低分子阻害剤のオフターゲット効果：なぜ見た目の良いデータでも間違っている可能性があるのか

低分子阻害剤は使い方が簡単です。化合物を添加し、一定時間後にシグナルを確認するだけです。このシンプルなワークフローこそが、創薬、標的検証、細胞生物学の研究において、これらの阻害剤が非常に広く利用されている理由です。

問題は、結果が実際よりも綺麗に見える場合に始まる。

化合物は、本来の標的タンパク質に加えて、他の多くのタンパク質にも結合する可能性があります。化合物の投与量が少ない場合、これはほとんど問題になりません。しかし、投与量が増えると、他の相互作用が観察される表現型の主な原因となる可能性があります。つまり、細胞が変化し、アッセイで強いシグナルが得られるようになり、しばらくすると非常に有望な結果が得られたように見えるでしょう。しかし、その後、他の研究者はこれらの結果を再現できなくなる可能性があります。

これが、オフターゲット効果の分析を難しくしている点です。オフターゲット効果は必ずしも明白なエラーを生み出すとは限りません。多くの場合、もっともらしいデータが得られるものの、その説明が間違っているという結果になります。

研究者たちは 小分子研究ソリューション オフターゲット活性については、数ヶ月にわたる追跡調査の後ではなく、最初の実験を行う前に検討する必要がある。

なぜ低分子阻害剤は複数の標的に作用するのか？

類似のタンパク質は、しばしば類似の結合部位を持つ

低分子阻害剤は、同じタンパク質ファミリーに属するメンバー間で共有される結合ポケットに結合することができる。キナーゼの場合、ATP結合部位はしばしば類似しているため、あるキナーゼを阻害するために開発された化合物は、関連するファミリーの他の複数のキナーゼも阻害することができる。

SP600125は一般的にJNK阻害剤として用いられています。有用な薬剤ではありますが、完全な単一標的化合物ではありません。投与量や実験条件によっては、PI3Kδ、S6K1、その他のキナーゼにも影響を与える可能性があります。

SP600125がサイトカイン産生、細胞増殖、または生存に変化をもたらす場合、その結果を直ちにJNKの作用と断定すべきではない。異なる化学構造を持つ別のJNK阻害剤を用いることが有効である。遺伝子ノックダウンも有用である。これらの相互検証なしには、そのメカニズムは依然として不明のままである。

研究者はレビューすることができます 小分子化合物 作用化合物を選択する前に、標的、経路、および用途を考慮する必要があります。

化学構造は非特異的結合を生み出す可能性がある

化合物によっては、細胞膜、血清タンパク質、プラスチック表面、あるいは無関係なタンパク質などに付着しやすいものがある。高い親油性は、その兆候の一つである。

クロファジミンは疎水性で芳香族構造を持ち、LogP値が高い。脂質膜や血清タンパク質と強く結合する性質がある。培養培地に添加した量と、細胞内標的に到達する量は大きく異なる可能性がある。

これは、細胞株や血清条件が異なる場合の結果を比較する際に重要になります。ある化合物が、ある系でより活性が高く見えるのは、単に遊離化合物の量が多いからに過ぎない場合があります。生物学的結果を説明する前に、溶解度、凝集、DMSO濃度、血清濃度を確認する必要があります。

選択性は濃度によって変化する

選択性は、投与量ごとに一定ではありません。

化合物の単回投与では10 nMで高い選択性を示す可能性があるが、その後の細胞ベースの実験では10 µMでは非常に広範囲に作用する化合物であることが判明する。

アリセルチブはオーロラA阻害剤として使用される。適切なナノモル濃度では、明確なオーロラA阻害活性を示す。選択的濃度範囲を超えると、オーロラB阻害およびより広範な細胞への影響が生じる可能性が高くなる。

より強い表現型が必ずしも良い結果を意味するとは限らない。時には、化合物が選択圧の範囲から外れたことを意味するだけである場合もある。

実験において、標的以外の活動はどのような影響を与える可能性があるか？

偽陽性表現型を生じる可能性がある

低分子化合物は、意図した標的とは無関係な理由で細胞の生存率を低下させる可能性がある。例えば、ミトコンドリアの機能に影響を与えたり、細胞膜を損傷したり、酸化還元状態を変化させたり、細胞骨格に影響を与えたりする可能性がある。

細胞は丸みを帯びたり、剥離したり、増殖を停止したりする可能性がある。これらの変化は、特に標的が既に細胞の生存と関連している場合、標的特異的に見えることがある。

生存率の結果が1つだけでは不十分です。形態、アポトーシスマーカー、細胞周期データ、下流シグナル伝達を一緒に確認する必要があります。 パスウェイデータベース これにより、研究者は単一のエンドポイントに頼るのではなく、関連するマーカーを選択することができる。

