كيفية تحسين إنتاجية وجودة استخلاص الحمض النووي البلازميدي: المشاكل الشائعة وحلولها

يبدو استخلاص الحمض النووي البلازميدي بسيطًا بعد تكراره عدة مرات. تُزرع البكتيريا، ثم تُجمع الراسب، وتُحلل الخلايا، ويُنقى الحمض النووي، ويُستخلص. لكن المشكلة تبدأ عندما لا تبدو العينة النهائية كما توقعت.

أحيانًا يكون التركيز منخفضًا جدًا. وفي أحيان أخرى، تبدو القراءة مرتفعة بشكل غير معتاد، لكن أداء الحمض النووي ضعيف في الاستنساخ أو النقل الجيني أو أي تجربة لاحقة. غالبًا ما يُلقى اللوم أولًا على مجموعة الاستخلاص، مع أن المشكلة الحقيقية قد تكون بدأت أثناء زراعة البكتيريا أو حتى خلال خطوة إعادة التعليق الأولى.

بالنسبة لأعمال البيولوجيا الجزيئية الروتينية، فإن أسهل طريقة لاستكشاف أخطاء استخلاص البلازميد هي النظر إلى سير العمل بأكمله بدلاً من خطوة واحدة معزولة. سولاربيو يوفر نطاقًا واسعًا مجموعة منتجات البيولوجيا الجزيئية يشمل ذلك استخلاص البلازميد، وتنقية الأحماض النووية، والكواشف المختبرية ذات الصلة.

لماذا تركيز الحمض النووي البلازميدي لدي مرتفع للغاية؟

إن التركيز العالي بشكل مفاجئ ليس دائماً خبراً جيداً.

أحد الأسباب الشائعة هو تلوث الحمض النووي الريبي (RNA). إذا لم يُضَف إنزيم RNase A إلى المحلول الأول، أو إذا فقد هذا الإنزيم فعاليته بعد تخزين طويل، فقد يؤدي وجود الحمض النووي الريبي المتبقي إلى زيادة قراءة الامتصاص عند 260 نانومتر. وبالتالي، يُظهر الجهاز تركيزًا أعلى للأحماض النووية، على الرغم من أن جزءًا من هذه الإشارة لا يأتي من الحمض النووي البلازميدي.

الحل العملي بسيط. تأكد من إضافة إنزيم RNase A إلى المحلول الأول قبل الاستخلاص. إذا تم تخزين المحلول الأول المُحضر لفترة طويلة، فيجب فحص حالة إنزيم RNase A قبل بدء دفعة جديدة.

بالنسبة للمختبرات التي تعالج عينات البلازميد البكتيري الروتينية، تعد مجموعة D1100 Plasmid Extraction Mini Kit أحد الخيارات لإعداد البلازميد على نطاق صغير.

لماذا كان مردود الحمض النووي البلازميدي منخفضًا جدًا؟

يُعدّ انخفاض المحصول أكثر تعقيداً لأنّ الخسارة قد تحدث في عدة مراحل. وعادةً ما يُوفّر فحص مزرعة البكتيريا أولاً الوقت.

افحص مزرعة البكتيريا قبل الاستخلاص

يعني ضعف نمو البكتيريا وجود كمية أقل من البلازميد المتاح قبل بدء عملية الاستخلاص.

إذا كانت قيمة الامتصاص الضوئي عند 600 نانومتر منخفضة جدًا، فقد لا تكون الكتلة الحيوية البكتيرية كافية. كما أن ترك المزرعة لفترة طويلة جدًا قد يُسبب مشاكل. فبمجرد أن تتجاوز البكتيريا مرحلة النمو المطلوبة، قد يؤثر إطلاق النيوكلياز وصعوبة تحلل الخلايا على كمية البلازميد النهائية.

يُضيف التلوث عاملاً آخر إلى بيئة القارورة. تتنافس الكائنات الدقيقة غير المرغوب فيها مع البكتيريا المستهدفة، وقد تُغير من حالة المزرعة. كما أن المزارع القديمة أو تلك التي خضعت لعمليات استنبات متكررة تكون أقل قابلية للتنبؤ.

