Ensayo de actividad inhibidora de la tripsina: un método espectrofotométrico sencillo.

La actividad inhibidora de la tripsina es fácil de mencionar, pero no siempre fácil de medir con precisión. Un extracto de soja de apariencia transparente puede contener altas cantidades de inhibidor activo. Una muestra vegetal puede expresar altos niveles de proteínas relacionadas con la defensa, pero esto no se traduce necesariamente en un bloqueo real de la actividad de la tripsina.

Por eso resulta útil un ensayo de actividad. Esta prueba mide el efecto de una proteína inhibidora sobre la tripsina. En lugar de medir la cantidad de proteína inhibidora, se mide su efecto sobre la tripsina. La reacción de color se lee mediante un espectrofotómetro o un lector de microplacas a 405 nm.

El método es práctico para muestras de alimentos, tejido vegetal, materiales para piensos, proteínas purificadas y otras muestras de investigación. Los laboratorios que necesiten combinar esta prueba con otras mediciones de enzimas o proteínas también pueden consultar Solarbio. soluciones para la investigación en ciencias de la vida para productos relacionados y soporte de flujo de trabajo.

¿Qué es un inhibidor de la tripsina?

Un inhibidor de la tripsina es una proteína o péptido que se une a la tripsina para disminuir su actividad enzimática. Los inhibidores de la tripsina se encuentran en plantas, animales y microorganismos.

La tripsina es una serina proteasa que puede descomponer proteínas alimentarias grandes en péptidos más pequeños. En los animales, el páncreas produce tripsina como tripsinógeno, su precursor inactivo. El tripsinógeno se activa a tripsina en el intestino delgado.

Ese paso de activación es importante. La tripsina en nuestro sistema digestivo es muy útil, pero si esta enzima se activara en tejidos de otras partes del cuerpo, los dañaría. Esta acción es inhibida naturalmente por otras proteínas.

En las plantas, los inhibidores de la tripsina son proteínas de defensa que, por ejemplo, pueden interferir con las enzimas digestivas de los insectos y otros organismos que se alimentan de la planta. Por lo tanto, este mismo tipo de molécula puede estudiarse en el marco de la fisiología digestiva, el procesamiento de alimentos, la protección vegetal y la regulación de proteínas.

Inhibidores de tripsina tipo Kunitz

Los inhibidores de tripsina de tipo Kunitz son proteínas de mayor tamaño. Tienen un peso molecular de 18 a 24 kDa. Estos inhibidores suelen tener un sitio reactivo y de dos a tres pares de enlaces disulfuro.

Muchos inhibidores de proteinasas forman un complejo 1:1 con una molécula de tripsina. Este complejo entre el inhibidor y la enzima es muy estable. La enzima, al formar dicho complejo, pierde gran parte de su actividad catalítica.

El inhibidor de tripsina pancreática bovina, también llamado BPTI o aprotinina, es un ejemplo común. Varios inhibidores de proteinasas aislados de la patata también pertenecen a la familia Kunitz.

En la investigación sobre alimentos y piensos, estas proteínas se estudian tras un tratamiento térmico. Si bien la cantidad de proteína inhibidora permanece después del procesamiento, su actividad puede disminuir drásticamente. Por lo tanto, una prueba de actividad resulta más adecuada que una determinación de la proteína total.

Inhibidores de tripsina de Bowman-Birk

Los inhibidores de Bowman-Birk son más pequeños, a menudo de entre 6 y 10 kDa. Su estructura es compacta y generalmente contiene siete pares de enlaces disulfuro.

Una característica útil es que pueden tener dos sitios reactivos distintos. Un sitio puede inhibir la tripsina, mientras que el otro inhibe la quimotripsina. Esto les confiere un rango de inhibición más amplio que el de muchos inhibidores de un solo sitio.

Se encuentran en la soja, la calabaza, el frijol mungo, el frijol rojo, el girasol, el trigo sarraceno y otros materiales vegetales. Su estructura estable ha despertado interés tanto en la ciencia de los alimentos como en la investigación de ingredientes funcionales.

