Dosage de l'activité inhibitrice de la trypsine : une méthode spectrophotométrique simple

L'activité inhibitrice de la trypsine est facile à mentionner, mais pas toujours facile à mesurer précisément. Un extrait de soja d'apparence limpide peut néanmoins contenir une quantité importante d'inhibiteur actif. Un échantillon de plante peut exprimer des niveaux élevés de protéines de défense sans que cela se traduise nécessairement par une inhibition effective de l'activité de la trypsine.

C’est pourquoi un test d’activité est utile. Ce test mesure l’effet d’une protéine inhibitrice sur la trypsine. Au lieu de mesurer la quantité de protéine inhibitrice, on mesure son effet sur la trypsine. La réaction colorée est lue à 405 nm à l’aide d’un spectrophotomètre ou d’un lecteur de microplaques.

Cette méthode est pratique pour les échantillons alimentaires, les tissus végétaux, les matières premières pour l'alimentation animale, les protéines purifiées et autres échantillons de recherche. Les laboratoires qui souhaitent combiner ce test avec d'autres mesures d'enzymes ou de protéines peuvent également consulter Solarbio. solutions de recherche en sciences de la vie pour les produits connexes et le support des flux de travail.

Qu'est-ce qu'un inhibiteur de la trypsine ?

Un inhibiteur de trypsine est une protéine ou un peptide capable de se lier à la trypsine et de diminuer son activité enzymatique. On trouve des inhibiteurs de trypsine chez les plantes, les animaux et les micro-organismes.

La trypsine est une sérine protéase capable de cliver les grosses protéines alimentaires en peptides plus petits. Chez les animaux, elle est produite par le pancréas sous forme de trypsinogène, son précurseur inactif. Le trypsinogène est ensuite activé en trypsine dans l'intestin grêle.

Cette étape d'activation est cruciale. La trypsine présente dans notre système digestif est très utile, mais si cette enzyme s'activait dans d'autres tissus de l'organisme, elle les endommagerait. Son activité est naturellement inhibée par d'autres protéines.

Chez les plantes, les inhibiteurs de trypsine sont des protéines de défense qui peuvent, par exemple, interférer avec les enzymes digestives des insectes et autres organismes dont la plante se nourrit. Ainsi, un même type de molécule peut être étudié dans le cadre de la physiologie digestive, de la transformation des aliments, de la protection des plantes et de la régulation des protéines.

Inhibiteurs de trypsine de type Kunitz

Les inhibiteurs de trypsine de type Kunitz sont des protéines de grande taille, d'un poids moléculaire de 18 à 24 kDa. Ces inhibiteurs possèdent généralement un site réactif et 2 à 3 paires de ponts disulfure.

De nombreux inhibiteurs de protéases forment un complexe 1:1 avec une molécule de trypsine. Ce complexe est très stable et l'enzyme, au sein de ce complexe, perd une grande partie de son activité catalytique.

L'inhibiteur de trypsine pancréatique bovin, également appelé BPTI ou aprotinine, en est un exemple courant. Plusieurs inhibiteurs de protéases isolés de la pomme de terre appartiennent également à la famille de Kunitz.

Dans la recherche sur l'alimentation humaine et animale, ces protéines sont étudiées après traitement thermique. Bien que la quantité de protéines inhibitrices soit toujours présente après transformation, leur activité peut chuter brutalement. C'est pourquoi un test d'activité est plus approprié qu'un dosage des protéines totales.

Inhibiteurs de la trypsine de Bowman-Birk

Les inhibiteurs de Bowman-Birk sont plus petits, souvent de l'ordre de 6 à 10 kDa. Leur structure est compacte et contient généralement sept paires de ponts disulfure.

L'un de leurs atouts est la présence de deux sites réactifs distincts. L'un peut inhiber la trypsine, tandis que l'autre inhibe la chymotrypsine. Ceci leur confère un spectre d'inhibition plus large que de nombreux inhibiteurs à site unique.

On les trouve dans le soja, la citrouille, le haricot mungo, le haricot rouge, le tournesol, le sarrasin et d'autres matières végétales. Leur structure stable a suscité un vif intérêt tant en sciences alimentaires que dans la recherche sur les ingrédients fonctionnels.

Pourquoi les laboratoires mesurent-ils l'activité inhibitrice de la trypsine ?

