วิธีเพิ่มผลผลิตและคุณภาพการสกัดดีเอ็นเอพลาสมิด: ปัญหาทั่วไปและวิธีแก้ไข

การสกัดดีเอ็นเอพลาสมิดดูเหมือนจะง่ายเมื่อคุณเคยทำมาสักสองสามครั้งแล้ว เริ่มจากเพาะเลี้ยงแบคทีเรีย เก็บตะกอน ทำลายเซลล์ ทำความสะอาดดีเอ็นเอ และชะล้างออกมา แต่ปัญหาจะเริ่มขึ้นเมื่อหลอดทดลองสุดท้ายไม่ได้มีลักษณะอย่างที่คุณคาดหวัง

บางครั้งความเข้มข้นต่ำมาก ในบางครั้งค่าที่อ่านได้ดูสูงผิดปกติ แต่ดีเอ็นเอทำงานได้ไม่ดีในการโคลนนิ่ง การถ่ายทอดพันธุกรรม หรือการทดลองอื่นๆ ในขั้นตอนต่อไป ชุดสกัดมักถูกตำหนิเป็นอันดับแรก แม้ว่าปัญหาที่แท้จริงอาจเริ่มต้นตั้งแต่การเพาะเลี้ยงแบคทีเรียหรือแม้กระทั่งในขั้นตอนการแขวนลอยครั้งแรกก็ตาม

สำหรับงานด้านชีววิทยาโมเลกุลทั่วไป วิธีที่ง่ายที่สุดในการแก้ไขปัญหาการสกัดพลาสมิดคือการพิจารณากระบวนการทำงานทั้งหมด แทนที่จะพิจารณาเพียงขั้นตอนใดขั้นตอนหนึ่งเพียงอย่างเดียว โซลาร์บิโอ ให้บริการในวงกว้าง กลุ่มผลิตภัณฑ์ชีววิทยาโมเลกุล ครอบคลุมถึงการสกัดพลาสมิด การทำให้บริสุทธิ์ของกรดนิวคลีอิก และสารเคมีที่ใช้ในห้องปฏิบัติการที่เกี่ยวข้อง

ทำไมความเข้มข้นของดีเอ็นเอพลาสมิดของฉันจึงสูงเกินไป?

ความเข้มข้นที่สูงเกินคาดนั้น ไม่ได้หมายความว่าจะเป็นข่าวดีเสมอไป

สาเหตุหนึ่งที่พบบ่อยคือการปนเปื้อนของ RNA หากไม่ได้เติม RNase A ลงในสารละลาย I หรือหาก RNase A เสื่อมสภาพหลังจากเก็บรักษาไว้นาน RNA ที่ตกค้างอาจทำให้ค่า A260 สูงขึ้น เครื่องมือจึงรายงานความเข้มข้นของกรดนิวคลีอิกที่สูงขึ้น แม้ว่าส่วนหนึ่งของสัญญาณนั้นไม่ได้มาจาก DNA พลาสมิดก็ตาม

วิธีแก้ไขที่ได้ผลนั้นง่ายมาก ตรวจสอบให้แน่ใจว่าได้เติม RNase A ลงในสารละลาย I ก่อนทำการสกัด หากสารละลาย I ที่เตรียมไว้ถูกเก็บไว้นาน ควรตรวจสอบสภาพของ RNase A ก่อนเริ่มการสกัดชุดใหม่

สำหรับห้องปฏิบัติการที่ทำการวิเคราะห์ตัวอย่างพลาสมิดของแบคทีเรียเป็นประจำ ชุดสกัดพลาสมิดขนาดเล็ก D1100 เป็นอีกหนึ่งทางเลือกสำหรับการเตรียมพลาสมิดในปริมาณน้อย

ทำไมปริมาณ DNA พลาสมิดของฉันจึงต่ำเกินไป?

