소분자 억제제의 비표적 효과: 좋아 보이는 데이터도 틀릴 수 있는 이유

소분자 억제제는 사용이 간편합니다. 화합물을 첨가하고 일정 시간이 지난 후 신호를 확인하면 됩니다. 이러한 간단한 작업 흐름 덕분에 신약 개발, 표적 검증 및 세포 생물학 연구에서 널리 사용되고 있습니다.

결과물이 실제보다 더 깔끔해 보일 때 문제가 시작됩니다.

화합물은 의도한 표적 외에도 수많은 다른 단백질과 결합할 수 있습니다. 화합물의 농도가 낮을 ​​때는 이러한 상호작용이 큰 문제가 되지 않을 수 있습니다. 그러나 농도가 높아지면 다른 상호작용들이 관찰되는 표현형의 주요 원인이 될 수 있습니다. 즉, 세포에 변화가 생기고, 분석에서 강한 신호가 나타나며, 시간이 지나면서 매우 유망한 결과가 나온 것처럼 보일 수 있습니다. 하지만 나중에 다른 연구자들은 이러한 결과를 재현하지 못할 수도 있습니다.

이것이 바로 비표적 효과를 파악하기 어려운 이유입니다. 비표적 효과는 항상 명확한 오류를 나타내는 것은 아닙니다. 오히려 잘못된 설명에도 불구하고 그럴듯한 데이터를 만들어내는 경우가 더 많습니다.

연구원들은 다음과 같은 일을 하고 있습니다. 소분자 연구 솔루션 첫 번째 실험을 하기 전에 비표적 활동에 대해 생각해야지, 몇 달간의 후속 작업 후에 생각할 필요는 없습니다.

왜 저분자 억제제는 하나 이상의 표적을 공격하는가?

유사한 단백질은 종종 유사한 결합 부위를 가지고 있습니다.

소분자 억제제는 동일한 단백질 계열 구성원들이 공유하는 결합 부위에 결합할 수 있습니다. 키나아제의 경우, ATP 결합 부위는 종종 유사하므로 하나의 키나아제를 억제하기 위해 개발된 화합물은 관련 계열의 다른 여러 키나아제도 억제할 수 있습니다.

SP600125는 흔히 JNK 억제제로 사용됩니다. 유용하긴 하지만 완벽한 단일 표적 화합물은 아닙니다. 용량 및 실험 환경에 따라 PI3Kδ, S6K1 및 기타 키나아제에도 영향을 미칠 수 있습니다.

SP600125가 사이토카인 생성, 세포 성장 또는 생존에 변화를 일으킨다고 해서 그 결과를 즉시 JNK 억제제로 단정해서는 안 됩니다. 화학적 구조가 다른 다른 JNK 억제제를 사용하거나 유전자 발현 억제를 통해 확인할 수 있습니다. 이러한 교차 검증 없이는 작용 기전을 명확히 규명할 수 없습니다.

연구자들은 검토할 수 있습니다. 소분자 화합물 표적, 경로 및 적용 분야를 고려하여 효과적인 화합물을 선택합니다.

화학 구조는 비특이적 결합을 생성할 수 있습니다.

일부 화합물은 막, 혈청 단백질, 플라스틱 표면 또는 관련 없는 단백질에 더 잘 달라붙습니다. 높은 친지성은 이러한 현상의 한 가지 경고 신호입니다.

클로파지민은 소수성 방향족 구조를 가지고 있으며 높은 LogP 값을 나타냅니다. 지질막 및 혈청 단백질과 강하게 결합할 수 있습니다. 배양 배지에 첨가된 양과 세포 내 표적에 도달하는 양은 매우 다를 수 있습니다.

이는 세포주 또는 혈청 조건에 따른 결과를 비교할 때 중요합니다. 어떤 화합물이 한 시스템에서 더 활성이 높은 것처럼 보이는 이유는 단순히 자유 화합물의 존재량이 더 많기 때문일 수 있습니다. 생물학적 결과를 해석하기 전에 용해도, 응집, DMSO 농도 및 혈청 농도를 확인해야 합니다.

농도에 따라 선택성이 변합니다.

선택성은 모든 투여량에서 고정되어 있지 않습니다.

화합물의 단일 투여량은 10 nM에서 높은 선택성을 보일 수 있지만, 후속 세포 기반 실험에서 10 µM 농도에서는 매우 광범위한 효과를 나타내는 화합물로 판명될 수 있습니다.