Un même test peut répondre à des questions très différentes. Un industriel de l'agroalimentaire peut vouloir savoir si la cuisson a réduit l'activité antinutritionnelle. Un chercheur en biologie végétale peut vouloir comparer la résistance aux insectes entre différents échantillons. Un laboratoire d'analyse des protéines peut vérifier l'activité d'un lot d'inhibiteur purifié.

La méthode de test reste similaire, mais la manière dont le résultat est interprété dépend du projet.

Transformation des aliments et des aliments pour animaux

Le soja cru et d'autres légumineuses peuvent contenir une quantité notable d'inhibiteur de trypsine actif. Lorsqu'ils sont consommés sans cuisson suffisante, la digestion des protéines peut être moins efficace.

L'organisme peut réagir en produisant davantage d'enzymes digestives. Des études d'alimentation à long terme ont également établi un lien entre un apport élevé en inhibiteurs et des modifications de l'activité pancréatique.

La chaleur diminue l'activité inhibitrice, mais une chaleur excessive n'est pas toujours bénéfique. Un traitement trop faible laisse une quantité excessive d'inhibiteur actif. À l'inverse, un traitement trop fort risque d'endommager les protéines utiles et de dégrader la qualité nutritionnelle.

Un test d'activité inhibitrice de la trypsine permet aux transformateurs de vérifier cet équilibre. Il fournit un résultat direct sur l'inhibiteur encore actif après le traitement.

Solarbio propose une gamme plus étendue de kits de dosage biochimique pour les laboratoires qui ont besoin de mesurer l'activité enzymatique, les métabolites, les marqueurs de stress oxydatif ou les propriétés connexes des échantillons dans le cadre d'un même projet.

Études sur la défense des plantes

Les plantes peuvent augmenter la production d'inhibiteurs de trypsine après une infestation d'insectes ou une attaque pathogène. Cet inhibiteur pénètre dans le système digestif de l'insecte et bloque partiellement son activité protéasique.

Cela ne tue pas toujours l'insecte directement. Le plus souvent, cela ralentit sa digestion. Sa croissance peut être ralentie, son alimentation modifiée et son développement retardé.

Les chercheurs peuvent comparer l'activité inhibitrice entre différentes variétés de plantes, groupes de traitement ou conditions de stress. Les données d'expression génique permettent de déterminer si un gène inhibiteur est activé. Le test d'activité permet de vérifier si la protéine produite est toujours fonctionnelle.

Pour les projets qui établissent un lien entre l'activité inhibitrice et la signalisation du stress ou les changements métaboliques, Solarbio ressources de recherche sur les voies d'accès peut aider à la sélection des composés apparentés, des anticorps et des produits d'analyse.

Contrôle des protéases dans les modèles biologiques

Les inhibiteurs de la trypsine jouent également un rôle protecteur chez les animaux. SPINK1 en est un exemple : il limite l’activation prématurée de la trypsine dans le pancréas.

Lorsque ce mécanisme de régulation est défaillant, le tissu pancréatique peut être exposé à des enzymes digestives actives. C'est l'une des raisons pour lesquelles la régulation de la trypsine est souvent abordée dans la recherche sur la pancréatite.

L'aprotinine et d'autres inhibiteurs de protéases ont également été étudiés dans des modèles d'inflammation, d'ischémie, d'œdème et autres. Ces études nécessitent généralement plusieurs mesures. Une diminution du signal enzymatique peut indiquer une inhibition, mais n'explique pas toutes les modifications biologiques en aval.

Comment fonctionne la méthode spectrophotométrique ?

Le principe chimique de base est simple. La trypsine réagit avec un substrat chromogène. Cette réaction libère un produit jaune. Lorsqu'un inhibiteur bloque la trypsine, la quantité de produit jaune formée diminue.

Le Solarbio Kit de dosage de l'activité inhibitrice de la trypsine BC6860/BC6865 est basé sur ce principe.

BAPNA comme substrat chromogène

Le BAPNA sert de substrat à la trypsine. Lorsque la trypsine hydrolyse le BAPNA, de la p-nitroaniline est libérée.

La p-nitroaniline, souvent notée p-NA, est de couleur jaune et son absorbance peut être mesurée à 405 nm. Plus la trypsine est active, plus elle produit de p-NA, ce qui augmente l'absorbance.