検出方法と反応する可能性がある

一部の化合物は、細胞ではなくアッセイに干渉する。

レサズリンを用いたアッセイは、酸化還元活性化合物に敏感です。細胞代謝に変化がない場合でも、試験化合物が色素を直接還元する可能性があります。蛍光化合物はバックグラウンドを上昇させる可能性があり、着色化合物は吸光度測定値に影響を与える可能性があります。

この問題は、ナンバープレート読み取り装置が依然として番号を出力するため、見落としやすい。

化合物のみを用いた単純な対照実験で問題点が明らかになる。細胞を含まないアッセイ混合液に化合物を加える。シグナルが変化すれば、検出化学反応に問題があることになる。その場合は、別の原理に基づいた別のアッセイを行うべきである。

より広い Solarbio製品シリーズ これには、アッセイ計画時に組み合わせることができる低分子化合物、細胞アッセイ、抗体、および検出試薬が含まれます。

それはプロジェクト全体を間違った方向に導く可能性がある

最大のコストは、通常、最初の実験の失敗ではなく、誤ったメカニズムに基づいて行われたその後の研究にある。

ある研究者は、ある阻害剤が明確な表現型を引き起こしたという理由だけで、あるタンパク質が特定の経路を制御していると判断するかもしれない。その後、さらなる実験が行われる。動物に処置を施し、遺伝子配列解析を依頼し、最初の結果に基づいて完全なモデルが構築される。

数か月後、別の阻害剤を使用したり、遺伝子ノックアウトを行ったりしても、同じ表現型を再現することはできない。

化学的阻害は、あるメカニズムを支持することはできるが、それ自体でそのメカニズムを証明することはできない。

標的以外の効果を早期に発見するにはどうすればよいか？

実際の投与量範囲をテストする

一つの濃度でテストを行うことは、最初は時間を節約できるが、後々より多くの作業を生み出すことが多い。

完全な用量反応曲線は、効果がどこから始まるかを示します。また、反応が標的の既知の効力付近で現れるのか、それとも用量がはるかに高くなってから初めて現れるのかも示します。

標的が20nMで阻害されるにもかかわらず、細胞表現型が5µMでしか現れない場合、その差を説明する必要がある。細胞への浸透性が低い可能性もあれば、オフターゲット活性の可能性もある。

有効投与量は通常、安定かつ再現性のある標的関連効果が得られる最低濃度であるべきである。

 化合物を遺伝的手法と比較する

CRISPRノックアウト、CRISPR干渉、shRNA、siRNAは、同じ標的を変化させるための異なる方法を提供する。

化学的な結果は、遺伝子的な結果と細部まで完全に一致する必要はない。薬剤は速やかに作用する一方、遺伝子欠損は長期的な適応を引き起こす可能性がある。しかし、主要な方向性は生物学的に理にかなっているべきである。

阻害剤が細胞を死滅させるにもかかわらず、標的遺伝子のノックアウトがほとんど効果を示さない場合、その化合物は別の場所で作用している可能性がある。標的遺伝子を欠損させた細胞株でも阻害剤が依然として効果を発揮する場合は、さらに強い警告となる。

タンパク質研究、抗体調製、またはアッセイ開発に関して追加のサポートが必要な研究者は、以下を参照できます。 Solarbioの技術サービス.

複数の読み出しを使用する

細胞生存率検査では、細胞が変化したことは分かるが、その理由は分からない。

2回目の解析では、標的または近傍の経路イベントを調べるべきである。これには、標的のリン酸化、基質のリン酸化、タンパク質の局在、転写産物の変化、酵素活性、または標的との直接的な結合などが含まれる。

2つのアッセイは、同じ検出化学に依存してはならない。両方の方法が同じ化合物の特性によって影響を受ける可能性がある場合、それらは真に独立した方法とは言えない。

標的外リスクを軽減するにはどうすればよいか？

同じ標的に対して異なる阻害剤を使用する

異なる化学構造を持つ2つの化合物を用いる方が、同じ阻害剤を複数の用量で繰り返し投与するよりもはるかに有用である。

BTK研究においては、エボブルチニブ、アカラブルチニブ、ザヌブルチニブはそれぞれ独立した薬剤として比較することができる。これらの薬剤が通常の活性範囲内で同様の表現型を示す場合、その結論はより確固たるものとなる。

EGFRに関する研究にも同様の論理が当てはまります。オシメルチニブとゲフィチニブは結合様式が異なり、選択性プロファイルも異なります。高用量投与による極端な反応よりも、両方の化合物から得られる結果を比較する方が有用です。