¿Por qué los laboratorios miden la actividad del inhibidor de la tripsina?

Una misma prueba puede responder a preguntas muy diferentes. Un procesador de alimentos podría querer saber si el calentamiento ha reducido la actividad antinutricional. Un investigador de plantas podría querer comparar la resistencia a los insectos entre diferentes muestras. Un laboratorio de proteínas podría estar comprobando la actividad de un lote de inhibidor purificado.

El método de prueba se mantiene similar, pero la forma en que se interpreta el resultado depende del proyecto.

Procesamiento de alimentos y piensos

La soja cruda y otras legumbres pueden contener una cantidad considerable de inhibidor de tripsina activo. Cuando estos alimentos se consumen sin un tratamiento térmico adecuado, la digestión de las proteínas puede volverse menos eficiente.

El organismo puede responder produciendo más enzimas digestivas. En estudios de alimentación a largo plazo, la ingesta elevada de inhibidores también se ha relacionado con cambios en la actividad pancreática.

El calentamiento reduce la actividad del inhibidor, pero más calor no siempre es mejor. Si el tratamiento es demasiado débil, queda demasiado inhibidor activo. Si es demasiado fuerte, las proteínas útiles pueden dañarse y la calidad nutricional puede disminuir.

Un ensayo de actividad inhibidora de la tripsina ayuda a los procesadores a verificar ese equilibrio. Proporciona un resultado directo sobre el inhibidor que permanece activo después del procesamiento.

Solarbio suministra una gama más amplia de kits de ensayo bioquímico Para laboratorios que necesitan medir la actividad enzimática, los metabolitos, los marcadores de estrés oxidativo o propiedades relacionadas de las muestras en un mismo proyecto.

Estudios sobre la defensa de las plantas

Las plantas pueden aumentar la producción de inhibidores de tripsina tras la alimentación de insectos o el ataque de patógenos. El inhibidor ingresa al sistema digestivo del insecto que se alimenta y bloquea parte de su actividad proteolítica.

Esto no siempre mata al insecto directamente. Con mayor frecuencia, dificulta la digestión. El crecimiento puede ralentizarse, la alimentación puede cambiar y el desarrollo puede retrasarse.

Los investigadores pueden comparar la actividad de los inhibidores entre variedades de plantas, grupos de tratamiento o condiciones de estrés. Los datos de expresión génica pueden mostrar si se activa un gen inhibidor. El ensayo de actividad muestra si la proteína producida sigue siendo funcional.

Para proyectos que conectan la actividad inhibidora con la señalización del estrés o los cambios metabólicos, Solarbio recursos de investigación de vías Puede ayudar en la selección de compuestos relacionados, anticuerpos y productos de ensayo.

Control de proteasas en modelos biológicos

Los inhibidores de la tripsina también desempeñan un papel protector en los sistemas animales. SPINK1 es un ejemplo. Limita la activación prematura de la tripsina en el páncreas.

Cuando este control falla, el tejido pancreático puede quedar expuesto a enzimas digestivas activas. Por eso, la regulación de la tripsina se suele abordar en la investigación sobre la pancreatitis.

La aprotinina y otros inhibidores de proteasas también se han estudiado en modelos de inflamación, isquemia, edema y otros. Estos proyectos suelen requerir más de una medición. Una señal enzimática baja puede indicar inhibición, pero no explica todos los cambios biológicos posteriores.

¿Cómo funciona el método espectrofotométrico?

La química básica no es complicada. La tripsina reacciona con un sustrato cromogénico. La reacción libera un producto amarillo. Cuando un inhibidor bloquea la tripsina, se forma menos producto amarillo.

El Solarbio Kit de ensayo de actividad inhibidora de tripsina BC6860/BC6865 Se basa en este principio.

BAPNA como sustrato cromogénico

El BAPNA se utiliza como sustrato para la tripsina. Cuando la tripsina hidroliza el BAPNA, se libera p-nitroanilina.

La p-nitroanilina, a menudo escrita como p-NA, tiene un color amarillo y se puede medir a 405 nm. Una tripsina más activa produce más p-NA, por lo que la absorbancia aumenta.