Lorsqu'un échantillon contient un inhibiteur de trypsine, une partie de l'enzyme est bloquée. L'hydrolyse du BAPNA est réduite. La quantité de p-NA diminue et l'absorbance est plus faible.

Ce test mesure donc l'activité trypsique résiduelle après contact avec l'échantillon. Il ne colore ni ne mesure directement l'inhibiteur.

Que signifie une lecture plus basse ?

Une absorbance plus faible signifie généralement une inhibition plus forte, à condition que les réactions témoins et à blanc soient correctes.

Un inhibiteur faible laisse la majeure partie de la trypsine active. La réaction reste jaune et donne une valeur plus élevée. Un inhibiteur fort bloque davantage l'enzyme, donc moins de produit jaune apparaît.

Le calcul final compare la réaction de l'échantillon aux témoins requis. Les résultats peuvent être exprimés en activité inhibitrice, en unités d'inhibition ou en activité normalisée par rapport au poids de l'échantillon ou à sa teneur en protéines.

Les échantillons situés en dehors de la plage de mesure recommandée doivent être dilués et analysés à nouveau. Utiliser une valeur d'absorbance hors de la plage linéaire peut donner un calcul d'apparence élégante, mais peu fiable.

Quelles sont les causes habituelles d'une faible répétabilité ?

La plupart des problèmes ne proviennent pas du principe du test, mais de la manipulation des échantillons.

Extraction d'échantillons inégale

Les échantillons végétaux et alimentaires doivent être finement broyés. Un échantillon grossier ou hétérogène peut libérer des quantités variables d'inhibiteur d'une partie à l'autre.

Le poids de l'échantillon, le volume d'extraction, la durée de mélange, la température d'extraction et les conditions de centrifugation doivent rester identiques d'un groupe à l'autre. Toute modification de ces paramètres en cours d'analyse peut affecter le résultat.

Les extraits foncés ou troubles peuvent augmenter l'absorbance de fond. Un blanc d'échantillon est alors utile. Sans lui, la couleur naturelle de l'échantillon pourrait être confondue avec celle du produit de la réaction.

Différences de temps entre les puits

Les réactions enzymatiques se poursuivent pendant la manipulation de la plaque ou du tube. Si le premier échantillon reçoit le substrat plusieurs minutes avant le dernier, cette différence peut se traduire par une variation de l'absorbance finale.

Pour une plaque de grande taille, une pipette multicanaux facilite généralement le contrôle du temps d'incubation. Pour les analyses en tubes, il peut être préférable de traiter de petits groupes d'échantillons plutôt que de démarrer tous les échantillons simultanément.

La température a également son importance. L'activité de la trypsine peut se modifier si les réactifs restent trop longtemps à température ambiante ou si les tubes à réaction ne sont pas conservés dans les mêmes conditions.

Les laboratoires travaillant avec des types d'échantillons inhabituels peuvent s'adresser à Solarbio. équipe de service technique à propos de l'extraction, de la dilution et de la préparation du test.

Commandes manquantes

Un simple tube à essai ne suffit pas. Le test nécessite des témoins pour l'activité enzymatique, le fond du substrat, la couleur de l'échantillon et d'autres variations d'absorbance non enzymatiques.

Il est tentant de supprimer un témoin pour économiser des puits, surtout lorsque la plaque est presque pleine. Cela engendre généralement des problèmes par la suite. Un résultat est beaucoup plus difficile à expliquer lorsque la contribution du bruit de fond est inconnue.

Il convient également d'inclure des réplicats techniques. Lorsque les valeurs des réplicats sont très éloignées, il faut d'abord vérifier le pipetage, le mélange, le chronométrage et la clarté de l'échantillon.

Quels sont les tests complémentaires qui peuvent être utilisés en parallèle de celui-ci ?

L'activité inhibitrice de la trypsine ne représente souvent qu'une partie du travail.

Le kit de dosage de l'activité trypsique BC2310/BC2315 peut s'avérer utile lorsque le projet nécessite la mesure de l'activité trypsique elle-même. La mesure simultanée de l'activité enzymatique et de l'activité inhibitrice permet de distinguer deux situations différentes : une faible activité trypsique et une forte inhibition de l'activité trypsique normale.

