี่ยวข้อง ผู้ใช้สามารถตรวจสอบได้ที่ ข่าวสารและบทความทางเทคนิคของ Solarbio.

ข้อสรุป

การย้อมสีซิริอุสแดงแบบดัดแปลงเป็นวิธีการที่มีประโยชน์สำหรับการสังเกตเส้นใยคอลลาเจน โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อตรวจสอบชิ้นเนื้อที่ย้อมสีภายใต้แสงโพลาไรซ์ วิธีนี้ช่วยแสดงให้เห็นถึงการสะสมของคอลลาเจน การกระจายตัวของเส้นใย และรูปแบบการหักเหของแสงในชิ้นเนื้อ

วิธีการนี้จะได้ผลดีที่สุดเมื่อตัวอย่างมีประเภทที่ถูกต้อง ตัวอย่างที่ฝังในพาราฟินและชิ้นเนื้อแช่แข็งเหมาะสม แต่เซลล์เพาะเลี้ยงไม่เหมาะสม ความหนาของชิ้นเนื้อ การตรึง การล้าง เวลาในการย้อมสี และการตั้งค่าแสงโพลาไรซ์ ล้วนส่งผลต่อภาพสุดท้าย เมื่อพื้นหลังมีสีแดงมากเกินไปหรือคอลลาเจนดูจางลง ขั้นตอนแรกควรตรวจสอบชิ้นเนื้อและเงื่อนไขของวิธีการ ไม่ใช่การเปลี่ยนทุกอย่างพร้อมกัน

สำหรับการเลือกผลิตภัณฑ์ ชุดย้อมสี G1472 Modified Sirius Red Staining Kit เป็นตัวเลือกชุดโดยตรง ส่วนชุดย้อมสีอื่นๆ เช่น G1473 Modified Sirius Red Staining Solution for Collagen Fiber Staining, G1475 Herovici Collagen Staining Kit, G1476 Modified Aniline Blue Staining Kit, G1340 Masson Trichrome Staining Kit, G1343 Masson Trichrome Staining Kit และ G1346 Modified Masson Trichrome Staining Kit สามารถเลือกใช้ได้ตามวัตถุประสงค์ของการย้อมสี

ห้องปฏิบัติการที่ทำงานวิจัยเกี่ยวกับพังผืด เมทริกซ์นอกเซลล์ การซ่อมแซมเนื้อเยื่อ หรือสัณฐานวิทยาของคอลลาเจน สามารถ ติดต่อ Solarbio โดยพิจารณาจากประเภทของตัวอย่าง ความหนาของส่วนตัด วิธีการตรึง และความต้องการในการสังเกต

คำถามที่พบบ่อย

คำถามที่ 1: หลักการทำปฏิกิริยาของการย้อมสีด้วยซิริอุสเรดดัดแปลงคืออะไร?

A1: สีย้อมซิริอุสเรดเป็นสีย้อมที่มีฤทธิ์เป็นกรดสูง มันจะจับกับหมู่เบสในเส้นใยคอลลาเจน รวมถึงหมู่ที่เกี่ยวข้องกับไลซีนและไฮดรอกซีโพรลีน ภายใต้แสงโพลาไรซ์ เส้นใยคอลลาเจนจะแสดงการหักเหของแสงสองทิศทาง ซึ่งช่วยให้นักวิจัยสังเกตชนิดของคอลลาเจนและการจัดเรียงตัวของเส้นใยได้ชัดเจนยิ่งขึ้น

Q2: ชุดย้อมสี G1472 Modified Sirius Red ใช้สำหรับอะไร?

A2: ชุดย้อมสี G1472 Modified Sirius Red ใช้สำหรับย้อมเส้นใยคอลลาเจนในชิ้นเนื้อ เหมาะสำหรับชิ้นเนื้อพาราฟินและชิ้นเนื้อแช่แข็ง และสามารถใช้สังเกตคอลลาเจนภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบแสงสว่างและแบบโพลาไรซ์ได้

คำถามที่ 3: การย้อมสีแบบ Modified Sirius Red กับการย้อมสีแบบ Masson Trichrome แตกต่างกันอย่างไร?

A3: การย้อมสี Sirius Red แบบดัดแปลงจะเน้นไปที่เส้นใยคอลลาเจนโดยตรงมากขึ้น และสามารถแสดงการหักเหของแสงภายใต้แสงโพลาไรซ์ได้ การย้อมสี Masson Trichrome ให้มุมมองโครงสร้างเนื้อเยื่อที่กว้างกว่า โดยปกติจะแสดงคอลลาเจนและกล้ามเนื้อหรือไซโตพลาซึมในสีที่แตกต่างกัน

คำถามที่ 4: ตัวอย่างชนิดใดบ้างที่เหมาะสมสำหรับการย้อมสีด้วย Modified Sirius Red?

