Cómo mejorar el rendimiento y la calidad de la extracción de ADN plasmídico: problemas comunes y soluciones.

La extracción de ADN plasmídico parece sencilla una vez que se ha realizado un par de veces. Se cultivan las bacterias, se recoge el sedimento, se lisan las células, se purifica el ADN y se eluye. El problema surge cuando el tubo final no tiene el aspecto esperado.

A veces la concentración es muy baja. Otras veces, la lectura parece inusualmente alta, pero el ADN presenta un rendimiento deficiente en la clonación, la transfección u otro experimento posterior. A menudo se culpa primero al kit de extracción, aunque el problema real puede haber comenzado durante el cultivo bacteriano o incluso durante el primer paso de resuspensión.

Para el trabajo rutinario de biología molecular, la forma más sencilla de solucionar problemas en la extracción de plásmidos es analizar todo el flujo de trabajo en lugar de un paso aislado. Solarbio proporciona una amplia Gama de productos de biología molecular Incluye la extracción de plásmidos, la purificación de ácidos nucleicos y los reactivos de laboratorio relacionados.

¿Por qué mi concentración de ADN plasmídico es demasiado alta?

Una concentración sorprendentemente alta no siempre es una buena noticia.

Una causa común es la contaminación por ARN. Si no se añadió ARNasa A a la Solución I, o si la ARNasa A ha perdido actividad tras un almacenamiento prolongado, el ARN residual puede aumentar la lectura de A260. En consecuencia, el instrumento reporta una mayor concentración de ácido nucleico, aunque parte de esa señal no provenga de ADN plasmídico.

La solución práctica es sencilla. Asegúrese de añadir la ARNasa A a la Solución I antes de la extracción. Si la Solución I preparada ha estado almacenada durante mucho tiempo, conviene comprobar el estado de la ARNasa A antes de preparar otra tanda.

Para los laboratorios que procesan muestras rutinarias de plásmidos bacterianos, el kit D1100 Plasmid Extraction Mini Kit es una opción para la preparación de plásmidos a pequeña escala.

¿Por qué mi rendimiento de ADN plasmídico es demasiado bajo?

Un bajo rendimiento es más complejo porque la pérdida puede ocurrir en varios puntos. Analizar primero el cultivo bacteriano suele ahorrar tiempo.

Verifique el cultivo bacteriano antes de la extracción.

Un crecimiento bacteriano deficiente implica que hay menos plásmido disponible incluso antes de que comience la extracción.

Si la DO600 es demasiado baja, es posible que simplemente no haya suficiente biomasa bacteriana. Un cultivo que se ha dejado reposar demasiado tiempo también puede causar problemas. Una vez que las bacterias superan la etapa de crecimiento deseada, la liberación de nucleasas y la dificultad para la lisis celular pueden afectar el rendimiento final del plásmido.

La contaminación introduce otra variable en el matraz. Los microorganismos no deseados compiten con las bacterias objetivo y pueden alterar las condiciones del cultivo. Los cultivos antiguos o los que han pasado por varios subcultivos también son menos predecibles.

Un método de trabajo práctico consiste en partir de una sola colonia fresca, utilizar un medio apropiado como LB con la concentración correcta de antibiótico y cultivarla durante unas 12 a 16 horas sin permitir un crecimiento excesivo.

Los plásmidos de baja copia necesitan más material de partida.

No todos los plásmidos producen la misma cantidad de ADN.

Los plásmidos grandes y los plásmidos con un número de copias naturalmente bajo pueden generar mucho menos ADN a partir del mismo volumen de cultivo. Un inserto grande, especialmente uno superior a 10 kb, también puede reducir la eficiencia de la replicación.

Si se puede cambiar el vector, un plásmido de mayor número de copias puede facilitar el proceso. Cuando se requiere mantener un plásmido de bajo número de copias, aumentar el volumen del cultivo bacteriano de aproximadamente 5 ml a 10-20 ml puede proporcionar más material de partida.

Una visión más amplia de los reactivos de extracción y la limpieza de ADN está disponible en Reagentes esenciales en la purificación del ADN: una guía completa, lo cual resulta útil cuando el problema parece implicar algo más que el rendimiento del plásmido únicamente.