Parmi les autres produits connexes, citons le kit de dosage de l'activité inhibitrice de la xanthine oxydase BC1020/BC1025, le kit de dosage de l'activité inhibitrice de l'α-glucosidase BC6380/BC6385 et le kit de dosage de l'activité inhibitrice de la β-galactosidase BC6450/BC6455.

Ces tests sont utiles pour le criblage, notamment pour comparer plusieurs inhibiteurs enzymatiques dans les mêmes conditions d'échantillon ou d'extraction. Solarbio partage également des mises à jour sur ses produits et des informations sur leurs applications via son site web. section actualités de la recherche.

Pourquoi utiliser Solarbio pour ce type d'analyse ?

Solarbio fournit des produits de recherche en sciences de la vie depuis 2004. Sa gamme de produits comprend des kits de dosage biochimique, des anticorps, des kits ELISA, des réactifs de biologie cellulaire, des produits de coloration, des standards analytiques, des éléments constitutifs moléculaires et des composés à petites molécules.

L'entreprise opère selon les systèmes de management ISO 13485, ISO 9001, ISO 14001 et ISO 45001. Son centre d'essais est accrédité CNAS. Pour plus d'informations sur l'entreprise, le développement de ses produits et son système qualité, veuillez consulter le site web suivant : À propos de Solarbio page.

Pour un dosage enzymatique de routine, les éléments essentiels sont assez simples : des réactifs stables, un protocole clair, des contrôles fonctionnels et une personne capable d’expliquer les résultats lorsque l’échantillon ne se comporte pas comme prévu. C’est généralement ce qui détermine si la seconde analyse correspond à la première.

Conclusion

Le test d'inhibition de la trypsine mesure le degré d'inhibition de la trypsine par un échantillon. La trypsine hydrolyse le BAPNA et libère du p-NA jaune. Une inhibition plus forte signifie une moindre quantité de p-NA, et donc une absorbance plus faible à 405 nm.

Cette méthode peut être utilisée pour le soja, les légumineuses, les tissus végétaux, les aliments pour animaux et pour le bétail, les préparations d'inhibiteurs purifiés et les échantillons biologiques. La préparation des échantillons et le respect du calendrier des analyses sont essentiels, de même que la réalisation des réactions témoins et à blanc.

Le kit de dosage de l'activité inhibitrice de la trypsine BC6860/BC6865 offre aux laboratoires une option spectrophotométrique simple pour ces analyses. Les chercheurs qui ont des doutes quant à la compatibilité des échantillons, aux conditions d'extraction ou aux produits associés peuvent contacter Solarbio avant de configurer le premier cycle.

FAQ (questions fréquentes)

Q1 : Que mesure un test d'activité d'inhibiteur de trypsine ?

A1 : Ce test mesure la capacité d’un échantillon à réduire l’activité de la trypsine. Le résultat reflète l’inhibition fonctionnelle plutôt que la quantité totale de protéine inhibitrice.

Q2 : Pourquoi utilise-t-on le BAPNA dans le test ?

A2 : Le BAPNA est un substrat chromogène pour la trypsine. La trypsine l’hydrolyse et libère de la p-nitroaniline jaune, dont l’absorbance peut être mesurée à 405 nm.

Q3 : Une absorbance plus faible signifie-t-elle une inhibition plus forte ?

A3 : Oui. Lorsque l’inhibition de la trypsine est plus importante, l’hydrolyse du BAPNA et la production de p-nitroaniline diminuent. L’absorbance est donc plus faible.

Q4 : Peut-on tester le soja et les autres légumineuses ?

A4 : Oui. Le soja, le haricot mungo, le haricot rouge et d’autres matières végétales peuvent être testés après extraction appropriée. Les échantillons colorés ou troubles doivent être accompagnés d’un échantillon témoin approprié.

Q5 : Pourquoi les lectures répétées sont-elles différentes ?

A5 : Les raisons courantes incluent un broyage inégal, des erreurs de pipetage, des temps de réaction différents, des changements de température, un mauvais mélange, la turbidité de l’échantillon ou des paramètres de blanc incorrects.

Q6 : L'activité inhibitrice de la trypsine est-elle la même que l'activité de la trypsine ?

A6 : Non. L’activité trypsique mesure l’efficacité avec laquelle l’enzyme décompose son substrat. L’activité inhibitrice de la trypsine mesure l’intensité avec laquelle un échantillon réduit cette activité enzymatique.