ผลผลิตต่ำเป็นเรื่องที่ซับซ้อนกว่า เพราะการสูญเสียอาจเกิดขึ้นได้หลายจุด การตรวจสอบเชื้อแบคทีเรียก่อนมักจะช่วยประหยัดเวลาได้

ตรวจสอบเชื้อแบคทีเรียก่อนทำการสกัด

การเจริญเติบโตของแบคทีเรียที่ไม่ดีหมายความว่าจะมีพลาสมิดเหลือน้อยลงก่อนที่กระบวนการสกัดจะเริ่มต้นขึ้น

หากค่า OD600 ต่ำเกินไป อาจเป็นเพราะมีมวลชีวภาพของแบคทีเรียไม่เพียงพอ นอกจากนี้ การเพาะเลี้ยงที่ทิ้งไว้นานเกินไปก็อาจทำให้เกิดปัญหาได้เช่นกัน เมื่อแบคทีเรียเจริญเติบโตเกินกว่าระยะที่ต้องการ การปล่อยเอนไซม์นิวคลีเอสและการสลายเซลล์ที่ยากลำบากอาจส่งผลต่อปริมาณพลาสมิดที่ได้ในที่สุด

การปนเปื้อนทำให้เกิดตัวแปรอีกอย่างหนึ่งในขวดเพาะเลี้ยง จุลินทรีย์ที่ไม่พึงประสงค์จะแข่งขันกับแบคทีเรียเป้าหมายและอาจเปลี่ยนแปลงสภาวะของวัฒนธรรมได้ นอกจากนี้ วัฒนธรรมเก่าหรือวัฒนธรรมที่ผ่านการเพาะเลี้ยงซ้ำหลายครั้งก็คาดเดาผลลัพธ์ได้ยากขึ้นด้วย

วิธีการปฏิบัติที่ได้ผลคือ เริ่มต้นจากโคโลนีเดี่ยวที่สดใหม่ ใช้สื่อเพาะเลี้ยงที่เหมาะสม เช่น LB ที่มีความเข้มข้นของยาปฏิชีวนะที่ถูกต้อง และเพาะเลี้ยงประมาณ 12 ถึง 16 ชั่วโมง โดยไม่ปล่อยให้มีการเจริญเติบโตมากเกินไป

พลาสมิดที่มีจำนวนสำเนาต่ำต้องการวัตถุดิบเริ่มต้นมากกว่า

พลาสมิดแต่ละตัวไม่ได้ผลิตดีเอ็นเอในปริมาณเท่ากันเสมอไป

พลาสมิดขนาดใหญ่และพลาสมิดที่มีจำนวนสำเนาต่ำตามธรรมชาติ อาจให้ดีเอ็นเอในปริมาณที่น้อยกว่ามากจากปริมาณการเพาะเลี้ยงเท่ากัน นอกจากนี้ ชิ้นส่วนดีเอ็นเอขนาดใหญ่ โดยเฉพาะอย่างยิ่งที่มีขนาดเกิน 10 กิโลเบส อาจลดประสิทธิภาพการจำลองแบบลงได้

หากสามารถเปลี่ยนเวกเตอร์ได้ พลาสมิดที่มีจำนวนสำเนาสูงกว่าอาจทำให้ขั้นตอนการทำงานง่ายขึ้น ในกรณีที่ต้องคงพลาสมิดที่มีจำนวนสำเนาต่ำไว้ การเพิ่มปริมาตรของวัฒนธรรมแบคทีเรียจากประมาณ 5 มิลลิลิตรเป็น 10-20 มิลลิลิตร จะช่วยให้มีวัตถุดิบเริ่มต้นมากขึ้น

สามารถดูรายละเอียดเพิ่มเติมเกี่ยวกับสารสกัดและวิธีการทำความสะอาด DNA ได้ใน สารปฏิกิริยาที่จำเป็นในการทำความสะอาด DNA: คู่มือที่ครอบคลุมซึ่งเป็นประโยชน์เมื่อปัญหาดูเหมือนจะเกี่ยวข้องมากกว่าแค่ปริมาณพลาสมิดเพียงอย่างเดียว

เกิดอะไรขึ้นระหว่างกระบวนการสลายเซลล์และการทำให้เป็นกลาง?

ถึงแม้ว่าการเพาะเลี้ยงแบคทีเรียจะดี แต่ก็ยังอาจผลิตดีเอ็นเอพลาสมิดคุณภาพต่ำได้ หากขั้นตอนการสลายเซลล์ทำไม่ถูกวิธี

อย่าทำการสลายเซลล์น้อยเกินไปหรือมากเกินไป

ปริมาณแบคทีเรียที่มากเกินไปอาจทำให้สารละลายที่ใช้ในการสลายเซลล์ไม่สามารถกำจัดแบคทีเรียได้อย่างเพียงพอ ในขณะเดียวกัน การสัมผัสกับสารละลาย II ในระยะเวลาสั้นๆ อาจทำให้แบคทีเรียบางส่วนไม่ถูกทำลายอย่างเพียงพอ