¿Qué ocurre durante la lisis y la neutralización celular?

Un buen cultivo bacteriano aún puede producir ADN plasmídico de mala calidad si el paso de lisis se maneja incorrectamente.

No realice una lisis insuficiente ni excesiva de las células.

Un exceso de material bacteriano puede saturar la cantidad de solución de lisis utilizada. Asimismo, una exposición breve a la Solución II puede provocar que parte de la población bacteriana no se lise lo suficiente.

Dejar las células en condiciones de lisis alcalina durante demasiado tiempo genera otro problema. Si el tiempo de lisis supera los cinco minutos, el ADN genómico puede dañarse y mezclarse con la preparación del plásmido. Las condiciones fuertemente alcalinas también pueden afectar la calidad del plásmido.

Una vez añadida la Solución II, mezcle suavemente pero a fondo. No es recomendable agitar con fuerza en este caso.

Solarbio también suministra soluciones para la investigación en biología molecular Para laboratorios que trabajan en la extracción, purificación y otras aplicaciones de ácidos nucleicos relacionadas con el ADN.

La neutralización requiere una mezcla y centrifugación adecuadas.

La solución III debe entrar en contacto adecuado con el lisado.

Tras añadirlo, invierta el tubo entre 8 y 10 veces hasta que aparezca un precipitado floculento blanco bastante uniforme. Una mezcla deficiente puede provocar una neutralización incompleta y afectar a la recuperación del plásmido.

La centrifugación es el siguiente paso donde se observan pequeños atajos. Una velocidad de rotación de entre 12 000 y 13 000 rpm durante 10 a 15 minutos ayuda a separar el precipitado del sobrenadante que contiene el plásmido.

Para trabajos con plásmidos en los que el control de endotoxinas es importante, el minikit de extracción de plásmidos sin endotoxinas D1140 ofrece otro formato para la extracción a pequeña escala.

¿Cómo se puede proteger el ADN plasmídico durante la extracción?

El ADN plasmídico puede perderse o dañarse incluso cuando la química de lisis es correcta.

La contaminación por nucleasas es una preocupación. El agua, los tubos, las puntas de pipeta y demás materiales utilizados en contacto con ácidos nucleicos deben ser adecuados. La contaminación por DNasa puede reducir la integridad del ADN, mientras que la actividad no deseada de la RNasa se convierte en un problema en los flujos de trabajo relacionados con el ARN.

La manipulación también es importante. Agitar con fuerza es innecesario durante varias etapas de la preparación del plásmido y puede dificultar la limpieza de la muestra.

Tampoco deben ignorarse los cambios de temperatura. Mantenga constantes las condiciones de extracción, especialmente durante la lisis y la elución.

Los laboratorios que procesan un mayor número de muestras pueden preferir un formato de manipulación diferente. El minikit de extracción de plásmidos DM1100 (método de perlas magnéticas) ofrece la opción de perlas magnéticas junto con los formatos de extracción estándar.

¿Cómo se debe eluir el ADN plasmídico?

El último paso puede echar por tierra silenciosamente una buena extracción.

Utilizar un volumen de elución muy grande puede recuperar ADN, pero la muestra final quedará demasiado diluida. Usar muy poco líquido genera el problema opuesto, ya que la membrana podría no humedecerse lo suficiente para la liberación completa del plásmido.

El pH de la solución de elución también es importante. El agua destilada ácida o el tampón TE con un pH inferior a 7,0 pueden reducir la recuperación del plásmido. Un pH de entre 8,0 y 8,5 es más adecuado para este paso.

La temperatura puede ser útil. Precalentar la solución de elución a unos 60 °C puede mejorar la liberación del ADN plasmídico de la membrana de sílice. Tras añadir la solución, déjela actuar sobre la membrana durante uno o dos minutos antes de centrifugarla, en lugar de hacerlo inmediatamente.

Las pequeñas pérdidas durante la manipulación también se acumulan. Tras la primera centrifugación bacteriana, retire bien el sobrenadante para evitar que el sedimento se diluya innecesariamente. Al añadir la Solución I, el sedimento debe resuspenderse por completo, sin que queden grumos visibles.

