Detección de IL-23 humana mediante ELISA en sobrenadantes de cultivos celulares, suero y muestras de plasma.

La IL-23 es una citocina que se mide frecuentemente en estudios sobre inflamación, biología de las células Th17, activación inmunitaria, enfermedades autoinmunes, infecciones e inmunidad antitumoral. Dado que la IL-23 es un componente central del eje IL-23/IL-17, a menudo se evalúa junto con mediadores relacionados como la IL-17A, la IL-22 y el GM-CSF. También se pueden analizar marcadores de vías adicionales según la pregunta biológica.

El procedimiento ELISA en sí no es necesariamente complicado; sin embargo, las variables preanalíticas y biológicas pueden influir notablemente en el resultado. El tipo de célula, las condiciones de estimulación, la duración del cultivo, la manipulación y el almacenamiento de la muestra, así como la concentración esperada de IL-23, pueden afectar el valor medido. En el suero o plasma de donantes sanos, la concentración de IL-23 puede estar por debajo del límite de detección del ensayo, mientras que los cultivos celulares productores de IL-23, estimulados adecuadamente, pueden arrojar concentraciones fácilmente medibles.

Los siguientes ejemplos incluyen preparaciones de células sanguíneas periféricas, células THP-1, células Jurkat, suero y plasma. Asimismo, ilustran un punto importante: la idoneidad de cada modelo para la medición de IL-23 no es equivalente, y los resultados deben interpretarse en función del tipo de célula y las condiciones de estimulación.

¿Qué es la IL-23 humana?

El IL-23 está compuesto por dos subunidades diferentes.

La IL-23 humana pertenece a la familia de citocinas IL-12. Es un heterodímero, no una proteína de cadena simple.

La IL-23 consta de una subunidad p19 codificada por el gen IL23A y una subunidad p40 codificada por el gen IL12B. El precursor humano de la subunidad p19 tiene 189 aminoácidos. La subunidad p40 es compartida con la IL-12, y tanto la p19 como la p40 se asocian formando un heterodímero unido por enlaces disulfuro para constituir la IL-23 biológicamente activa.

Esta estructura es crucial para la detección. Un ensayo destinado a medir la IL-23 intacta debe distinguir el heterodímero p19/p40 de las proteínas relacionadas de la familia IL-12 y de las subunidades aisladas, de acuerdo con la especificidad validada del ensayo. Por lo tanto, se debe confirmar la especificidad de especie y de diana antes de realizar la prueba.

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La IL-23 ayuda a mantener la respuesta Th17.

La IL-23 transmite señales a través de un receptor heterodimérico compuesto por IL-23R e IL-12Rβ1. Este receptor se expresa en diversas poblaciones de células inmunitarias que responden a estímulos, incluidas las células T CD4+ activadas y de memoria.

La activación del receptor de IL-23 activa la vía de señalización asociada a JAK2/TYK2, principalmente STAT3, con una menor contribución de STAT4 en diversos contextos celulares. Esta señalización sustenta el programa efector Th17, que incluye la expresión de RORγt y la producción de IL-17A, IL-22 y GM-CSF.

La IL-23 es especialmente importante para el mantenimiento, la expansión y la función efectora patogénica de las células Th17, en lugar de actuar como el único iniciador de la diferenciación de las células T vírgenes. Por ello, la IL-23 se mide con frecuencia en estudios sobre inflamación crónica, mecanismos autoinmunes, infecciones e inmunidad tumoral.

Los investigadores que estudian la red más amplia pueden utilizar la herramienta de Solarbio. sección de la vía de señalización para encontrar objetivos relacionados y productos de la vía metabólica.

¿Cómo se debe evaluar la IL-23 en cultivos de células de sangre periférica?

La estimulación con LPS requiere una preparación celular adecuada.