การทิ้งเซลล์ไว้ในสภาวะการสลายเซลล์ที่เป็นด่างนานเกินไปจะทำให้เกิดปัญหาที่แตกต่างออกไป เมื่อเวลาในการสลายเซลล์เกินกว่าประมาณห้านาที ดีเอ็นเอจีโนมอาจเสียหายและปะปนกับสารเตรียมพลาสมิด สภาวะที่เป็นด่างจัดยังอาจส่งผลต่อคุณภาพของพลาสมิดได้อีกด้วย

หลังจากเติมสารละลายที่ 2 แล้ว ให้ผสมเบาๆ แต่ให้ทั่วถึง การเขย่าแรงๆ ไม่ใช่ทางลัดที่ดีในขั้นตอนนี้

Solarbio ยังจัดจำหน่ายผลิตภัณฑ์อื่นๆ อีกด้วย โซลูชันการวิจัยชีววิทยาโมเลกุล สำหรับห้องปฏิบัติการที่ทำงานด้านการสกัด DNA การทำให้บริสุทธิ์ และการประยุกต์ใช้กรดนิวคลีอิกอื่นๆ

กระบวนการทำให้เป็นกลางต้องอาศัยการผสมและการปั่นเหวี่ยงอย่างเหมาะสม

สารละลายที่ 3 ต้องสัมผัสกับไลเซตอย่างเหมาะสม

หลังจากเติมสารแล้ว ให้กลับหลอดทดลองประมาณ 8-10 ครั้ง จนกระทั่งเกิดตะกอนสีขาวขุ่นสม่ำเสมอ การผสมที่ไม่ดีอาจทำให้กระบวนการทำให้เป็นกลางไม่สมบูรณ์และส่งผลต่อการกู้คืนพลาสมิด

การปั่นเหวี่ยงเป็นขั้นตอนต่อไปที่อาจมีทางลัดเล็กๆ ปรากฏขึ้น การทำงานที่ความเร็วประมาณ 12,000–13,000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 10–15 นาที จะช่วยแยกตะกอนออกจากสารละลายส่วนบนที่มีพลาสมิดอยู่

สำหรับงานเกี่ยวกับพลาสมิดที่การควบคุมเอนโดท็อกซินมีความสำคัญ ชุดสกัดพลาสมิดปราศจากเอนโดท็อกซินขนาดเล็ก D1140 เป็นอีกรูปแบบหนึ่งสำหรับการสกัดในปริมาณน้อย

จะปกป้องดีเอ็นเอพลาสมิดระหว่างการสกัดได้อย่างไร?

ดีเอ็นเอพลาสมิดอาจสูญหายหรือเสียหายได้ แม้ว่ากระบวนการสลายเซลล์จะถูกต้องแล้วก็ตาม

การปนเปื้อนของนิวคลีเอสเป็นข้อกังวลอย่างหนึ่ง น้ำ หลอดทดลอง ปลายปิเปต และวัสดุอื่นๆ ที่ใช้กับกรดนิวคลีอิกควรมีความเหมาะสมกับงาน การปนเปื้อนของดีเอ็นเอสสามารถลดความสมบูรณ์ของดีเอ็นเอ ในขณะที่กิจกรรมของอาร์เอ็นเอสที่ไม่พึงประสงค์จะกลายเป็นปัญหาในกระบวนการทำงานที่เกี่ยวข้องกับอาร์เอ็นเอ

วิธีการจัดการก็สำคัญเช่นกัน การเขย่าอย่างรุนแรงไม่จำเป็นในหลายขั้นตอนของการเตรียมพลาสมิด และอาจทำให้ตัวอย่างทำความสะอาดได้ยากขึ้น

การเปลี่ยนแปลงของอุณหภูมิก็ไม่ควรละเลยเช่นกัน ควรควบคุมสภาวะการสกัดให้คงที่ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในช่วงการสลายเซลล์และการชะล้าง

ห้องปฏิบัติการที่ประมวลผลตัวอย่างจำนวนมากอาจต้องการรูปแบบการจัดการที่แตกต่างออกไป ชุดสกัดพลาสมิดขนาดเล็ก DM1100 (วิธีใช้ลูกปัดแม่เหล็ก) มีตัวเลือกการใช้ลูกปัดแม่เหล็กควบคู่ไปกับรูปแบบการสกัดแบบมาตรฐาน

ควรแยกดีเอ็นเอพลาสมิดด้วยวิธีใด?

