Effets hors cible des inhibiteurs à petites molécules : pourquoi des données apparemment prometteuses peuvent être erronées

Les inhibiteurs à petites molécules sont faciles à utiliser : il suffit d’ajouter le composé et, après un temps déterminé, de vérifier le signal. C’est cette simplicité qui explique leur popularité dans la recherche sur la découverte de médicaments, la validation de cibles et la biologie cellulaire.

Le problème commence lorsque le résultat paraît plus net qu'il ne l'est réellement.

Outre sa cible principale, un composé peut se lier à de nombreuses autres protéines. À faibles doses, cela peut être négligeable. Cependant, à doses plus élevées, ces interactions peuvent devenir la principale cause des phénotypes observés. Autrement dit, les cellules ont subi des modifications, le test génère désormais des signaux forts et, après un certain temps, les résultats obtenus semblent très prometteurs. Pourtant, par la suite, il est impossible de reproduire ces résultats.

C’est ce qui rend les effets hors cible difficiles à gérer. Ils ne produisent pas toujours une erreur évidente. Le plus souvent, ils génèrent des données plausibles, mais avec une explication erronée.

Des chercheurs travaillant avec solutions de recherche sur les petites molécules Il faut réfléchir aux activités hors cible avant la première expérience, et non après plusieurs mois de travaux de suivi.

Pourquoi les inhibiteurs à petites molécules ciblent-ils plusieurs cibles ?

Les protéines similaires possèdent souvent des sites de liaison similaires.

Les inhibiteurs de petites molécules peuvent se lier aux poches communes aux membres d'une même famille de protéines. Dans le cas des kinases, les sites de liaison à l'ATP sont souvent similaires, de sorte qu'un composé développé pour inhiber une kinase peut également inhiber plusieurs autres kinases de familles apparentées.

Le SP600125 est couramment utilisé comme inhibiteur de JNK. Bien qu'efficace, il ne s'agit pas d'un composé parfaitement ciblé. Il peut également affecter PI3Kδ, S6K1 et d'autres kinases, selon la dose et le contexte expérimental.

Si le SP600125 modifie la production de cytokines, la croissance cellulaire ou la survie, ce résultat ne doit pas être immédiatement attribué à JNK. Un autre inhibiteur de JNK, doté d'une structure chimique différente, peut s'avérer utile. L'inhibition génétique est également pertinente. Sans cette vérification, le mécanisme demeure incertain.

Les chercheurs peuvent examiner composés à petites molécules en fonction de la cible, de la voie métabolique et de l'application avant de sélectionner un composé actif.

La structure chimique peut créer une liaison non spécifique

Certains composés ont une plus grande affinité pour les membranes, les protéines sériques, les surfaces plastiques ou des protéines non apparentées. Une lipophilie élevée est un signe d'alerte.

La clofazimine possède une structure hydrophobe et aromatique ainsi qu'un LogP élevé. Elle se lie fortement aux membranes lipidiques et aux protéines sériques. La quantité ajoutée au milieu de culture peut être très différente de celle qui atteint la cible intracellulaire.

Cela a son importance lors de la comparaison des résultats entre différentes lignées cellulaires ou conditions sériques. Un composé peut sembler plus actif dans un système simplement parce qu'une plus grande quantité de composé libre est disponible. La solubilité, l'agrégation, le taux de DMSO et la concentration sérique doivent être vérifiés avant d'interpréter le résultat biologique.

La sélectivité varie en fonction de la concentration

La sélectivité n'est pas fixe à chaque dose.

Une dose unique d'un composé peut montrer une sélectivité élevée à 10 nM, mais s'avérer être un composé à très large spectre à 10 µM dans des expériences cellulaires ultérieures.

L'alisertib est utilisé comme inhibiteur d'Aurora A. À une concentration nanomolaire appropriée, il présente une activité anti-Aurora A marquée. À des concentrations supérieures à sa plage de sélectivité, l'inhibition d'Aurora B et des effets cellulaires plus étendus sont plus probables.

Un phénotype plus marqué n'est pas toujours synonyme de meilleur résultat. Parfois, cela signifie simplement que le composé s'est déplacé hors de sa plage de sélection.

Quels sont les effets d'une activité hors cible sur une expérience ?

Cela peut produire un phénotype faussement positif

Une petite molécule peut réduire la viabilité cellulaire pour des raisons sans lien avec la cible visée. Ce composé peut, par exemple, affecter les fonctions mitochondriales, endommager les membranes, modifier l'état d'oxydoréduction ou altérer le cytosquelette.

Les cellules peuvent s'arrondir, se détacher ou cesser de croître. Ces modifications peuvent sembler spécifiques à une cible, notamment lorsque celle-ci est déjà liée à la survie cellulaire.