Cuando un problema de extracción se repite después de haber comprobado los pasos básicos, Solarbio recursos de servicio técnico También puede utilizarse para la selección de productos y el soporte de aplicaciones.

¿Qué kit de extracción de plásmidos se adapta mejor a las diferentes muestras?

El tipo de muestra debe ir antes del nombre del kit.

Para la preparación rutinaria de plásmidos a pequeña escala, el kit D1100 Plasmid Extraction Mini cubre el trabajo estándar. El kit D1110 Plasmid Extraction Maxi está diseñado para volúmenes de preparación mayores. Las bacterias grampositivas tienen sus propios formatos de extracción, incluidos D1120 y D1130, mientras que D1160 está diseñado para la extracción de plásmidos de levadura.

Las aplicaciones sensibles a las endotoxinas pueden utilizar D1140 o D1150, según la escala de preparación requerida. El procesamiento con perlas magnéticas está disponible a través de DM1100.

No hay razón para obligar a que todos los plásmidos se ajusten al mismo flujo de trabajo. El material de partida, el número de copias del plásmido, el volumen de la muestra, su uso posterior y la calidad del ADN requerida influyen en la elección.

Los investigadores pueden consultar Solarbio productos de extracción de ácidos nucleicos al comparar las opciones de extracción para diferentes flujos de trabajo de biología molecular.

Conclusión

Una extracción deficiente de ADN plasmídico generalmente tiene una razón, y no siempre es la columna o el paso de elución final.

La contaminación por ARN puede hacer que la concentración parezca mayor de lo que realmente es. Un crecimiento bacteriano débil, un número bajo de copias de plásmidos, una resuspensión deficiente, una lisis incompleta, una manipulación brusca, una neutralización débil o unas condiciones de elución inadecuadas pueden reducir la cantidad o la calidad del ADN que finalmente llega al tubo.

Es útil solucionar los problemas en el mismo orden en que se realiza el experimento. Primero, revise el cultivo. Luego, observe la resuspensión, la lisis, la neutralización, la centrifugación, la manipulación de la columna y la elución.

Una buena preparación de plásmidos no solo debe dar una alta concentración en el instrumento. El ADN también debe estar limpio y ser utilizable para cualquier paso posterior.

Para preguntas sobre productos de extracción de plásmidos u otras aplicaciones de biología molecular, los investigadores pueden comunicarse con Solarbio a través de la página de contacto.

Preguntas frecuentes

P1: ¿Por qué mi concentración de ADN plasmídico es mayor de lo esperado?

A1: La contaminación por ARN es una causa común. Si la RNasa A está ausente o ya no está activa, el ARN residual puede aumentar la lectura de A260 y hacer que la concentración de ácido nucleico medida parezca mayor que el nivel real de ADN plasmídico.

P2: ¿Por qué obtengo un bajo rendimiento de ADN plasmídico?

A2: La baja densidad bacteriana, las malas condiciones de cultivo, el bajo número de copias de plásmidos, los insertos grandes, la lisis incompleta, la degradación del ADN, la neutralización incompleta o la elución ineficiente pueden reducir el rendimiento. Es mejor verificar el flujo de trabajo desde el cultivo bacteriano en adelante, en lugar de centrarse únicamente en el paso final de extracción.

P3: ¿Cuánto tiempo deben permanecer las células bacterianas en la Solución II durante la lisis alcalina?

A3: Las células necesitan tiempo suficiente para una lisis adecuada, pero el tratamiento alcalino no debe prolongarse innecesariamente. En este procedimiento, mantener el período de lisis en aproximadamente cinco minutos ayuda a reducir los problemas relacionados con el daño al ADN genómico y a los plásmidos.

P4: ¿Qué pH debe utilizarse para la elución del ADN plasmídico?

A4: Se puede utilizar agua destilada o tampón TE con un pH aproximado de 8,0–8,5. Una solución de elución ácida con un pH inferior a 7,0 puede reducir la recuperación del plásmido de la membrana de sílice.