플라스미드 DNA 추출 수율 및 품질 향상 방법: 일반적인 문제점 및 해결 방법

플라스미드 DNA 추출은 몇 번 해보면 간단해 보입니다. 박테리아를 배양하고, 침전물을 모으고, 세포를 용해하고, DNA를 정제한 다음 용출하면 됩니다. 하지만 최종 결과물이 예상과 다르게 보일 때 문제가 시작됩니다.

때로는 농도가 매우 낮습니다. 또 어떤 경우에는 측정값이 비정상적으로 높게 나오지만, DNA가 클로닝, 형질전환 또는 기타 후속 실험에서 제대로 작동하지 않습니다. 추출 키트가 먼저 문제의 원인으로 지목되는 경우가 많지만, 실제 문제는 세균 배양 과정이나 심지어 첫 번째 재현탁 단계에서 시작되었을 수도 있습니다.

일상적인 분자생물학 작업에서 플라스미드 추출 문제를 해결하는 가장 쉬운 방법은 특정 단계 하나만을 살펴보는 것이 아니라 전체 워크플로우를 살펴보는 것입니다. Solarbio는 광범위한 것을 제공합니다 분자생물학 제품군 플라스미드 추출, 핵산 정제 및 관련 실험실 시약을 다룹니다.

내 플라스미드 DNA 농도가 너무 높은 이유는 무엇인가요?

예상보다 높은 농도가 항상 좋은 소식만은 아닙니다.

일반적인 원인 중 하나는 RNA 오염입니다. 용액 I에 RNase A를 첨가하지 않았거나 장기간 보관 후 RNase A의 활성이 저하된 경우, 잔류 RNA가 A260 측정값을 증가시킬 수 있습니다. 그러면 기기는 해당 신호의 일부가 플라스미드 DNA에서 유래하지 않았음에도 불구하고 더 높은 핵산 농도를 보고합니다.

실질적인 해결책은 간단합니다. 추출 전에 용액 I에 RNase A를 첨가하십시오. 제조된 용액 I을 장기간 보관한 경우, 다음 배치를 시작하기 전에 RNase A의 상태를 확인해야 합니다.

일상적인 세균 플라스미드 샘플을 처리하는 실험실의 경우, D1100 플라스미드 추출 미니 키트는 소규모 플라스미드 준비를 위한 하나의 선택지입니다.

내 플라스미드 DNA 수율이 너무 낮은 이유는 무엇인가요?

수율이 낮은 이유는 손실이 여러 단계에서 발생할 수 있기 때문에 더욱 복잡합니다. 일반적으로 세균 배양액을 먼저 살펴보면 시간을 절약할 수 있습니다.

추출 전 세균 배양을 확인하십시오

세균 증식이 부진하면 추출이 시작되기 전에 이용 가능한 플라스미드 양이 더 적습니다.

OD600 값이 너무 낮으면 박테리아 생체량이 충분하지 않을 수 있습니다. 배양 기간이 너무 길어진 경우에도 문제가 발생할 수 있습니다. 박테리아가 원하는 성장 단계를 넘어서면 뉴클레아제 방출 및 세포 용해의 어려움으로 인해 최종 플라스미드 수율에 영향을 미칠 수 있습니다.

오염은 플라스크에 또 다른 변수를 추가합니다. 원치 않는 미생물은 목표 박테리아와 경쟁하여 배양 상태를 변화시킬 수 있습니다. 오래된 배양액이나 반복적인 계대 배양을 거친 배양액은 예측 가능성이 떨어집니다.

실용적인 접근 방식은 신선한 단일 콜로니에서 시작하여 적절한 항생제 농도를 가진 LB와 같은 적절한 배지를 사용하고 과도한 성장을 방지하면서 약 12~16시간 동안 배양하는 것입니다.

저복제 플라스미드에는 더 많은 시작 물질이 필요합니다.

모든 플라스미드가 동일한 양의 DNA를 생성하는 것은 아닙니다.

크기가 큰 플라스미드나 본래 복제 수가 적은 플라스미드는 동일한 배양액에서 훨씬 적은 양의 DNA를 생성할 수 있습니다. 특히 10kb 이상의 큰 삽입물은 복제 효율을 저하시킬 수도 있습니다.

벡터를 변경할 수 있다면, 복제 수가 높은 플라스미드를 사용하면 워크플로우가 더 간편해질 수 있습니다. 복제 수가 낮은 플라스미드를 유지해야 하는 경우에는 세균 배양액을 약 5mL에서 10~20mL로 늘리면 더 많은 시작 재료를 확보할 수 있습니다.