Para un experimento de IL-23 inducida por LPS, es más apropiado utilizar células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) u otra preparación que contenga monocitos u otras células presentadoras de antígenos que linfocitos de sangre periférica purificados. La IL-23 es producida predominantemente por monocitos, macrófagos y células dendríticas activadas, y las respuestas al LPS en preparaciones de células sanguíneas humanas dependen en gran medida de las vías innatas de detección de LPS. Si el material original se registró como "linfocitos de sangre periférica", se debe verificar el método de aislamiento y el contenido de monocitos antes de interpretar el resultado.

En el montaje experimental descrito, las células se cultivaron durante 24 o 96 horas, y el sobrenadante del cultivo se recolectó para la medición de IL-23 humana. Si se utilizan concentraciones de LPS de 50 ng/mL y 1 μg/mL, deben considerarse condiciones experimentales específicas del estudio, en lugar de dosis recomendadas universalmente.

Con dos concentraciones de LPS y dos tiempos de recolección, el diseño produce cuatro condiciones estimuladas. Las comparaciones deben realizarse en puntos temporales coincidentes y con un control no estimulado para cada punto temporal.

Los resultados no deben interpretarse como una simple comparación entre dosis altas y bajas. Durante un cultivo de 96 horas, el agotamiento de nutrientes, los cambios en la densidad celular, la muerte celular, las variaciones en la composición celular y la degradación o el consumo de citocinas pueden alterar la concentración medida en el sobrenadante.

En cada punto temporal, se debe mantener un control sin estimulación bajo condiciones de cultivo idénticas. Sin este control, la secreción inducida por LPS no se puede distinguir de forma fiable de la secreción basal ni de los cambios en el cultivo que ocurren con el tiempo.

Los detalles culturales deben mantenerse coherentes.

Pequeñas variaciones en el manejo del cultivo pueden generar grandes diferencias en las mediciones de citocinas. La densidad celular inicial, el porcentaje de suero, el volumen total del cultivo, la preparación de LPS, las condiciones de incubación y el método de recolección deben mantenerse constantes en todos los grupos. En los experimentos con células sanguíneas primarias, también se debe registrar la procedencia del donante y el método de aislamiento celular, ya que las diferencias en el contenido de monocitos pueden afectar significativamente la producción de IL-23 inducida por LPS.

Todos los sobrenadantes deben procesarse de forma consistente después de su recolección. Evite comparar una muestra fresca con una muestra que haya sido sometida a múltiples ciclos de congelación y descongelación.

Solarbio Gama de productos de investigación Incluye kits ELISA, reactivos para cultivo celular, estimulantes y otros productos utilizados en experimentos con células inmunitarias.

¿Cómo funciona la detección de IL-23 en las células THP-1?

Un modelo de células monocíticas con estimulación por LPS

La línea celular de leucemia monocítica humana THP-1 se utiliza ampliamente como modelo reproducible para estudios de señalización inmunitaria innata e inflamación. Las células sanguíneas humanas primarias siguen siendo biológicamente importantes, pero presentan variabilidad entre donantes y tienen una vida útil ex vivo limitada; las células THP-1 pueden complementar, pero no deben reemplazar automáticamente, los experimentos con células primarias.

En este ejemplo, las células THP-1 se cultivaron en medio RPMI-1640 con 10 % de suero fetal bovino. Se añadió LPS a concentraciones finales de 50 ng/ml y 500 ng/ml.

Los sobrenadantes de los cultivos se recogieron después de 24 y 48 horas y luego se analizaron para detectar la presencia de IL-23 humana.

Las dos concentraciones de LPS no deben etiquetarse automáticamente como "moderadas" y "fuertes". La respuesta de las células THP-1 al LPS depende del estado celular, el grado de diferenciación, la densidad celular, las condiciones del suero y la expresión del receptor; una mayor concentración de LPS no produce necesariamente una respuesta de IL-23 proporcionalmente mayor o más interpretable.

Los resultados de THP-1 no deben tratarse como resultados de células primarias.

Las células THP-1 y los monocitos humanos primarios o PBMC no tienen el mismo origen ni comportamiento biológico. Su expresión de receptores, estado de activación, patrón de crecimiento y respuesta al LPS pueden diferir.

