Побочные эффекты ингибиторов малых молекул: почему даже хорошо выглядящие данные могут быть ошибочными.

Ингибиторы на основе малых молекул просты в использовании: нужно добавить соединение и через заданное время проверить сигнал. Именно этот простой рабочий процесс делает их такими популярными в исследованиях в области разработки лекарств, проверки мишеней и клеточной биологии.

Проблема начинается тогда, когда результат выглядит чище, чем есть на самом деле.

Помимо целевого белка, соединение может связываться с большим количеством других белков. При низких дозах это может иметь незначительное значение. Однако при более высоких дозах другие взаимодействия могут стать основной причиной наблюдаемых фенотипов. Это означает, что клетки изменились, анализ теперь дает сильные сигналы, и через некоторое время может показаться, что получены очень многообещающие результаты. Однако позже другие исследователи не смогут воспроизвести эти результаты.

Именно поэтому нецелевые эффекты так сложны. Они не всегда приводят к очевидной ошибке. Чаще всего они дают правдоподобные данные, но с неверным объяснением.

Исследователи, работающие с решения для исследований малых молекул Необходимо учитывать возможность нежелательных побочных эффектов до первого эксперимента, а не после нескольких месяцев последующих исследований.

Почему ингибиторы малых молекул воздействуют на несколько мишеней одновременно?

Схожие белки часто имеют схожие сайты связывания.

Малые молекулярные ингибиторы могут связываться в общих для членов одного и того же семейства белков участках связывания АТФ. В случае киназ, участки связывания АТФ часто схожи, поэтому соединение, разработанное для ингибирования одной киназы, может также ингибировать несколько других киназ родственных семейств.

SP600125 обычно используется в качестве ингибитора JNK. Он эффективен, но не является идеальным соединением, воздействующим только на одну мишень. В зависимости от дозы и экспериментальных условий он также может влиять на PI3Kδ, S6K1 и другие киназы.

Если SP600125 изменяет выработку цитокинов, рост клеток или выживаемость, этот результат не следует сразу же приписывать JNK. Может помочь другой ингибитор JNK с другой химической структурой. Генетическое подавление также полезно. Без этой перекрестной проверки механизм остается неясным.

Исследователи могут провести проверку. соединения малых молекул с учетом мишени, метаболического пути и области применения, прежде чем выбирать подходящее соединение.

Химическая структура может создавать неспецифическое связывание.

Некоторые соединения с большей вероятностью прилипают к мембранам, белкам сыворотки крови, пластиковым поверхностям или несвязанным с ними белкам. Высокая липофильность — один из тревожных признаков.

Клофазимин имеет гидрофобную, ароматическую структуру и высокий показатель LogP. Он способен прочно связываться с липидными мембранами и белками сыворотки. Количество, добавляемое в культуральную среду, может значительно отличаться от количества, достигающего внутриклеточной мишени.

Это важно при сравнении результатов в разных клеточных линиях или условиях сыворотки. Соединение может казаться более активным в одной системе просто потому, что в ней доступно больше свободного соединения. Растворимость, агрегация, уровень ДМСО и концентрация в сыворотке должны быть проверены, прежде чем объяснять биологический результат.

Селективность изменяется в зависимости от концентрации.

Селективность не является постоянной при каждой дозе.

Однократная точечная доза соединения может демонстрировать высокую селективность при концентрации 10 нМ, но в последующих экспериментах на клетках окажется соединением очень широкого спектра действия при концентрации 10 мкМ.

Алисертиб используется в качестве ингибитора Aurora A. При подходящей наномолярной концентрации он может проявлять явную активность в отношении Aurora A. При концентрациях, превышающих его селективный диапазон, становится более вероятным ингибирование Aurora B и более широкое воздействие на клетки.

Более выраженный фенотип не всегда означает лучший результат. Иногда это просто означает, что соединение вышло за пределы своего селективного диапазона.

Как может повлиять на эксперимент нецелевая деятельность?

Это может привести к ложноположительному результату.

Небольшая молекула может снижать жизнеспособность клеток по причинам, не связанным с целевым воздействием. Это соединение может влиять, например, на функции митохондрий, повреждать мембраны, изменять окислительно-восстановительное состояние или воздействовать на цитоскелет.