يتمثل النهج العملي في البدء من مستعمرة واحدة جديدة، واستخدام وسط مناسب مثل LB مع التركيز الصحيح للمضادات الحيوية، وزراعتها لمدة تتراوح بين 12 و 16 ساعة دون السماح بنمو مفرط.

تحتاج البلازميدات منخفضة النسخ إلى المزيد من المواد الأولية

لا ينتج كل بلازميد نفس كمية الحمض النووي.

يمكن للبلازميدات الكبيرة والبلازميدات ذات النسخ المنخفضة طبيعياً أن تُنتج كمية أقل بكثير من الحمض النووي من نفس حجم المزرعة. كما أن الإدخال الكبير، وخاصةً الذي يزيد طوله عن 10 كيلوبايت، قد يُقلل من كفاءة التضاعف.

إذا أمكن تغيير الناقل، فقد يُسهّل استخدام بلازميد ذي عدد نسخ أعلى سير العمل. أما عند الحاجة إلى الاحتفاظ ببلازميد ذي عدد نسخ منخفض، فإن زيادة حجم مزرعة البكتيريا من حوالي 5 مل إلى 10-20 مل يمكن أن يوفر كمية أكبر من المادة الأولية.

تتوفر نظرة أوسع على كواشف الاستخلاص وتنظيف الحمض النووي في المفاعلات الأساسية في تنقية الحمض النووي: دليل شامل، وهو أمر مفيد عندما يبدو أن المشكلة تنطوي على أكثر من مجرد إنتاج البلازميد وحده.

ماذا يحدث أثناء تحلل الخلايا وتحييدها؟

حتى المزرعة البكتيرية الجيدة قد تنتج حمض نووي بلازميدي رديء إذا تم التعامل مع خطوة التحلل بشكل سيئ.

لا تقم بتحليل الخلايا من الأسفل أو من الأعلى

قد يؤدي وجود كمية كبيرة من المواد البكتيرية إلى تجاوز كمية محلول التحلل المستخدم. في الوقت نفسه، قد يؤدي التعرض القصير للمحلول الثاني إلى عدم تحلل جزء من البكتيريا بشكل كافٍ.

يُسبب ترك الخلايا في ظروف التحلل القلوية لفترة طويلة مشكلة أخرى. فعندما تتجاوز مدة التحلل خمس دقائق تقريبًا، قد يتلف الحمض النووي الجينومي ويختلط مع مستحضر البلازميد. كما أن الظروف القلوية القوية قد تؤثر على جودة البلازميد.

بعد إضافة المحلول الثاني، امزج برفق ولكن جيداً. لا يُنصح بالخلط بقوة باستخدام جهاز الخلط الدوامي في هذه الحالة.

كما تقوم شركة Solarbio بتوريد حلول أبحاث البيولوجيا الجزيئية للمختبرات التي تعمل في مجالات استخلاص الحمض النووي وتنقيته وتطبيقات الأحماض النووية الأخرى.

تتطلب عملية التعادل خلطًا مناسبًا وطردًا مركزيًا.

يجب أن يتلامس المحلول الثالث مع المستخلص الخلوي بشكل صحيح.

بعد إضافة المحلول، اقلب الأنبوب حوالي 8-10 مرات حتى يظهر راسب أبيض متجانس. قد يؤدي عدم الخلط الجيد إلى عدم اكتمال عملية التعادل ويؤثر على استعادة البلازميد.

تُعدّ عملية الطرد المركزي المرحلة التالية التي تظهر فيها اختصارات صغيرة لاحقاً. تساعد ظروف التشغيل التي تتراوح بين 12000 و13000 دورة في الدقيقة لمدة 10 إلى 15 دقيقة على فصل الراسب عن السائل الطافي الحاوي على البلازميد.

بالنسبة لأعمال البلازميد حيث يكون التحكم في السموم الداخلية مهمًا، فإن مجموعة D1140 Free Endotoxin Plasmid Extraction Mini Kit توفر شكلاً آخر للاستخلاص على نطاق صغير.

كيف يمكن حماية الحمض النووي البلازميدي أثناء عملية الاستخلاص؟

قد يضيع الحمض النووي البلازميدي أو يتلف حتى عندما تكون كيمياء التحلل صحيحة.