추출 시약 및 DNA 정제에 대한 보다 포괄적인 내용은 다음에서 확인할 수 있습니다. DNA 정화의 필수 시약: 포함적인 가이드이는 문제가 플라스미드 수율 이상의 다른 요소와 관련되어 있을 때 유용합니다.

세포 용해 및 중화 과정에서 무슨 일이 일어날까요?

세균 배양 상태가 좋아도 용해 단계를 잘못 처리하면 품질이 떨어지는 플라스미드 DNA를 생성할 수 있습니다.

세포를 너무 적게 또는 너무 많이 용해시키지 마십시오.

세균 물질의 양이 너무 많으면 사용되는 용해 용액의 양을 초과할 수 있습니다. 또한, 용액 II에 노출 시간이 짧으면 세균의 일부가 불충분하게 용해될 수 있습니다.

세포를 알칼리성 용해 조건에 ​​너무 오래 방치하면 다른 문제가 발생합니다. 용해 시간이 약 5분을 초과하면 게놈 DNA가 손상되어 플라스미드 제제와 섞일 수 있습니다. 또한 강한 알칼리성 조건은 플라스미드의 품질에도 영향을 미칠 수 있습니다.

용액 II를 첨가한 후에는 부드럽지만 철저하게 섞어주세요. 강하게 볼텍싱하는 것은 좋은 방법이 아닙니다.

Solarbio는 또한 다음과 같은 제품을 공급합니다. 분자생물학 연구 솔루션 DNA 추출, 정제 및 기타 핵산 응용 분야를 연구하는 실험실에 적합합니다.

중화 반응에는 적절한 혼합과 원심분리가 필요합니다.

용액 III은 용해액과 적절하게 접촉해야 합니다.

첨가 후, 균일한 흰색 응집성 침전물이 나타날 때까지 튜브를 8~10회 정도 뒤집어 줍니다. 제대로 섞지 않으면 중화 반응이 불완전해져 플라스미드 회수에 영향을 줄 수 있습니다.

원심분리는 나중에 작은 지름길이 드러나는 다음 단계입니다. 약 12,000~13,000rpm의 회전 속도로 10~15분간 원심분리하면 침전물과 플라스미드가 포함된 상층액을 분리하는 데 도움이 됩니다.

내독소 관리가 중요한 플라스미드 작업의 경우, D1140 무내독소 플라스미드 추출 미니 키트는 소규모 추출을 위한 또 다른 형식을 제공합니다.

플라스미드 DNA는 추출 과정에서 어떻게 보호할 수 있을까요?

플라스미드 DNA는 용해 화학 과정이 올바르더라도 손실되거나 손상될 수 있습니다.

뉴클레아제 오염은 우려되는 사항 중 하나입니다. 핵산 주변에서 사용되는 물, 튜브, 피펫 팁 및 기타 재료는 작업에 적합해야 합니다. DNase 오염은 DNA 무결성을 저하시킬 수 있으며, 원치 않는 RNase 활성은 RNA 관련 작업 과정에서 문제가 될 수 있습니다.

취급 방법 또한 중요합니다. 플라스미드 준비 과정의 여러 단계에서는 과도하게 흔들 필요가 없으며, 오히려 시료를 정제하기 어렵게 만들 수 있습니다.

온도 변화 또한 무시해서는 안 됩니다. 특히 용해 및 용출 과정에서 추출 조건을 일정하게 유지해야 합니다.

대량의 샘플을 처리하는 실험실에서는 다른 처리 방식을 선호할 수 있습니다. DM1100 플라스미드 추출 미니 키트(자성 비드 방식)는 표준 추출 방식 외에도 자성 비드 방식을 제공합니다.

플라스미드 DNA는 어떻게 용출해야 할까요?

마지막 단계에서 제대로 추출된 결과가 조용히 망쳐질 수 있습니다.

용출액의 양이 너무 많으면 DNA는 회수할 수 있지만 최종 샘플이 너무 희석될 수 있습니다. 반대로 용출액의 양이 너무 적으면 막이 충분히 젖지 않아 플라스미드가 완전히 방출되지 않는 문제가 발생할 수 있습니다.

용출 용액의 pH 또한 중요합니다. pH 7.0 미만의 산성 증류수 또는 TE 완충액은 플라스미드 회수율을 감소시킬 수 있습니다. 이 단계에는 pH 8.0~8.5 정도가 더 적합합니다.

온도가 도움이 될 수 있습니다. 용출 용액을 약 60°C로 예열하면 실리카 멤브레인에서 플라스미드 DNA가 더 잘 분리될 수 있습니다. 용액을 첨가한 후 바로 원심분리하지 말고 1~2분 정도 멤브레인 위에 그대로 두십시오.