Los resultados obtenidos con células THP-1 deben interpretarse primero dentro del marco del modelo THP-1. No deben utilizarse como sustituto directo de los datos obtenidos con células inmunitarias humanas primarias.

Cuando la señal del ensayo es débil, la curva estándar parece inusual o las ejecuciones repetidas no coinciden, Solarbio equipo de servicio técnico Puede ayudar a revisar la elección del producto y las condiciones básicas de la prueba.

¿Son las células Jurkat un modelo apropiado para el estudio de la secreción de IL-23?

La estimulación con PMA requiere una interpretación cautelosa.

Las células Jurkat son una línea celular de leucemia de linfocitos T humanos ampliamente utilizada en estudios de señalización de linfocitos T. Sin embargo, los monocitos activados, los macrófagos y las células dendríticas son las principales fuentes celulares establecidas de IL-23 heterodimérica secretada, por lo que las células Jurkat no constituyen un modelo estándar de producción positiva de IL-23.

En el protocolo descrito, se utilizó PMA a concentraciones finales de 0,2 μg/mL y 10 μg/mL durante tres o cinco días antes de la recolección del sobrenadante. Estas condiciones de estimulación para las células Jurkat son intensas y prolongadas, por lo que no deben considerarse como condiciones de inducción de IL-23 generalmente recomendadas. Cualquier señal de IL-23 obtenida en estas condiciones debe interpretarse junto con los controles no estimulados y los datos de viabilidad celular.

El amplio rango de concentraciones y la exposición durante varios días dificultan una interpretación simple de la relación dosis-respuesta, ya que los cambios en la viabilidad, la proliferación y el estado celular pueden predominar en el resultado medido.

Se debe controlar la viabilidad y el número de células durante todo el experimento, especialmente a concentraciones elevadas de PMA y tras una exposición prolongada. Una señal ELISA detectable por sí sola no garantiza que las células Jurkat constituyan un modelo fisiológicamente adecuado para la producción de IL-23; los resultados positivos inesperados deben confirmarse con los controles apropiados y, cuando sea necesario, con un método ortogonal.

El estimulante y el tipo de célula deben coincidir con el objetivo del estudio.

El LPS y el PMA no son estimulantes intercambiables. El LPS activa la señalización dependiente de TLR4 en las células inmunitarias innatas sensibles, mientras que el PMA activa directamente las vías dependientes de la proteína quinasa C y se utiliza comúnmente para desencadenar la señalización en varios modelos celulares.

El objetivo del experimento debe determinar el modelo celular y el estímulo. Se pueden usar células THP-1 o células primarias de linaje monocítico para estudiar las respuestas innatas al LPS. Las células Jurkat con PMA pueden ser útiles para estudios de señalización de células T, pero esto no las convierte en un modelo validado para la secreción de IL-23. El resultado del ELISA debe interpretarse dentro del contexto biológico del modelo elegido.

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¿Por qué el suero y el plasma normales pueden no mostrar niveles detectables de IL-23?

Los resultados pueden estar por debajo del límite de detección.

En este panel de muestras, se analizaron 20 muestras de plasma humano normal y 20 muestras de suero humano normal, y la IL-23 estuvo por debajo del límite de detección del ensayo en todas las muestras.

Este hallazgo no prueba la ausencia total de IL-23. Significa que, bajo las condiciones de ensayo utilizadas, cualquier cantidad de IL-23 presente estaba por debajo del límite de detección del ensayo.

Muchas citocinas, incluida la IL-23, pueden circular en concentraciones muy bajas en individuos sanos. Las concentraciones medidas también pueden verse influenciadas por el estado inmunitario, la inflamación o la infección, la medicación, la edad, la manipulación de la muestra y otros factores biológicos o preanalíticos.

Un resultado por debajo del límite de detección no implica automáticamente un fallo en el ensayo. Primero se deben revisar la curva de calibración, el rendimiento de las muestras en blanco y de control, la manipulación de la muestra y el procedimiento del ensayo. Si el rendimiento del ensayo es aceptable, el resultado debe informarse como inferior al límite de detección, o según la convención de informes especificada por el fabricante, en lugar de asignarle una concentración exacta.

