プラスミドDNA抽出の収量と品質を向上させる方法：よくある問題点とその解決策

プラスミドDNAの抽出は、何度か経験すれば簡単そうに見える。細菌を培養し、沈殿物を集め、細胞を溶解し、DNAを精製し、溶出する。問題は、最終的なチューブが予想と異なる状態になったときに始まる。

濃度が非常に低い場合もあれば、測定値が異常に高いにもかかわらず、クローニング、トランスフェクション、またはその他の下流実験でDNAの性能が低下する場合もあります。抽出キットが最初に疑われることが多いのですが、実際の問題は細菌培養中、あるいは最初の再懸濁段階ですでに発生している可能性があります。

日常的な分子生物学作業において、プラスミド抽出のトラブルシューティングを行う最も簡単な方法は、個々のステップだけを見るのではなく、ワークフロー全体を見直すことです。 ソレボ 幅広い 分子生物学製品群 プラスミド抽出、核酸精製、および関連する実験用試薬を網羅する。

なぜ私のプラスミドDNA濃度は高すぎるのでしょうか？

驚くほど高い濃度は、必ずしも良いニュースとは限らない。

よくある原因の一つはRNA汚染です。溶液IにRNase Aを添加しなかった場合、あるいはRNase Aが長期保存後に活性を失った場合、残留RNAによってA260の測定値が上昇することがあります。その結果、たとえそのシグナルの一部がプラスミドDNA由来ではないとしても、測定器はより高い核酸濃度を報告します。

実用的な解決策は簡単です。抽出前に溶液IにRNase Aを添加してください。調製済みの溶液Iを長期間保存した場合は、次のバッチを開始する前にRNase Aの状態を確認する必要があります。

日常的に細菌プラスミドサンプルを処理する研究室にとって、D1100プラスミド抽出ミニキットは、小規模なプラスミド調製のための選択肢の一つです。

なぜ私のプラスミドDNAの収量が低すぎるのでしょうか？

収量低下は、損失が複数の段階で発生する可能性があるため、より複雑な問題です。通常、最初に細菌培養を観察することで時間を節約できます。

抽出前に細菌培養を確認してください

細菌の増殖が不十分だと、抽出を開始する前から利用可能なプラスミドの量が少なくなる。

OD600値が低すぎる場合は、単純に細菌バイオマスが不足している可能性があります。培養時間が長すぎる場合も問題が生じる可能性があります。細菌が望ましい増殖段階を超えると、ヌクレアーゼの放出や細胞溶解の困難さによって、最終的なプラスミド収量に影響が出る可能性があります。

汚染は培養フラスコ内に新たな変動要因をもたらします。不要な微生物が目的の細菌と競合し、培養状態を変化させる可能性があります。古い培養物や継代培養を繰り返した培養物は、さらに予測が難しくなります。

実践的な作業方法としては、新鮮な単一コロニーから始め、LB培地などの適切な培地に適切な抗生物質濃度を加え、過剰な増殖を起こさないように注意しながら12～16時間ほど培養することである。

低コピー数プラスミドにはより多くの出発材料が必要

すべてのプラスミドが同じ量のDNAを生成するわけではない。

大型プラスミドや、もともとコピー数が少ないプラスミドは、同じ培養液量から得られるDNA量が大幅に少なくなる可能性がある。特に10kbを超えるような大きな挿入断片は、複製効率を低下させる可能性もある。

ベクターを変更できる場合は、コピー数の多いプラスミドを使用することで作業工程が簡略化される可能性がある。コピー数の少ないプラスミドを使用する必要がある場合は、細菌培養液の量を約5mLから10～20mLに増やすことで、より多くの出発材料を得ることができる。

抽出試薬とDNA精製に関するより詳細な情報は以下をご覧ください。 DNA精製における基本試薬：総合ガイドラインこれは、問題がプラスミド収量だけにとどまらない場合に役立ちます。

細胞溶解と中和の過程で何が起こるのか？

良質な細菌培養物であっても、溶解工程の処理が不適切であれば、質の低いプラスミドDNAが生成される可能性がある。

細胞の溶解が不十分であったり、過剰であったりしないようにしてください。

細菌の量が多すぎると、使用する溶解液の量が処理能力を超えてしまう可能性があります。同時に、溶液IIへの曝露時間が短いと、細菌の一部が十分に溶解されないまま残ってしまう可能性があります。

細胞をアルカリ溶解条件下に長時間放置すると、別の問題が生じる。溶解時間が約5分を超えると、ゲノムDNAが損傷を受け、プラスミド調製物と混ざってしまう可能性がある。また、強アルカリ条件はプラスミドの品質にも影響を与える。

溶液IIを加えた後は、優しく、しかししっかりと混ぜてください。激しくボルテックスするのは良い方法ではありません。

Solarbioは供給も行っています 分子生物学研究ソリューション DNA抽出、精製、その他の核酸応用に取り組む研究室向け。

中和には適切な混合と遠心分離が必要です

溶液IIIは溶解液と適切に接触する必要がある。

添加後、均一な白色の凝集沈殿物が現れるまで、試験管を8～10回ほど反転させてください。十分に混合しないと中和が不完全になり、プラスミドの回収率に影響が出る可能性があります。

遠心分離は、後ほど小さな工夫が活きてくる次の段階です。12,000～13,000rpmで10～15分間遠心分離することで、沈殿物とプラスミドを含む上清を分離することができます。