알리서팁은 오로라 A 억제제로 사용됩니다. 적절한 나노몰 농도에서 명확한 오로라 A 활성을 나타낼 수 있습니다. 선택적 농도 범위를 벗어나는 농도에서는 오로라 B 억제 및 더 광범위한 세포 효과가 나타날 가능성이 높아집니다.

더 강한 표현형이 항상 더 나은 결과는 아닙니다. 때로는 단순히 해당 화합물이 선택 범위를 벗어났다는 의미일 뿐입니다.

목표 외 활동이 실험에 어떤 영향을 미칠 수 있을까요?

이는 위양성 표현형을 유발할 수 있습니다.

작은 분자 하나가 의도한 표적과는 무관한 이유로 세포 생존력을 감소시킬 수 있습니다. 예를 들어, 이 화합물은 미토콘드리아 기능에 영향을 미치거나, 세포막을 손상시키거나, 산화환원 상태를 변화시키거나, 세포골격에 영향을 줄 수 있습니다.

세포는 둥글어지거나, 떨어져 나가거나, 성장을 멈출 수 있습니다. 이러한 변화는 특히 표적이 이미 세포 생존과 연관되어 있을 때 표적 특이적인 것처럼 보일 수 있습니다.

세포 생존율 결과 하나만으로는 충분하지 않습니다. 형태, 세포 사멸 표지자, 세포 주기 데이터 및 하위 신호 전달 경로를 종합적으로 확인해야 합니다. 경로 데이터베이스 이는 연구자들이 단일 결과 지표에 의존하는 대신 관련 마커를 선택하는 데 도움이 될 수 있습니다.

탐지 방법과 반응할 수 있습니다.

일부 화합물은 세포가 아닌 분석 과정 자체를 방해합니다.

레사주린 기반 분석법은 산화환원 활성 화합물에 민감합니다. 시험 화합물은 세포 대사에 변화가 없더라도 염료를 직접 환원시킬 수 있습니다. 형광 화합물은 배경값을 증가시킬 수 있으며, 유색 화합물은 흡광도 측정값에 영향을 줄 수 있습니다.

이 문제는 번호판 인식기가 여전히 번호를 표시하기 때문에 쉽게 간과될 수 있습니다.

간단한 화합물 단독 대조군을 사용하면 문제를 파악할 수 있습니다. 세포를 제외한 분석 혼합물에 화합물을 첨가하십시오. 신호에 변화가 있다면 검출 화학 반응에 문제가 있는 것입니다. 이 경우 다른 원리를 기반으로 하는 두 번째 분석법을 사용해야 합니다.

더 넓은 솔라바이오 제품군 여기에는 분석 계획 단계에서 조합할 수 있는 소분자 화합물, 세포 분석법, 항체 및 검출 시약이 포함됩니다.

이는 프로젝트 전체를 잘못된 방향으로 이끌 수 있습니다.

가장 큰 비용은 대개 첫 번째 실험의 실패가 아닙니다. 잘못된 메커니즘을 기반으로 한 후속 작업이 바로 그 비용입니다.

연구자는 특정 단백질 억제제가 명확한 표현형을 만들어냈다는 이유로 그 단백질이 특정 경로를 조절한다고 결론 내릴 수 있습니다. 그러면 더 많은 실험이 이어집니다. 동물을 치료하고, 염기서열 분석을 의뢰하고, 첫 번째 결과를 바탕으로 완전한 모델을 구축합니다.

몇 달 후, 다른 억제제나 유전자 제거를 사용해도 동일한 표현형을 재현할 수 없습니다.

화학적 억제는 메커니즘을 뒷받침할 수는 있지만, 그 자체로 메커니즘을 증명할 수는 없습니다.

표적 외 효과를 조기에 발견하는 방법은 무엇일까요?

실제 복용량 범위를 테스트하세요

한 가지 농도만 테스트하면 초기에는 시간을 절약할 수 있지만, 나중에는 오히려 더 많은 작업이 필요해지는 경우가 많습니다.

완전한 용량-반응 곡선은 효과가 시작되는 지점을 보여줍니다. 또한 반응이 목표물의 알려진 효능 근처에서 나타나는지, 아니면 용량이 훨씬 높아진 후에야 나타나는지도 보여줍니다.