Клетки могут округляться, отделяться или прекращать расти. Эти изменения могут выглядеть специфичными для конкретного мишени, особенно если мишень уже связана с выживанием клетки.

Одного результата оценки жизнеспособности недостаточно. Необходимо комплексно проверять морфологию, маркеры апоптоза, данные клеточного цикла и сигнальные пути. база данных путей Это может помочь исследователям выбирать связанные маркеры вместо того, чтобы полагаться на один единственный показатель.

Оно может реагировать на метод обнаружения.

Некоторые соединения мешают проведению анализа, а не воздействию на клетки.

Анализы на основе резазурина чувствительны к окислительно-восстановительным соединениям. Тестируемое соединение может напрямую восстанавливать краситель, даже если метаболизм клеток не изменился. Флуоресцентные соединения могут повышать фоновый уровень. Окрашенные соединения могут влиять на показания абсорбции.

Эту проблему легко упустить из виду, поскольку устройство для считывания пластин по-прежнему выдает числовое значение.

Простой контрольный эксперимент с использованием только исследуемого соединения может выявить проблему. Добавьте соединение в реакционную смесь без клеток. Если сигнал изменится, значит, нарушена работа химического метода обнаружения. В этом случае следует использовать второй анализ, основанный на другом принципе.

Более широкий Ассортимент продукции Solarbio Включает в себя соединения малых молекул, клеточные анализы, антитела и реагенты для обнаружения, которые можно подобрать на этапе планирования анализа.

Это может направить весь проект в неправильное русло.

Наибольшие издержки обычно связаны не с неудачным первым экспериментом, а с последующей работой, основанной на неправильном механизме.

Исследователь может прийти к выводу, что один белок контролирует определенный сигнальный путь, потому что один ингибитор вызвал явный фенотип. Затем следуют другие эксперименты. Проводятся эксперименты на животных, заказывается секвенирование, и на основе первого результата строится полная модель.

Спустя несколько месяцев тот же фенотип не удается воспроизвести с помощью другого ингибитора или путем нокаута гена.

Химическое ингибирование может подтвердить механизм. Однако само по себе оно не может доказать этот механизм.

Как можно выявить нежелательные побочные эффекты на ранней стадии?

Проверьте реальный диапазон доз.

Тестирование одной концентрации экономит время на начальном этапе, но часто создает больше работы в дальнейшем.

Полная кривая зависимости доза-эффект показывает, где начинается действие. Она также показывает, проявляется ли реакция вблизи известной эффективности целевого вещества или только после того, как доза значительно увеличивается.

Если ожидаемый целевой белок ингибируется при концентрации 20 нМ, но клеточный фенотип проявляется только при 5 мкМ, то это требует объяснения. Возможно плохое проникновение в клетки. Также возможно нецелевое действие.

В качестве рабочей дозы обычно следует использовать самую низкую концентрацию, обеспечивающую стабильный и воспроизводимый эффект, связанный с целевым веществом.

 Сравните это соединение с помощью генетических методов.

Нокаут с помощью CRISPR, интерференция с помощью CRISPR, shRNA и siRNA предоставляют различные способы изменения одной и той же мишени.

Химический результат не обязательно должен во всех деталях совпадать с генетическим. Лекарство действует быстро, тогда как потеря гена может вызвать долговременную адаптацию. Тем не менее, основное направление должно иметь биологический смысл.

Если ингибитор убивает клетки, но нокаут целевого гена оказывает незначительное воздействие, возможно, соединение действует в другом месте. Если ингибитор продолжает действовать в клеточной линии с отсутствием целевого гена, это еще более серьезный тревожный сигнал.

Исследователи, нуждающиеся в дополнительной поддержке при работе с белками, подготовке антител или разработке анализов, могут обратиться за дополнительной помощью. Технические услуги Solarbio.

Используйте более одного индикатора показаний.

Анализ жизнеспособности показывает, что клетки изменились. Причина изменений не указана.

Второй анализ должен включать исследование целевого объекта или события, происходящего в соседнем сигнальном пути. Это может быть фосфорилирование целевого объекта, фосфорилирование субстрата, локализация белка, изменение транскрипта, активность фермента или прямое взаимодействие с целевым объектом.

Оба метода анализа не должны зависеть от одной и той же химической реакции обнаружения. Если на оба метода может влиять одно и то же свойство соединения, они не являются по-настоящему независимыми.