يُعدّ التلوث بالنيوكلياز أحد المخاوف. يجب أن تكون المياه والأنابيب ورؤوس الماصات وغيرها من المواد المستخدمة حول الأحماض النووية مناسبةً لهذه المهمة. يمكن أن يُقلّل التلوث بالديوكسي ريبونيوكلياز من سلامة الحمض النووي، بينما يُصبح نشاط الريبونيوكلياز غير المرغوب فيه مشكلةً في سير العمل المتعلق بالحمض النووي الريبي.

كما أن طريقة التعامل مهمة أيضاً. فالرجّ العنيف غير ضروري خلال عدة مراحل من تحضير البلازميد، وقد يجعل تنظيف العينة أكثر صعوبة.

لا ينبغي إغفال تغيرات درجة الحرارة أيضاً. حافظ على ثبات ظروف الاستخلاص، وخاصةً خلال مرحلتي التحلل والإذابة.

قد تفضل المختبرات التي تعالج أعدادًا كبيرة من العينات طريقة معالجة مختلفة. توفر مجموعة DM1100 المصغرة لاستخلاص البلازميد (طريقة الخرز المغناطيسي) خيار الخرز المغناطيسي إلى جانب طرق الاستخلاص القياسية.

كيف ينبغي استخلاص الحمض النووي البلازميدي؟

الخطوة الأخيرة قد تُفسد عملية استخلاص جيدة دون أن تشعر.

قد يؤدي استخدام حجم كبير جدًا من سائل الإذابة إلى استخلاص الحمض النووي، لكنه يجعل العينة النهائية مخففة للغاية. أما استخدام كمية قليلة جدًا من السائل فيؤدي إلى مشكلة معاكسة، لأن الغشاء قد لا يكون مبللاً بشكل كافٍ لتحرير البلازميد بالكامل.

يُعدّ الرقم الهيدروجيني لمحلول الإذابة عاملاً مهماً أيضاً. فالماء المقطر الحمضي أو محلول TE ذو الرقم الهيدروجيني الأقل من 7.0 قد يُقلل من استخلاص البلازميد. ويُعدّ الرقم الهيدروجيني بين 8.0 و8.5 أنسب لهذه الخطوة.

قد يُساعد ضبط درجة الحرارة. تسخين محلول الإذابة مسبقًا إلى حوالي 60 درجة مئوية قد يُحسّن من إطلاق الحمض النووي البلازميدي من غشاء السيليكا. بعد إضافة المحلول، اتركه على الغشاء لمدة دقيقة إلى دقيقتين قبل الطرد المركزي بدلًا من تشغيله فورًا.

حتى الخسائر الطفيفة الناتجة عن المناولة تتراكم. بعد عملية الطرد المركزي الأولى للبكتيريا، تخلص من السائل الطافي تمامًا حتى لا يتم تخفيف الراسب بشكل غير ضروري. عند إضافة المحلول الأول، يجب أن يكون الراسب معلقًا بالكامل دون وجود أي تكتلات ظاهرة.

عندما تتكرر مشكلة الاستخراج بعد التحقق من الخطوات الأساسية، Solarbio موارد الخدمة الفنية ويمكن استخدامها أيضاً لاختيار المنتجات ودعم التطبيقات.

أي مجموعة استخلاص البلازميد تناسب العينات المختلفة؟

يجب أن يأتي نوع العينة قبل اسم المجموعة.

لتحضير البلازميدات الروتيني على نطاق صغير، تغطي مجموعة D1100 المصغرة لاستخلاص البلازميدات الأعمال القياسية. أما مجموعة D1110 الكبيرة لاستخلاص البلازميدات فهي مخصصة لأحجام التحضير الأكبر. وللبكتيريا موجبة الجرام طرق استخلاص خاصة بها، بما في ذلك D1120 وD1130، بينما تُستخدم D1160 لاستخلاص بلازميدات الخميرة.

يمكن استخدام D1140 أو D1150 في التطبيقات الحساسة للسموم الداخلية، وذلك حسب حجم التحضير المطلوب. أما معالجة الخرز المغناطيسي فتتوفر من خلال DM1100.