車両制御を完全に一致させる

DMSOは無害とみなされることが多いが、最終濃度が高くなりすぎると細胞が反応する可能性がある。

すべての処理群において、DMSO濃度は同一であるべきです。0.1%の差は小さく見えるかもしれませんが、感受性の高い細胞はこれに反応する可能性があります。原液濃度は、使用濃度に必要な溶媒量が多量にならないように計画する必要があります。

ウォッシュアウト実験で可逆性を確認する

ウォッシュアウト実験は簡単で、多くの場合、有益な情報が得られる。

細胞を処理し、化合物を除去し、細胞を洗浄した後、新しい培地で培養を続ける。表現型が逆転し始めた場合は、直接的かつ可逆的な阻害が起こっている可能性が高い。

このような長期的な影響は、不可逆的なタンパク質結合、シグナル伝達経路の持続的な変化、または一般的な毒性によって生じる可能性があります。この試験はオフターゲット効果を証明するものではなく、むしろ化合物の作用機序をさらに詳しく調べる必要があることを示しています。

化合物の品質を無視してはならない

純度、同一性、保管方法、そして凍結融解の繰り返しは、いずれも化合物の挙動を変化させる可能性がある。

劣化した原液は、製品プロファイルに記載されていない活性を示す可能性があります。また、溶解不良の物質は、ウェル間の曝露量のばらつきを引き起こす可能性があります。同じ原液チューブを何度も開封するよりも、少量ずつ分注する方が通常は安全です。

Solarbioは2004年からライフサイエンス試薬の分野で事業を展開しており、低分子化合物、生化学試薬、抗体、アッセイキット、および関連研究ツールを提供しています。会社および品質に関する情報は、 Solarbio社の企業ページ製品や研究の最新情報は、 ニュースセンター.

結論

オフターゲット効果の一般的な問題点は、実験を完全に台無しにすることではなく、むしろ真のターゲットに関する誤った結論を導き出すことである。通常、結果は概ね正しく見える。

主なチェック項目は複雑ではありません。実際の用量反応曲線を使用してください。最小有効濃度に近い値を使用してください。異なる阻害剤を比較してください。可能な場合は遺伝子コントロールを追加してください。別の原理に基づく別のアッセイを使用してください。化合物が検出化学反応に干渉しないかどうかを確認してください。

これらのステップは主要な研究が始まる前に時間がかかりますが、通常は後でプロジェクトを再構築するよりも費用がかかりません。化合物の選択、アッセイのマッチング、またはターゲットの検証に関するサポートが必要な場合は、研究者は Solarbioに問い合わせる.

FAQ

小分子実験におけるオフターゲット効果とは何ですか？

オフターゲット効果とは、化合物が本来の標的タンパク質以外のタンパク質と相互作用する場合に発生する現象である。こうした余分な相互作用は、細胞増殖、シグナル伝達、代謝、あるいはアッセイ結果に変化をもたらす可能性がある。

強い表現型は、阻害剤がうまく機能していることを意味するのでしょうか？

必ずしもそうとは限りません。強い表現型は、高用量毒性、広範なキナーゼ阻害、ミトコンドリア損傷、またはアッセイ干渉に起因する可能性があります。結果は、より低い濃度で、別の検証方法を用いて確認する必要があります。

阻害剤の濃度はいくつテストすべきでしょうか？

用量反応曲線全体を示す方が、1回または2回の投与量を示すよりも優れている。その範囲は、予想される目標効力の下限と上限を網羅しつつ、明らかに毒性のある範囲に過度に踏み込まないようにする必要がある。

CRISPRによる遺伝子ノックアウトは、低分子化合物の検証に取って代わることができるのか？

いいえ。化学的阻害と遺伝子ノックアウトは、関連するものの異なる疑問に答えるものです。両方を用いることで、より包括的な理解が得られます。なぜなら、化合物は速やかに作用する一方、ノックアウトは長期的な細胞適応を引き起こす可能性があるからです。

なぜ2つの阻害剤は異なる化学構造を持つべきなのか？

構造的に類似した阻害剤は、同じオフターゲット活性を示す可能性がある。異なる骨格構造を用いることで、両方の化合物が同じ無関係な理由で同じ偽表現型を引き起こす可能性を低減できる。

化合物が細胞生存率アッセイに干渉するかどうかを確認するにはどうすればよいですか？

細胞を含まない化合物のみのコントロール実験を実施してください。アッセイシグナルに変化が見られた場合は、化合物が色素または検出試薬と反応している可能性があります。別の方法に基づいた2回目のアッセイを実施してください。