Un seul résultat de viabilité ne suffit pas. La morphologie, les marqueurs d'apoptose, les données du cycle cellulaire et la signalisation en aval doivent être vérifiés conjointement. base de données sur les voies métaboliques peut aider les chercheurs à choisir des marqueurs connexes au lieu de se fier à un seul critère d'évaluation.

Il peut réagir avec la méthode de détection

Certains composés interfèrent avec le test plutôt qu'avec les cellules.

Les tests basés sur la résazurine sont sensibles aux composés redox-actifs. Un composé testé peut réduire directement le colorant, même en l'absence de modification du métabolisme cellulaire. Les composés fluorescents peuvent augmenter le bruit de fond. Les composés colorés peuvent influencer les mesures d'absorbance.

Ce problème est facile à manquer car le lecteur de plaques d'immatriculation affiche toujours un numéro.

Un simple contrôle avec le composé seul peut révéler le problème. Ajoutez le composé au mélange réactionnel sans cellules. Si le signal change, la chimie de détection est altérée. Il convient alors d'utiliser un second test basé sur un autre principe.

Plus large Gamme de produits Solarbio Il comprend des composés à petites molécules, des tests cellulaires, des anticorps et des réactifs de détection qui peuvent être associés lors de la planification des tests.

Cela peut faire dérailler tout le projet.

Le coût le plus important n'est généralement pas l'échec de la première expérience, mais le travail de suivi qui repose sur une méthodologie erronée.

Un chercheur peut conclure qu'une protéine contrôle une voie de signalisation car un inhibiteur a induit un phénotype clair. D'autres expériences sont alors menées : des animaux sont traités, le séquençage est commandé et un modèle complet est élaboré à partir du premier résultat.

Des mois plus tard, le même phénotype ne peut être reproduit ni avec un autre inhibiteur ni avec une inactivation génique.

L'inhibition chimique peut étayer un mécanisme. Elle ne peut cependant pas, à elle seule, prouver le mécanisme.

Comment détecter précocement les effets indésirables ?

Tester une gamme de doses réelles

Tester une seule concentration permet de gagner du temps au départ, mais cela engendre souvent plus de travail par la suite.

Une courbe dose-réponse complète indique le point de départ de l'effet. Elle permet également de déterminer si la réponse apparaît à proximité de la concentration connue de la cible ou seulement après que la dose soit beaucoup plus élevée.

Si la cible attendue est inhibée à 20 nM, mais que le phénotype cellulaire n'apparaît qu'à 5 µM, cet écart nécessite une explication. Une faible pénétration cellulaire est possible, tout comme une activité hors cible.

La dose efficace doit normalement correspondre à la plus faible concentration permettant d'obtenir un effet stable et reproductible sur la cible.

 Comparer le composé aux méthodes génétiques

Les techniques CRISPR knockout, CRISPR interference, shRNA et siRNA offrent différentes manières de modifier une même cible.

Le résultat chimique n'a pas besoin de correspondre en tous points au résultat génétique. Un médicament agit rapidement, tandis que la perte d'un gène peut induire une adaptation à long terme. Néanmoins, l'orientation générale doit être biologiquement cohérente.

Si un inhibiteur tue les cellules mais que l'inactivation du gène cible n'a que peu d'effet, il se peut que le composé agisse ailleurs. Si l'inhibiteur reste efficace dans une lignée cellulaire dépourvue de la cible, c'est un signal d'alarme encore plus fort.

Les chercheurs ayant besoin d'un soutien supplémentaire pour leurs travaux sur les protéines, la préparation d'anticorps ou le développement de tests peuvent consulter Services techniques Solarbio.

Utiliser plusieurs lectures

Un test de viabilité indique que les cellules ont subi des modifications. Il n'en précise pas la cause.

Une seconde analyse devrait porter sur la cible ou un événement d'une voie de signalisation voisine. Il peut s'agir de la phosphorylation de la cible, de la phosphorylation du substrat, de la localisation de la protéine, d'une modification de la transcription, de l'activité enzymatique ou d'une interaction directe avec la cible.

Les deux analyses ne doivent pas reposer sur la même chimie de détection. Si les deux méthodes peuvent être affectées par une même propriété du composé, elles ne sont pas véritablement indépendantes.

Comment réduire le risque de tirs hors cible ?

Utiliser différents inhibiteurs pour une même cible

Deux composés ayant des structures chimiques différentes sont beaucoup plus utiles que de répéter l'administration du même inhibiteur à plusieurs doses.

Dans le cadre de la recherche sur la BTK, l'évobrutinib, l'acalabrutinib et le zanubrutinib peuvent être comparés comme des outils distincts. S'ils induisent un phénotype similaire dans leurs plages d'activité normales, la conclusion s'en trouve renforcée.

Le même raisonnement s'applique aux études sur l'EGFR. L'osimertinib et le gefitinib se lient différemment et présentent des profils de sélectivité distincts. Il est plus pertinent d'obtenir des résultats concordants avec les deux composés qu'une réponse extrême suite à un traitement à forte dose.