El suero y el plasma son matrices diferentes.

El suero y el plasma no deben agruparse automáticamente en un solo grupo analítico. Sus métodos de preparación difieren y los efectos de la matriz pueden influir en el rendimiento del ensayo.

Deben documentarse el tubo de recolección, el anticoagulante utilizado para el plasma, las condiciones de coagulación del suero, el tiempo de centrifugación, la temperatura de almacenamiento y el número de ciclos de congelación-descongelación. Estas variables cobran especial importancia cuando la concentración objetivo se encuentra cerca del límite inferior del rango de detección del ensayo.

¿Qué kit ELISA de IL-23 se ajusta a la muestra?

Kit ELISA de IL-23 humana

El SEKH-0034 Kit ELISA de IL-23 humana Puede utilizarse para la detección cuantitativa de IL-23 humana en tipos de muestras humanas validadas, incluidos suero, plasma y sobrenadantes de cultivos celulares, de acuerdo con las instrucciones del producto vigentes.

El producto es relevante para la investigación sobre la inflamación, los estudios relacionados con las células Th17, la estimulación de las células inmunitarias, los mecanismos autoinmunitarios, las infecciones y la inmunidad tumoral.

El kit ELISA SEKH-0034 para IL-23 humana debe utilizarse con matrices de muestra validadas en las instrucciones del producto. Antes de realizar la prueba, también debe considerarse la concentración esperada para que las muestras se encuentren dentro del rango detectable del ensayo, o puedan ajustarse a él mediante un procedimiento de dilución validado.

Kits de IL-23 para otras especies

SEKM-0024 Kit ELISA de IL-23 para ratón Está destinado a muestras de ratón. Kit ELISA SEKR-0072 para IL-23 de rata se utiliza para muestras de ratas y Kit ELISA SEKCN-0130 para IL-23 de pollo Está disponible para la investigación avícola.

Un kit diseñado para una especie no debe utilizarse para otra a menos que se haya comprobado y confirmado la reactividad cruzada. Que los nombres de las proteínas sean similares no significa que los anticuerpos del ensayo reconozcan la proteína diana de la misma manera.

El kit ELISA para IL-23 de ratón y otros kits específicos para cada especie deben seleccionarse en función del modelo animal utilizado en el estudio.

Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. fue fundada en 2004 y desarrolla productos para inmunología, biología celular, biología molecular y bioquímica. Más información sobre sus productos y sistema de calidad está disponible en el Página de la empresa Solarbio.

¿Qué se debe comprobar antes de leer el resultado final?

Comience con la curva estándar.

La curva de calibración debe cumplir con los criterios de aceptación establecidos en el kit y utilizar el método de ajuste de curvas recomendado. Los resultados de las réplicas deben coincidir dentro de los límites de precisión especificados para el ensayo.

La absorbancia del blanco debe permanecer baja. Un valor alto en el blanco puede indicar un lavado incompleto, contaminación, manipulación incorrecta de los reactivos o un tiempo de incubación excesivo.

Las muestras con señales superiores al límite superior de detección del ensayo deben diluirse y volver a analizarse si el protocolo lo permite. Los resultados inferiores al límite inferior de cuantificación no deben informarse como concentraciones exactas, y los resultados inferiores al límite de detección deben informarse como tales.

Repase la preparación de la muestra.

Los valores inesperados de IL-23 suelen llevar a los investigadores a cuestionar primero el kit, pero el origen de la discrepancia puede haberse producido antes en el proceso.

La densidad celular pudo haber variado entre los grupos, el estimulante pudo haberse preparado incorrectamente o el sobrenadante pudo contener restos celulares. Las muestras de suero o plasma también pudieron haber sido sometidas a ciclos repetidos de congelación y descongelación.