Cuando una muestra contiene un inhibidor de tripsina, parte de la enzima se bloquea. Se hidroliza menos BAPNA. La cantidad de p-NA disminuye y la lectura de absorbancia se reduce.

Por lo tanto, el ensayo mide la actividad de la tripsina restante después del contacto con la muestra. No tiñe ni mide el inhibidor directamente.

¿Qué significa una lectura baja?

Una absorbancia menor suele significar una inhibición más fuerte, siempre que las reacciones de control y en blanco sean correctas.

Un inhibidor débil deja activa la mayor parte de la tripsina. La reacción permanece amarilla y da una lectura más alta. Un inhibidor fuerte bloquea una mayor cantidad de enzima, por lo que aparece menos producto amarillo.

El cálculo final compara la reacción de la muestra con los controles requeridos. Los resultados pueden expresarse como actividad inhibidora, unidades de inhibición o actividad normalizada según el peso de la muestra o el contenido de proteína.

Las muestras que se encuentren fuera del rango de medición recomendado deben diluirse y volver a analizarse. Utilizar un valor de absorbancia fuera del rango lineal puede dar lugar a un cálculo aparentemente correcto, pero poco fiable.

¿Qué suele provocar una baja repetibilidad?

La mayoría de los problemas no provienen de la idea en la que se basa la prueba, sino del manejo de las muestras.

Extracción de muestras desigual

Las muestras de plantas y alimentos deben molerse bien. Una muestra gruesa o irregular puede liberar diferentes cantidades de inhibidor de una parte a otra.

El peso de la muestra, el volumen de extracción, el tiempo de mezcla, la temperatura de extracción y las condiciones de centrifugación deben mantenerse iguales entre los grupos. Modificar alguno de estos parámetros a mitad del proceso puede afectar el resultado.

Los extractos oscuros o turbios pueden aumentar la absorbancia de fondo. En este caso, es útil utilizar una muestra de referencia. Sin ella, el color natural de la muestra podría confundirse con el del producto de la reacción.

Diferencias de tiempo entre pozos

Las reacciones enzimáticas continúan mientras se manipula la placa o el tubo. Si la primera muestra recibe el sustrato varios minutos antes que la última, la diferencia puede reflejarse en la absorbancia final.

Para placas de mayor tamaño, una pipeta multicanal suele facilitar el control del tiempo. En trabajos con tubos, puede ser mejor procesar grupos pequeños en lugar de comenzar con todas las muestras a la vez.

La temperatura también es importante. La actividad de la tripsina puede cambiar si los reactivos permanecen demasiado tiempo a temperatura ambiente o si los tubos de reacción no se mantienen en las mismas condiciones.

Los laboratorios que trabajan con tipos de muestras inusuales pueden consultar a Solarbio. equipo de servicio técnico sobre extracción, dilución y preparación del ensayo.

Controles faltantes

Un tubo de muestra por sí solo no es suficiente. La prueba necesita controles para la actividad enzimática, el fondo del sustrato, el color de la muestra y otros cambios no enzimáticos en la absorbancia.

Resulta tentador eliminar un control para ahorrar pozos, sobre todo cuando la placa está casi llena. Esto suele causar problemas posteriormente. Un resultado es mucho más difícil de explicar cuando se desconoce la contribución de fondo.

También deben incluirse réplicas técnicas. Cuando los valores de las réplicas difieren mucho, lo primero que hay que comprobar es el pipeteo, la mezcla, el tiempo y la claridad de la muestra.

¿Qué análisis relacionados se pueden utilizar junto con esta prueba?

La actividad inhibidora de la tripsina suele ser solo una parte del proceso.

El kit de ensayo de actividad de tripsina BC2310/BC2315 puede ser útil cuando el proyecto requiere medir la actividad de la tripsina. Analizar simultáneamente la actividad enzimática y la actividad del inhibidor ayuda a diferenciar dos situaciones distintas: baja actividad de tripsina e inhibición severa de la actividad normal de la tripsina.