ขั้นตอนสุดท้ายอาจทำให้การสกัดที่ดีนั้นล้มเหลวโดยไม่รู้ตัว

การใช้ปริมาณของเหลวในการชะล้างมากเกินไปอาจทำให้ได้ดีเอ็นเอคืนมา แต่จะทำให้ตัวอย่างสุดท้ายเจือจางเกินไป ในทางกลับกัน การใช้ของเหลวน้อยเกินไปจะทำให้เกิดปัญหาตรงกันข้าม เพราะเมมเบรนอาจไม่เปียกชุ่มเพียงพอสำหรับการปลดปล่อยพลาสมิดอย่างสมบูรณ์

ค่า pH ของสารละลายที่ใช้ในการชะล้างก็มีความสำคัญเช่นกัน น้ำกลั่นที่เป็นกรดหรือบัฟเฟอร์ TE ที่มีค่า pH ต่ำกว่า 7.0 อาจลดประสิทธิภาพการชะล้างพลาสมิดได้ ค่า pH ประมาณ 8.0–8.5 จะเหมาะสมกว่าสำหรับขั้นตอนนี้

อุณหภูมิมีส่วนช่วยได้ การอุ่นสารละลายสำหรับชะล้างให้มีอุณหภูมิประมาณ 60°C อาจช่วยให้ดีเอ็นเอพลาสมิดหลุดออกจากเยื่อซิลิกาได้ดีขึ้น หลังจากเติมสารละลายแล้ว ให้ทิ้งไว้บนเยื่อประมาณหนึ่งถึงสองนาทีก่อนนำไปปั่นเหวี่ยง แทนที่จะปั่นทันที

การสูญเสียเล็กน้อยจากการจัดการก็สะสมเพิ่มขึ้นได้เช่นกัน หลังจากปั่นแยกแบคทีเรียครั้งแรกแล้ว ให้แยกส่วนของเหลวใสออกให้หมด เพื่อไม่ให้ตะกอนเจือจางโดยไม่จำเป็น เมื่อเติมสารละลาย I ลงไป ตะกอนควรจะกระจายตัวอย่างสมบูรณ์โดยไม่มีก้อนที่เห็นได้ชัดเหลืออยู่

เมื่อปัญหาการสกัดข้อมูลเกิดขึ้นซ้ำๆ หลังจากตรวจสอบขั้นตอนพื้นฐานแล้ว Solarbio แหล่งข้อมูลบริการทางเทคนิค นอกจากนี้ยังสามารถใช้สำหรับการเลือกผลิตภัณฑ์และการสนับสนุนการใช้งานได้อีกด้วย

ชุดสกัดพลาสมิดแบบใดเหมาะกับตัวอย่างประเภทต่างๆ?

ประเภทของตัวอย่างควรอยู่ก่อนชื่อชุดอุปกรณ์

สำหรับงานเตรียมพลาสมิดขนาดเล็กทั่วไป ชุดสกัดพลาสมิด D1100 Mini Kit ครอบคลุมงานมาตรฐาน ส่วนชุดสกัดพลาสมิด D1110 Maxi Kit เหมาะสำหรับปริมาณการเตรียมที่มากขึ้น แบคทีเรียแกรมบวกมีรูปแบบการสกัดเฉพาะของตนเอง ได้แก่ D1120 และ D1130 ขณะที่ D1160 มีไว้สำหรับการสกัดพลาสมิดจากยีสต์

งานที่ไวต่อสารเอนโดท็อกซินสามารถใช้ D1140 หรือ D1150 ได้ ขึ้นอยู่กับขนาดการเตรียมที่ต้องการ การประมวลผลด้วยลูกปัดแม่เหล็กสามารถทำได้ผ่าน DM1100

ไม่มีเหตุผลใดที่จะต้องบังคับใช้พลาสมิดทุกตัวกับขั้นตอนการทำงานเดียวกัน วัสดุเริ่มต้น จำนวนสำเนาพลาสมิด ปริมาณตัวอย่าง การใช้งานในขั้นตอนต่อไป และคุณภาพ DNA ที่ต้องการ ล้วนมีผลต่อการเลือกใช้

นักวิจัยสามารถเรียกดูข้อมูลของ Solarbio ได้ ผลิตภัณฑ์สกัดกรดนิวคลีอิก เมื่อเปรียบเทียบตัวเลือกการสกัดสำหรับขั้นตอนการทำงานทางชีววิทยาโมเลกุลที่แตกต่างกัน

ข้อสรุป

การสกัดดีเอ็นเอพลาสมิดที่ไม่ดีมักมีสาเหตุ และไม่ใช่ว่าสาเหตุนั้นเกิดจากคอลัมน์หรือขั้นตอนการชะล้างขั้นสุดท้ายเสมอไป