A4: วิธีนี้เหมาะสำหรับชิ้นเนื้อที่ฝังในพาราฟินและชิ้นเนื้อแช่แข็ง ไม่เหมาะสำหรับเซลล์เพาะเลี้ยง เซลล์ที่ป้ายลงบนสไลด์ หรือสไลด์ที่ใช้สำหรับทดสอบการเคลื่อนตัวของเซลล์

Q5: การย้อมสีแบบ Modified Sirius Red จำเป็นต้องใช้สารตรึงสภาพพิเศษหรือไม่?

A5: ในกรณีส่วนใหญ่ ไม่จำเป็นต้องใช้สารตรึงสภาพพิเศษ สารตรึงสภาพทั่วไป เช่น พาราฟอร์มาลดีไฮด์ 4% และฟอร์มาลิน 10% สามารถใช้ได้ นอกจากนี้ยังสามารถใช้สารตรึงสภาพของ Bouin และสารตรึงสภาพของ Zenker ได้ แต่สารตรึงสภาพที่มีปรอทจำเป็นต้องกำจัดปรอทออกให้หมดก่อน

Q6: ความหนาของหน้าตัดที่แนะนำคือเท่าใด?

A6: ชิ้นเนื้อที่ฝังในพาราฟินมักมีความหนา 3–5 ไมโครเมตร โดยทั่วไปใช้ 3 ไมโครเมตร สำหรับเนื้อเยื่อหัวใจหรือเนื้อเยื่อแผลเป็นอาจใช้ความหนาประมาณ 6 ไมโครเมตร ชิ้นเนื้อแช่แข็งมักมีความหนา 8–12 ไมโครเมตร หากชิ้นเนื้อแยกออกจากกันได้ง่าย อาจลองใช้ความหนา 7–8 ไมโครเมตรได้

Q7: เหตุใดพื้นหลังจึงมีสีแดงมากเกินไปหลังจากย้อมสี?

A7: พื้นหลังสีแดงอาจเกิดจากการย้อมสีเข้มเกินไป ชิ้นเนื้อหนาเกินไป การล้างไม่สะอาด การแยกสีไม่สมบูรณ์ หรือปัญหาในการเตรียมเนื้อเยื่อ การลดระยะเวลาการย้อมสีและการปรับปรุงการล้างเป็นการปรับเปลี่ยนเบื้องต้นที่นิยมทำกัน

Q8: เหตุใดเส้นใยคอลลาเจนจึงมีสีซีดหรือไม่ชัดเจน?

A8: สาเหตุอาจเกิดจากระยะเวลาการย้อมสีสั้น ปริมาณคอลลาเจนต่ำ การล้างมากเกินไป การตรึงที่ไม่ดี การแทรกซึมของสีย้อมไม่ดี หรือการตั้งค่าแสงโพลาไรซ์ที่ไม่เหมาะสม ควรใช้ตัวอย่างควบคุมเชิงบวกที่มีคอลลาเจนสูงเพื่อตรวจสอบว่าระบบการย้อมสีทำงานได้หรือไม่

Q9: การย้อมนิวเคลียสเป็นสีแดงถือเป็นเรื่องปกติหรือไม่ หากไม่ได้ใช้ฮีมาทอกซิลินเหล็กของไวเกิร์ต?

A9: ใช่ค่ะ ในระบบ G1472 การย้อมนิวเคลียสให้สีจางอาจปรากฏขึ้นได้หากไม่ได้ใช้ฮีมาทอกซิลินเหล็กของไวเกิร์ต ซึ่งโดยปกติแล้วจะไม่ส่งผลต่อการประเมินคอลลาเจน หากต้องการนิวเคลียสที่ชัดเจนยิ่งขึ้น สามารถใช้ฮีมาทอกซิลินเหล็กของไวเกิร์ตก่อนการย้อมด้วยซีเรียสเรดได้

Q10: การย้อมสีฮีมาทอกซิลินแบบปกติสามารถใช้แทนการย้อมสีฮีมาทอกซิลินด้วยธาตุเหล็กของไวเกิร์ตได้หรือไม่?

A10: ไม่แนะนำให้ใช้ ฮีมาทอกซิลินชนิดเหล็กของไวเกิร์ตมีความทนต่อกรดได้ดีกว่าและทนต่อขั้นตอนการย้อมสีซีเรียสเรดที่เป็นกรดได้ดีกว่า ฮีมาทอกซิลินทั่วไป เช่น ฮีมาทอกซิลินของเมเยอร์ อาจซีดจางได้ง่ายกว่า