Otros productos relacionados incluyen el kit de ensayo de actividad inhibidora de la xantina oxidasa BC1020/BC1025, el kit de ensayo de actividad inhibidora de la α-glucosidasa BC6380/BC6385 y el kit de ensayo de actividad inhibidora de la β-galactosidasa BC6450/BC6455.

Estos ensayos son útiles en trabajos de cribado donde se comparan varios inhibidores enzimáticos bajo las mismas condiciones de muestra o extracción. Solarbio también comparte actualizaciones de productos e información de aplicación a través de su sección de noticias de investigación.

¿Por qué utilizar Solarbio para este tipo de ensayo?

Solarbio suministra productos para la investigación en ciencias biológicas desde 2004. Su gama de productos incluye kits de ensayos bioquímicos, anticuerpos, kits ELISA, reactivos de biología celular, productos de tinción, estándares analíticos, bloques de construcción moleculares y compuestos de moléculas pequeñas.

La empresa opera bajo los sistemas de gestión ISO 13485, ISO 9001, ISO 14001 e ISO 45001. Su centro de pruebas cuenta con la acreditación CNAS. Para obtener más información sobre la empresa, el desarrollo de productos y el sistema de calidad, visite el sitio web. Acerca de Solarbio página.

Para un ensayo enzimático de rutina, lo esencial es fundamental: reactivos estables, un protocolo claro, controles adecuados y alguien que pueda responder cuando la muestra no se comporta como se espera. Esto es lo que suele determinar si la segunda prueba coincide con la primera.

Conclusión

El ensayo de actividad inhibidora de la tripsina mide la capacidad de una muestra para bloquear la tripsina. La tripsina hidroliza el BAPNA y libera p-NA de color amarillo. Una mayor inhibición implica una menor cantidad de p-NA, por lo que la absorbancia a 405 nm disminuye.

Este método puede utilizarse para soja, legumbres, tejido vegetal, alimentos, piensos, preparaciones de inhibidores purificados y muestras biológicas. Es fundamental prestar atención a la preparación y el tiempo de las muestras, así como a las reacciones de control y en blanco.

El kit de ensayo de actividad inhibidora de tripsina BC6860/BC6865 ofrece a los laboratorios una opción espectrofotométrica sencilla para este trabajo. Los investigadores que no estén seguros de la compatibilidad de la muestra, las condiciones de extracción o los productos relacionados pueden Contacta con Solarbio antes de configurar la primera ejecución.

Preguntas frecuentes

P1: ¿Qué mide un ensayo de actividad inhibidora de la tripsina?

A1: Mide la capacidad de una muestra para reducir la actividad de la tripsina. El resultado refleja la inhibición funcional, no la cantidad total de proteína inhibidora.

P2: ¿Por qué se utiliza BAPNA en la prueba?

A2: El BAPNA es un sustrato cromogénico para la tripsina. La tripsina lo hidroliza y libera p-nitroanilina amarilla, que se puede medir a 405 nm.

P3: ¿Una menor absorbancia implica una mayor inhibición?

A3: Sí. Cuando se inhibe más la tripsina, se hidroliza menos BAPNA y se produce menos p-nitroanilina. Por lo tanto, la absorbancia disminuye.

P4: ¿Se pueden analizar la soja y otras legumbres?

A4: Sí. La soja, el frijol mungo, el frijol rojo y otros materiales vegetales pueden analizarse tras una extracción adecuada. Las muestras coloreadas o turbias deben incluir una muestra de control.

P5: ¿Por qué son diferentes las lecturas repetidas?

A5: Las razones comunes incluyen molienda desigual, errores de pipeteo, diferentes tiempos de reacción, cambios de temperatura, mezcla deficiente, turbidez de la muestra o ajustes incorrectos del blanco.

P6: ¿La actividad del inhibidor de tripsina es la misma que la actividad de la tripsina?

A6: No. La actividad de la tripsina mide la eficacia con la que la enzima descompone su sustrato. La actividad del inhibidor de la tripsina mide la intensidad con la que una muestra reduce dicha actividad enzimática.