취급 과정에서 발생하는 작은 손실도 누적될 수 있습니다. 첫 번째 세균 원심분리 후에는 상층액을 완전히 제거하여 침전물이 불필요하게 희석되지 않도록 해야 합니다. 용액 I을 첨가했을 때 침전물이 완전히 재현탁되어 눈에 띄는 덩어리가 남지 않아야 합니다.

기본 단계를 모두 확인한 후에도 추출 문제가 계속 발생하는 경우 Solarbio에 문의하십시오. 기술 서비스 리소스 제품 선택 및 애플리케이션 지원에도 사용할 수 있습니다.

어떤 플라스미드 추출 키트가 다양한 샘플에 적합할까요?

샘플 유형은 키트 이름보다 먼저 나와야 합니다.

일상적인 소규모 플라스미드 추출에는 D1100 플라스미드 추출 미니 키트가 표준 작업에 적합합니다. D1110 플라스미드 추출 맥시 키트는 더 많은 양의 플라스미드를 추출하는 데 사용됩니다. 그람 양성 세균용 추출 키트로는 D1120과 D1130이 있으며, D1160은 효모 플라스미드 추출용입니다.

내독소에 민감한 응용 분야에서는 필요한 준비 규모에 따라 D1140 또는 D1150을 사용할 수 있습니다. 자성 비드 처리는 DM1100을 통해 가능합니다.

모든 플라스미드를 동일한 워크플로우에 맞춰야 할 이유는 없습니다. 시작 재료, 플라스미드 복제 수, 샘플 용량, 후속 용도 및 필요한 DNA 품질 모두 선택에 영향을 미칩니다.

연구자들은 Solarbio의 자료를 살펴볼 수 있습니다. 핵산 추출 제품 서로 다른 분자생물학 워크플로우에 대한 추출 옵션을 비교할 때.

결론

플라스미드 DNA 추출이 제대로 되지 않는 데에는 대개 이유가 있으며, 항상 컬럼이나 최종 용출 단계의 문제만은 아닙니다.

RNA 오염은 실제 농도보다 더 높게 나타나게 할 수 있습니다. 세균 증식 부진, 플라스미드 복제 수 부족, 불량한 재현탁, 불완전한 용해, 거친 취급, 약한 중화 또는 부적절한 용출 조건은 모두 최종적으로 튜브에 도달하는 DNA의 양이나 질을 저하시킬 수 있습니다.

실험이 수행된 순서대로 문제를 해결하는 것이 도움이 됩니다. 먼저 배양액을 확인하십시오. 그런 다음 재현탁, 용해, 중화, 원심분리, 컬럼 처리 및 용출 과정을 살펴보십시오.

좋은 플라스미드 준비는 기기에서 높은 농도를 얻을 수 있을 뿐만 아니라, DNA가 깨끗하고 이후 과정에 사용할 수 있어야 합니다.

플라스미드 추출 제품 또는 기타 분자 생물학 응용 ​​분야에 대한 문의 사항은 Solarbio를 통해 연락하실 수 있습니다. 연락처 페이지.

FAQ는

Q1: 내 플라스미드 DNA 농도가 예상보다 높은 이유는 무엇입니까?

A1: RNA 오염이 흔한 원인입니다. RNase A가 없거나 더 이상 활성화되지 않으면 잔류 RNA가 A260 측정값을 증가시켜 측정된 핵산 농도가 실제 플라스미드 DNA 수준보다 높게 나타나게 할 수 있습니다.

Q2: 플라스미드 DNA 수율이 낮은 이유는 무엇인가요?

A2: 낮은 세균 밀도, 불량한 배양 조건, 낮은 플라스미드 복제 수, 큰 삽입물, 불완전한 용해, DNA 분해, 불완전한 중화 또는 비효율적인 용출은 모두 수율을 감소시킬 수 있습니다. 최종 추출 단계에만 집중하기보다는 세균 배양 단계부터 전체적인 워크플로우를 점검하는 것이 좋습니다.

질문 3: 알칼리 용해 과정에서 세균 세포는 용액 II에 얼마나 오래 담가 두어야 합니까?

A3: 세포가 제대로 용해되려면 충분한 시간이 필요하지만, 알칼리 처리 시간을 불필요하게 길게 해서는 안 됩니다. 이 워크플로우에서는 용해 시간을 약 5분 이내로 유지하면 게놈 DNA 및 플라스미드 손상과 관련된 문제를 줄이는 데 도움이 됩니다.

질문 4: 플라스미드 DNA 용출에 사용해야 할 pH는 얼마입니까?

A4: pH 8.0~8.5 정도의 증류수(ddH2O) 또는 TE 완충액을 사용할 수 있습니다. pH 7.0 미만의 산성 용출액은 실리카 멤브레인에서 플라스미드 회수율을 감소시킬 수 있습니다.