예상되는 표적 단백질이 20nM 농도에서 억제되는데, 세포 표현형이 5µM 농도에서만 나타난다면 그 차이에 대한 설명이 필요합니다. 세포 침투율이 낮을 수도 있고, 비표적 활성이 나타날 수도 있습니다.

일반적으로 적정 투여량은 안정적이고 반복 가능한 표적 관련 효과를 나타내는 가장 낮은 농도여야 합니다.

 해당 화합물을 유전학적 방법과 비교하십시오.

CRISPR 유전자 제거, CRISPR 간섭, shRNA 및 siRNA는 동일한 표적을 변경하는 다양한 방법을 제공합니다.

화학적 결과가 유전적 결과와 모든 세부 사항에서 일치할 필요는 없습니다. 약물은 신속하게 작용하는 반면, 유전자 손실은 장기적인 적응을 유발할 수 있습니다. 하지만 궁극적인 방향은 생물학적으로 타당해야 합니다.

억제제가 세포를 사멸시키지만 표적 유전자 결손이 별다른 효과를 나타내지 않는다면, 해당 화합물이 다른 곳에서 작용하고 있을 가능성이 있습니다. 만약 억제제가 표적 유전자가 결손된 세포주에서도 여전히 효과를 나타낸다면, 이는 더욱 강력한 경고 신호입니다.

단백질 연구, 항체 준비 또는 분석법 개발에 추가적인 지원이 필요한 연구자들은 다음을 참고하십시오. 솔라바이오 기술 서비스.

두 개 이상의 측정값을 사용하십시오

세포 생존력 검사 결과 세포에 변화가 생겼다는 것이 밝혀졌지만, 그 이유는 밝혀지지 않았습니다.

두 번째 분석에서는 표적 또는 인근 경로의 이벤트를 조사해야 합니다. 이는 표적 인산화, 기질 인산화, 단백질 위치, 전사체 변화, 효소 활성 또는 직접적인 표적 결합일 수 있습니다.

두 분석법은 동일한 검출 화학에 의존해서는 안 됩니다. 만약 두 방법 모두 동일한 화합물 특성에 영향을 받을 수 있다면, 진정으로 독립적인 분석법이라고 할 수 없습니다.

표적 이탈 위험을 줄이는 방법은 무엇일까요?

동일한 표적에 대해 서로 다른 억제제를 사용하십시오.

화학적 구조가 서로 다른 두 화합물을 사용하는 것이 동일한 억제제를 여러 용량으로 반복 투여하는 것보다 훨씬 더 유용합니다.

BTK 연구에서 에보브루티닙, 아칼라브루티닙, 자누브루티닙은 각각 별개의 도구로 비교할 수 있습니다. 이들이 정상적인 활성 범위 내에서 유사한 표현형을 나타낸다면, 결론은 더욱 확실해집니다.

동일한 논리가 EGFR 연구에도 적용됩니다. 오시머티닙과 게피티닙은 결합 방식과 선택성이 다르기 때문에, 한 가지 고용량 치료에서 극단적인 반응을 보이는 것보다 두 화합물 모두에서 유사한 결과를 얻는 것이 더 유용합니다.

차량 제어를 완벽하게 일치시키세요

DMSO는 흔히 무해한 물질로 여겨지지만, 최종 농도가 너무 높아지면 세포가 반응할 수 있습니다.

모든 처리군은 동일한 DMSO 농도를 포함해야 합니다. 0.1%의 차이는 작아 보일 수 있지만, 민감한 세포는 이에 반응할 수 있습니다. 따라서 실제 사용 시 필요한 용매의 양을 최소화하도록 원액 농도를 계획해야 합니다.

세척 실험을 통해 가역성을 확인하십시오

세척 실험은 간단하면서도 종종 유익한 결과를 가져다줍니다.

세포를 처리하고, 화합물을 제거하고, 세포를 세척한 다음, 새로운 배지에서 배양을 계속하십시오. 표현형이 역전되기 시작하면 직접적이고 가역적인 억제일 가능성이 더 높습니다.

이러한 장기적인 효과는 비가역적인 단백질 결합, 신호 전달 경로의 지속적인 변화 또는 일반적인 독성으로 인해 발생할 수 있습니다. 이 테스트는 비표적 효과를 입증하는 것이 아니라, 화합물의 작용 메커니즘에 대한 추가적인 연구가 필요함을 보여줍니다.