Maintenir un contrôle du véhicule parfaitement adapté

Le DMSO est souvent considéré comme inoffensif, mais les cellules peuvent y réagir lorsque sa concentration finale devient trop élevée.

Chaque groupe de traitement doit contenir le même taux de DMSO. Une différence de 0,1 % peut paraître minime, mais les cellules sensibles peuvent y réagir. La concentration de la solution mère doit être calculée de manière à ce que la dose de travail ne nécessite pas une grande quantité de solvant.

Vérifier la réversibilité par une expérience de lavage

Une expérience de rinçage est simple et souvent instructive.

Traiter les cellules, éliminer le composé, laver les cellules, puis poursuivre la culture dans un milieu frais. Si le phénotype commence à s'inverser, une inhibition directe et réversible est plus probable.

Ces effets persistants peuvent résulter d'une liaison protéique irréversible, de modifications durables des voies de transduction du signal ou d'une toxicité générale. Ce test ne met pas en évidence d'effets hors cible, mais indique plutôt que le mécanisme d'action d'un composé doit être étudié plus en détail.

Ne négligez pas la qualité des composés

La pureté, l'identité, le stockage et les cycles répétés de congélation-décongélation peuvent tous modifier le comportement des composés.

Une solution mère dégradée peut présenter une activité non mentionnée dans le profil du produit. Une dissolution insuffisante peut également entraîner une exposition inégale entre les puits. Il est généralement plus sûr de prélever de petites aliquotes que d'ouvrir plusieurs fois le même tube de solution mère.

Solarbio travaille dans le domaine des réactifs pour les sciences de la vie depuis 2004 et fournit des composés à petites molécules, des réactifs biochimiques, des anticorps, des kits de dosage et des outils de recherche connexes. Vous trouverez des informations sur l'entreprise et la qualité de ses produits sur son site web. page de l'entreprise Solarbio, tandis que les mises à jour sur les produits et la recherche sont partagées dans le centre d'information.

Conclusion

Le problème habituel des effets hors cible n'est pas qu'ils ruinent complètement une expérience, mais plutôt qu'ils conduisent à des conclusions erronées concernant la cible réelle. En général, les résultats semblent globalement corrects.

Les principaux contrôles sont simples. Utiliser une courbe dose-réponse réelle. Se tenir au plus près de la concentration minimale efficace. Comparer différents inhibiteurs. Ajouter des contrôles génétiques lorsque cela est possible. Utiliser un second test basé sur un autre principe. Vérifier si le composé interfère avec la chimie de détection.

Ces étapes prennent plus de temps avant le début de l'étude principale, mais elles sont généralement moins coûteuses que de reconstruire le projet ultérieurement. Pour obtenir de l'aide concernant la sélection des composés, l'adéquation des tests ou la validation des cibles, les chercheurs peuvent contacter Solarbio.

FAQ (questions fréquentes)

Qu’est-ce qu’un effet hors cible dans une expérience sur une petite molécule ?

Un effet hors cible se produit lorsqu'un composé interagit avec des protéines autres que la cible prévue. Ces interactions supplémentaires peuvent modifier la croissance cellulaire, la signalisation, le métabolisme ou les résultats des analyses.

Un phénotype marqué signifie-t-il que l'inhibiteur fonctionne bien ?

Pas toujours. Un phénotype marqué peut être dû à une toxicité à forte dose, à une inhibition généralisée des kinases, à des lésions mitochondriales ou à des interférences lors du dosage. Le résultat doit être vérifié à des concentrations plus faibles et avec une autre méthode de validation.

Combien de concentrations d'inhibiteurs faut-il tester ?

Une courbe dose-réponse complète est préférable à une ou deux doses. La plage de concentrations doit couvrir les valeurs inférieures et supérieures à la puissance cible attendue, sans toutefois s'éloigner excessivement des concentrations manifestement toxiques.

La technique CRISPR knockout peut-elle remplacer la validation par petites molécules ?

Non. L'inhibition chimique et l'inactivation génique répondent à des questions liées mais différentes. Leur utilisation combinée offre une vision plus complète, car les composés agissent rapidement, tandis que l'inactivation peut induire une adaptation cellulaire à long terme.

Pourquoi deux inhibiteurs devraient-ils avoir des structures chimiques différentes ?

Des inhibiteurs structurellement similaires peuvent présenter la même activité hors cible. Des structures différentes réduisent la probabilité que les deux composés induisent le même phénotype erroné pour une même raison sans lien entre eux.

Comment puis-je vérifier si un composé interfère avec un test de viabilité ?

Effectuez un contrôle avec le composé seul, sans cellules. Si le signal du test change, il est possible que le composé réagisse avec le colorant ou le réactif de détection. Dans ce cas, un second test basé sur une autre méthode doit être réalisé.