ليس هناك ما يبرر إجبار كل بلازميد على اتباع نفس إجراءات العمل. فالمادة الأولية، وعدد نسخ البلازميد، وحجم العينة، والاستخدام اللاحق، وجودة الحمض النووي المطلوبة، كلها عوامل تؤثر على الاختيار.

يمكن للباحثين تصفح موقع Solarbio منتجات استخلاص الأحماض النووية عند مقارنة خيارات الاستخلاص لسير العمل المختلفة في علم الأحياء الجزيئي.

استنتاج

عادة ما يكون لاستخلاص الحمض النووي البلازميدي الضعيف سبب، وليس دائماً هو العمود أو خطوة الإذابة النهائية.

قد يؤدي تلوث الحمض النووي الريبوزي (RNA) إلى إظهار تركيز أعلى مما هو عليه في الواقع. كما أن ضعف نمو البكتيريا، وانخفاض عدد نسخ البلازميد، وضعف إعادة التعليق، وعدم اكتمال التحلل، وسوء التعامل، وضعف التحييد، أو ظروف الإذابة غير المناسبة، كلها عوامل قد تقلل من كمية أو جودة الحمض النووي (DNA) الذي يصل في النهاية إلى الأنبوب.

من المفيد اتباع نفس ترتيب إجراء التجربة في عملية استكشاف الأخطاء وإصلاحها. ابدأ بفحص المزرعة البكتيرية، ثم انتقل إلى إعادة التعليق، والتحلل، والمعادلة، والطرد المركزي، والتعامل مع العمود، والإذابة.

لا يقتصر تحضير البلازميد الجيد على إعطاء تركيز عالٍ على الجهاز فحسب، بل يجب أن يكون الحمض النووي نقيًا وجاهزًا للاستخدام في أي خطوة لاحقة.

للاستفسار عن منتجات استخلاص البلازميد أو تطبيقات البيولوجيا الجزيئية الأخرى، يمكن للباحثين التواصل مع شركة Solarbio عبر صفحة الاتصال.

أسئلة متكررة

س1: لماذا تركيز الحمض النووي البلازميدي لدي أعلى من المتوقع؟

أ1: يُعد تلوث الحمض النووي الريبي (RNA) سببًا شائعًا. فإذا كان إنزيم RNase A مفقودًا أو غير نشط، فقد يؤدي وجود الحمض النووي الريبي المتبقي إلى زيادة قراءة الامتصاص عند 260 نانومتر، مما يجعل تركيز الحمض النووي المقاس يبدو أعلى من مستوى الحمض النووي البلازميدي الفعلي.

س2: لماذا أحصل على كمية قليلة من الحمض النووي البلازميدي؟

أ2: قد تؤدي عوامل مثل انخفاض كثافة البكتيريا، وسوء ظروف الاستزراع، وانخفاض عدد نسخ البلازميد، وكبر حجم الإدخالات، وعدم اكتمال التحلل، وتلف الحمض النووي، وعدم اكتمال التحييد، أو عدم كفاءة الاستخلاص، إلى انخفاض المردود. من الأفضل فحص سير العمل بدءًا من استزراع البكتيريا فصاعدًا، بدلًا من التركيز فقط على خطوة الاستخلاص النهائية.

س3: ما هي المدة التي يجب أن تبقى فيها الخلايا البكتيرية في المحلول الثاني أثناء التحلل القلوي؟

ج٣: تحتاج الخلايا إلى وقت كافٍ للتحلل بشكل صحيح، ولكن يجب عدم إطالة المعالجة القلوية بلا داعٍ. في هذه الطريقة، يساعد الحفاظ على فترة التحلل في حدود خمس دقائق على تقليل المشاكل المتعلقة بتلف الحمض النووي الجينومي والبلازميد.

س4: ما هو الرقم الهيدروجيني الذي يجب استخدامه لإذابة الحمض النووي البلازميدي؟

A4: يمكن استخدام الماء المقطر (ddH2O) أو محلول منظم TE بدرجة حموضة تتراوح بين 8.0 و8.5. قد يؤدي استخدام محلول استخلاص حمضي بدرجة حموضة أقل من 7.0 إلى تقليل استخلاص البلازميد من غشاء السيليكا.