화합물의 품질을 무시하지 마십시오

화합물의 순도, 종류, 보관 방법, 그리고 반복적인 냉동-해동 과정은 모두 화합물의 특성에 영향을 미칠 수 있습니다.

변질된 원액은 제품 프로필에 명시되지 않은 활성을 나타낼 수 있습니다. 또한, 용해도가 낮은 물질은 웰 간의 노출 불균일을 초래할 수 있습니다. 동일한 원액 튜브를 여러 번 개봉하는 것보다 소량씩 사용하는 것이 일반적으로 더 안전합니다.

Solarbio는 2004년부터 생명과학 시약 분야에서 사업을 해왔으며, 소분자 화합물, 생화학 시약, 항체, 분석 키트 및 관련 연구 도구를 공급합니다. 회사 및 품질 정보는 웹사이트에서 확인할 수 있습니다. 솔라바이오 회사 페이지제품 및 연구 업데이트는 다음과 같은 곳에서 공유됩니다. 뉴스 센터.

결론

일반적으로 목표 외 효과의 문제는 실험 자체를 완전히 망치는 것이 아니라, 실제 목표에 대한 잘못된 결론으로 ​​이어진다는 점입니다. 대개 결과는 대체로 맞는 것처럼 보입니다.

주요 검증 절차는 복잡하지 않습니다. 실제 용량-반응 곡선을 사용하십시오. 최소 유효 농도에 가깝게 유지하십시오. 서로 다른 억제제를 비교하십시오. 가능하면 유전자 대조군을 추가하십시오. 다른 원리에 기반한 두 번째 분석법을 사용하십시오. 화합물이 검출 화학 반응을 방해하는지 확인하십시오.

이러한 단계는 본 연구 시작 전에 더 많은 시간을 소요하지만, 나중에 프로젝트를 다시 구축하는 것보다 비용이 적게 드는 경우가 많습니다. 화합물 선택, 분석법 매칭 또는 표적 검증에 대한 도움이 필요하면 연구원들은 다음 기관에 문의할 수 있습니다. Solarbio에 문의하세요.

FAQ는

소분자 실험에서 오프타겟 효과란 무엇인가요?

표적 외 효과란 화합물이 의도한 표적 단백질 이외의 다른 단백질과 상호작용할 때 발생합니다. 이러한 추가적인 상호작용은 세포 성장, 신호 전달, 대사 또는 분석 결과에 변화를 일으킬 수 있습니다.

강한 표현형이 나타난다는 것은 억제제가 잘 작용하고 있다는 의미인가요?

항상 그런 것은 아닙니다. 강한 표현형은 고용량 독성, 광범위한 키나아제 억제, 미토콘드리아 손상 또는 분석 간섭으로 인해 나타날 수 있습니다. 결과는 더 낮은 농도에서 다른 검증 방법을 사용하여 확인해야 합니다.

몇 가지 농도의 억제제를 테스트해야 할까요?

한두 번의 투여량 측정보다는 전체 용량-반응 곡선을 얻는 것이 더 좋습니다. 측정 범위는 예상되는 목표 효능보다 낮거나 높은 농도를 포함해야 하며, 명백한 독성 범위로 너무 벗어나지 않아야 합니다.

CRISPR 유전자 재조합을 통한 유전자 검증이 소분자 검증을 대체할 수 있을까요?

아니요. 화학적 억제와 유전자 제거는 관련은 있지만 서로 다른 질문에 대한 답을 제시합니다. 두 가지 방법을 모두 사용하면 더 나은 관점을 얻을 수 있는데, 화합물은 빠르게 작용하는 반면 유전자 제거는 장기적인 세포 적응을 유발할 수 있기 때문입니다.

두 억제제가 서로 다른 화학적 구조를 가져야 하는 이유는 무엇일까요?

구조적으로 유사한 억제제는 동일한 비표적 활성을 공유할 수 있습니다. 서로 다른 골격 구조는 두 화합물이 동일한 이유로 동일한 잘못된 표현형을 생성할 가능성을 줄여줍니다.

화합물이 세포 생존력 검사에 영향을 미치는지 어떻게 확인할 수 있나요?

세포를 제외하고 화합물만 포함된 대조군을 실행하십시오. 분석 신호에 변화가 있다면 화합물이 염료 또는 검출 시약과 반응하고 있을 가능성이 있습니다. 다른 방법을 사용한 두 번째 분석을 수행해야 합니다.