El pipeteo, el lavado, el tiempo y la temperatura de incubación, así como la configuración del lector de microplacas, también deben ser consistentes. La prueba ELISA es sensible a las variaciones en la manipulación, especialmente cuando la concentración de citocinas es baja.

Conclusión

La medición de la IL-23 humana puede proporcionar información útil en estudios sobre inflamación y respuesta inmunitaria, pero la concentración medida debe interpretarse en el contexto del diseño experimental completo.

Para estudios de IL-23 inducida por LPS, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) que contienen monocitos, los monocitos primarios o las células dendríticas, así como los modelos de células mieloides debidamente caracterizados, son biológicamente más adecuados que los linfocitos purificados. Las células THP-1 pueden evaluarse con LPS en condiciones de cultivo validadas. Las células Jurkat pueden ser útiles para estudios de señalización de células T mediada por PMA, pero no deben presentarse como un modelo estándar de secreción de IL-23 sin una validación que lo respalde.

En suero y plasma normales, los niveles de IL-23 pueden estar por debajo del límite de detección. Esto puede ser un resultado válido cuando los controles del ensayo y la curva estándar funcionan correctamente.

La selección de especies, el manejo de las muestras, la consistencia del cultivo y la ejecución del ensayo influyen en los datos finales. Si tiene preguntas sobre la selección del kit o las condiciones de la prueba, los investigadores pueden contactar a Solarbio antes de comenzar el ensayo.

Preguntas frecuentes

P1: ¿Qué es la IL-23 humana?

A1: La IL-23 humana es una citocina heterodimérica proinflamatoria de la familia IL-12. Está compuesta por la subunidad p19 codificada por IL-23A y la subunidad p40 codificada por IL-12B.

P2: ¿Por qué está relacionada la IL-23 con las células Th17?

A2: La IL-23 transmite señales a través de un complejo receptor compuesto por IL-23R e IL-12Rβ1. Esto activa la señalización asociada a JAK2/TYK2, con STAT3 como el STAT predominante en la vía descendente en las respuestas relacionadas con Th17.

P3: ¿Se puede detectar la IL-23 humana en los sobrenadantes de cultivos celulares?

A3: Sí. Los sobrenadantes de cultivos celulares pueden analizarse cuando el modelo celular es capaz de producir IL-23 y el tipo de muestra está validado para el kit ELISA. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) que contienen monocitos, los monocitos/macrófagos/células dendríticas primarias y los modelos de células mieloides adecuadamente caracterizados suelen ser más apropiados para los estudios de secreción de IL-23 que los linfocitos purificados o las células Jurkat.

P4: ¿Se puede utilizar LPS en un experimento con IL-23?

A4: Sí. El LPS puede estimular la producción de IL-23 en células inmunitarias innatas sensibles, como monocitos, macrófagos, células dendríticas, preparaciones de PBMC que contienen monocitos y algunos modelos de células mieloides. No debe asumirse que induce la secreción de IL-23 en linfocitos purificados.

P5: ¿Se puede utilizar PMA con células Jurkat?

A5: El PMA puede activar las células Jurkat y es útil en estudios de señalización de células T, pero las células Jurkat no son un modelo estándar de producción positiva para la IL-23 secretada. Los sobrenadantes de células Jurkat tratadas con PMA no deben presentarse como un control positivo validado de IL-23 sin datos que lo respalden.

P6: ¿Por qué a veces la IL-23 es indetectable en el suero o plasma normales?

A6: La IL-23 puede estar presente en una concentración inferior al límite de detección del ensayo. Esto es común con las citocinas de baja abundancia en muestras normales.

P7: ¿Puede un kit ELISA de IL-23 de ratón analizar muestras humanas?

A7: No. Las muestras humanas deben analizarse con un kit ELISA de IL-23 humana a menos que el fabricante haya validado específicamente la reactividad cruzada.

P8: ¿Qué se debe comprobar cuando los pozos duplicados no coinciden?

A8: Se debe revisar la precisión del pipeteo, la mezcla de muestras, el lavado, el tiempo de incubación, la posición de la placa, las burbujas y la preparación de reactivos.