エンドトキシン制御が重要なプラスミド研究においては、D1140フリーエンドトキシンプラスミド抽出ミニキットが、小規模抽出のための別のフォーマットを提供します。

プラスミドDNAは抽出時にどのように保護されるのか？

溶解反応が適切に行われた場合でも、プラスミドDNAが失われたり損傷を受けたりする可能性がある。

ヌクレアーゼによる汚染は懸念事項の一つです。核酸の周囲で使用する水、チューブ、ピペットチップなどの材料は、作業に適したものでなければなりません。DNaseによる汚染はDNAの完全性を低下させる可能性があり、一方、不要なRNase活性はRNA関連のワークフローにおいて問題となります。

取り扱い方も重要です。プラスミド調製のいくつかの工程では、激しく振盪する必要はありません。激しく振盪すると、サンプルの精製が難しくなる場合があります。

温度変化も無視してはならない。特に溶解と溶出の際には、抽出条件を一定に保つように注意する必要がある。

より多くのサンプルを処理する研究室では、別の処理方法を好む場合があります。DM1100プラスミド抽出ミニキット（磁気ビーズ法）は、標準的な抽出方法に加えて、磁気ビーズ法を選択できるオプションを提供します。

プラスミドDNAはどのように溶出すべきでしょうか？

最後のステップが、せっかくの抽出を台無しにしてしまう可能性がある。

溶出液量が非常に多いとDNAは回収できるものの、最終サンプルが希釈されすぎてしまう可能性がある。逆に、溶出液量が少なすぎると、膜が十分に湿潤せず、プラスミドが完全に溶出されないという逆の問題が生じる。

溶出液のpHも重要です。pH7.0未満の酸性ddH2OまたはTEバッファーは、プラスミドの回収率を低下させる可能性があります。このステップには、pH8.0～8.5程度がより適しています。

温度は有効です。溶出液を約60℃に予熱しておくと、シリカ膜からのプラスミドDNAの溶出が改善される場合があります。溶液を添加した後、すぐに遠心分離するのではなく、膜上に1～2分ほど置いてから遠心分離してください。

取り扱い時の小さな損失も積み重なると大きな損失になります。最初の細菌遠心分離後、沈殿物が不必要に希釈されないように、上清を完全に除去してください。溶液Iを加えた後、沈殿物は完全に再懸濁され、明らかな凝集塊が残っていない状態になっているはずです。

基本的な手順を確認した後も抽出の問題が繰り返し発生する場合は、Solarbio 技術サービスリソース 製品選定やアプリケーションサポートにも利用できます。

どのプラスミド抽出キットが様々なサンプルに適しているか？

サンプルタイプはキット名の前に記載する必要があります。

日常的な小規模プラスミド調製には、D1100プラスミド抽出ミニキットが標準的な作業に対応します。D1110プラスミド抽出マキシキットは、より大規模な調製を対象としています。グラム陽性菌には、D1120およびD1130などの独自の抽出フォーマットがあり、D1160は酵母プラスミド抽出を目的としています。

エンドトキシン感受性のある用途では、必要な調製規模に応じてD1140またはD1150を使用できます。磁気ビーズ処理はDM1100で可能です。

すべてのプラスミドを同じワークフローに無理やり当てはめる必要はありません。出発材料、プラスミドのコピー数、サンプル量、下流での使用目的、および必要なDNA品質など、すべてが選択に影響します。

研究者はSolarbioの 核酸抽出製品 異なる分子生物学ワークフローにおける抽出オプションを比較する場合。

結論

プラスミドDNAの抽出がうまくいかない場合、通常は何らかの原因があり、必ずしもカラムや最終溶出ステップが原因とは限りません。

RNAの混入は、実際の濃度よりも高く見える原因となる。細菌の増殖不良、プラスミドコピー数の低さ、再懸濁不良、溶解の不完全さ、粗雑な取り扱い、中和の不十分さ、または不適切な溶出条件はすべて、最終的にチューブに到達するDNAの量や質を低下させる可能性がある。

実験と同じ順序でトラブルシューティングを行うと効果的です。まず培養液の状態を確認してください。次に、再懸濁、溶解、中和、遠心分離、カラム操作、溶出の各段階を確認してください。

良質なプラスミド調製物とは、装置上で高濃度が得られるだけでなく、DNAが精製されており、その後のあらゆる工程で使用できる状態である必要がある。

プラスミド抽出製品やその他の分子生物学アプリケーションに関する質問については、研究者はSolarbioに以下の方法で問い合わせることができます。 連絡先ページ.

FAQ

Q1：私のプラスミドDNA濃度が予想よりも高いのはなぜですか？

A1：RNA汚染はよくある原因です。RNase Aが欠損しているか、活性を失っている場合、残留RNAによってA260の値が上昇し、測定された核酸濃度が実際のプラスミドDNA濃度よりも高く見えることがあります。

Q2：プラスミドDNAの収量が少ないのはなぜですか？

A2：細菌密度が低い、培養条件が悪い、プラスミドコピー数が少ない、挿入断片が大きい、溶解が不完全、DNAが分解されている、中和が不完全、または溶出効率が悪いといった要因はすべて収量を低下させる可能性があります。最終的な抽出ステップだけに注目するのではなく、細菌培養以降のワークフローを確認することをお勧めします。

Q3：アルカリ溶解の際、細菌細胞は溶液IIにどのくらいの時間浸しておくべきですか？

A3：細胞が適切に溶解するには十分な時間が必要ですが、アルカリ処理を不必要に長く行うべきではありません。このワークフローでは、溶解時間を約5分以内に抑えることで、ゲノムDNAやプラスミドの損傷に関連する問題を軽減できます。

Q4：プラスミドDNAの溶出にはどのpH値を用いるべきですか？

A4：pH8.0～8.5程度の超純水またはTEバッファーを使用できます。pH7.0未満の酸性溶出液を使用すると、シリカ膜からのプラスミド回収率が低下する可能性があります。