การปนเปื้อนของ RNA อาจทำให้ความเข้มข้นดูสูงกว่าความเป็นจริง การเจริญเติบโตของแบคทีเรียที่อ่อนแอ จำนวนสำเนาพลาสมิดต่ำ การแขวนลอยที่ไม่ดี การสลายเซลล์ที่ไม่สมบูรณ์ การจัดการที่ไม่ระมัดระวัง การทำให้เป็นกลางที่อ่อนแอ หรือสภาวะการชะล้างที่ไม่เหมาะสม ล้วนสามารถลดปริมาณหรือคุณภาพของ DNA ที่ไปถึงหลอดทดลองได้ในที่สุด

การแก้ไขปัญหาควรทำตามลำดับเดียวกับการทดลอง ตรวจสอบตัวอย่างเพาะเลี้ยงก่อน จากนั้นจึงตรวจสอบการแขวนลอย การสลายเซลล์ การทำให้เป็นกลาง การปั่นเหวี่ยง การจัดการคอลัมน์ และการชะล้าง

การเตรียมพลาสมิดที่ดีไม่เพียงแต่จะให้ความเข้มข้นสูงบนเครื่องมือเท่านั้น แต่ดีเอ็นเอต้องสะอาดและสามารถนำไปใช้ในขั้นตอนต่อไปได้ด้วย

สำหรับคำถามเกี่ยวกับผลิตภัณฑ์สกัดพลาสมิดหรือการประยุกต์ใช้ทางชีววิทยาโมเลกุลอื่นๆ นักวิจัยสามารถติดต่อ Solarbio ได้ผ่านช่องทางต่างๆ หน้าติดต่อ.

คำถามที่พบบ่อย

คำถามที่ 1: เหตุใดความเข้มข้นของดีเอ็นเอพลาสมิดของฉันจึงสูงกว่าที่คาดไว้?

A1: การปนเปื้อนของ RNA เป็นสาเหตุที่พบได้บ่อย หากขาด RNase A หรือ RNase A ไม่ทำงานแล้ว RNA ที่ตกค้างอาจทำให้ค่า A260 สูงขึ้น และทำให้ความเข้มข้นของกรดนิวคลีอิกที่วัดได้ดูสูงกว่าระดับ DNA ของพลาสมิดที่แท้จริง

Q2: ทำไมฉันถึงได้ปริมาณดีเอ็นเอพลาสมิดน้อย?

A2: ความหนาแน่นของแบคทีเรียต่ำ สภาพการเพาะเลี้ยงไม่ดี จำนวนสำเนาพลาสมิดต่ำ ชิ้นส่วนแทรกขนาดใหญ่ การสลายเซลล์ไม่สมบูรณ์ การเสื่อมสภาพของ DNA การทำให้เป็นกลางไม่สมบูรณ์ หรือการชะล้างที่ไม่ประสิทธิภาพ ล้วนสามารถลดผลผลิตได้ ควรตรวจสอบขั้นตอนการทำงานตั้งแต่การเพาะเลี้ยงแบคทีเรียเป็นต้นไป แทนที่จะมุ่งเน้นเฉพาะขั้นตอนการสกัดขั้นสุดท้ายเท่านั้น

คำถามที่ 3: เซลล์แบคทีเรียควรอยู่ในสารละลาย II นานเท่าใดในระหว่างกระบวนการสลายด้วยด่าง?

A3: เซลล์ต้องการเวลาเพียงพอสำหรับการแตกตัวอย่างเหมาะสม แต่การบำบัดด้วยด่างไม่ควรยืดเยื้อโดยไม่จำเป็น ในขั้นตอนการทำงานนี้ การรักษาระยะเวลาการแตกตัวให้อยู่ภายในประมาณห้านาทีจะช่วยลดปัญหาที่เกี่ยวข้องกับความเสียหายของดีเอ็นเอจีโนมและพลาสมิดได้

คำถามที่ 4: ควรใช้ค่า pH เท่าใดในการชะล้างดีเอ็นเอพลาสมิด?

A4: สามารถใช้ ddH2O หรือบัฟเฟอร์ TE ที่มี pH ประมาณ 8.0–8.5 ได้ สารละลายชะล้างที่เป็นกรดที่มี pH ต่ำกว่า 7.0 อาจลดประสิทธิภาพการกู้คืนพลาสมิดจากเยื่อซิลิกาได้