Как можно снизить риск отклонения от цели?

Используйте разные ингибиторы для одной и той же цели.

Использование двух соединений с различными химическими структурами гораздо эффективнее, чем повторное применение одного и того же ингибитора в нескольких дозах.

В исследованиях BTK эвобрутиниб, акалабрутиниб и занубрутиниб можно сравнивать как отдельные препараты. Если они вызывают схожий фенотип в пределах своих нормальных диапазонов активности, вывод становится более убедительным.

Та же логика применима и к исследованиям EGFR. Осимертиниб и гефитиниб связываются по-разному и имеют разные профили селективности. Совпадающие результаты для обоих соединений более полезны, чем крайний ответ на лечение одной высокой дозой.

Обеспечьте точное соответствие управления автомобилем.

ДМСО часто считают безвредным, но клетки могут реагировать на него, когда конечная концентрация становится слишком высокой.

Во всех группах лечения должно быть одинаковое количество ДМСО. Разница в 0,1% может показаться незначительной, однако чувствительные клетки могут на нее реагировать. Концентрацию исходного раствора следует планировать таким образом, чтобы рабочая доза не требовала большого количества растворителя.

Проверьте обратимость с помощью эксперимента с промыванием.

Эксперимент с промыванием прост и часто информативен.

Обработайте клетки, удалите соединение, промойте клетки, затем продолжите культивирование в свежей среде. Если фенотип начнет меняться в обратную сторону, более вероятным будет прямое и обратимое ингибирование.

Подобные длительные эффекты могут возникать из-за необратимого связывания с белками, устойчивых изменений в сигнальных путях или общей токсичности. Этот тест не доказывает наличие нежелательных побочных эффектов, а лишь указывает на необходимость дальнейшего изучения механизма действия соединения.

Не следует игнорировать качество соединения.

Чистота, идентичность, условия хранения и многократные циклы замораживания-оттаивания — все это может изменять свойства соединения.

Деградировавший исходный раствор может проявлять активность, не указанную в описании продукта. Плохо растворенный материал также может создавать неравномерное распределение между лунками. Небольшие аликвоты обычно безопаснее, чем многократное вскрытие одной и той же пробирки с исходным раствором.

Компания Solarbio работает в сфере реагентов для биологических наук с 2004 года и поставляет низкомолекулярные соединения, биохимические реагенты, антитела, наборы для анализа и сопутствующие исследовательские инструменты. Информацию о компании и качестве продукции можно найти на сайте. Страница компании SolarbioПри этом обновления информации о продуктах и ​​исследованиях публикуются в новостной центр.

Вывод

Обычно проблема с побочными эффектами заключается не в том, что они полностью портят эксперимент, а в том, что приводят к неверным выводам относительно реальной цели. Как правило, результаты выглядят в основном правильными.

Основные проверки несложны. Используйте реальную кривую зависимости доза-эффект. Держитесь близко к минимальной эффективной концентрации. Сравнивайте различные ингибиторы. По возможности добавляйте генетические контроли. Используйте второй анализ, основанный на другом принципе. Проверьте, не мешает ли соединение химическому процессу обнаружения.

Эти этапы занимают больше времени до начала основного исследования, но обычно обходятся дешевле, чем переделывать проект позже. За помощью в выборе соединений, подборе анализов или валидации мишени исследователи могут обратиться к... связаться с Solarbio.

Часто задаваемые вопросы

Что такое побочный эффект в эксперименте с малыми молекулами?

Внецелевое воздействие возникает, когда соединение взаимодействует с белками, отличными от целевой мишени. Эти дополнительные взаимодействия могут изменять рост клеток, передачу сигналов, метаболизм или результаты анализов.

Означает ли выраженный фенотип, что ингибитор работает эффективно?

Не всегда. Выраженный фенотип может быть следствием токсичности высоких доз, широкого ингибирования киназ, повреждения митохондрий или интерференции в анализе. Результат следует проверить при более низких концентрациях и с помощью другого метода валидации.

Сколько концентраций ингибитора следует протестировать?

Полная кривая зависимости доза-эффект лучше, чем одна или две дозы. Диапазон должен охватывать концентрации ниже и выше ожидаемой целевой активности, не заходя слишком далеко в явно токсичный диапазон.

Может ли технология нокаута CRISPR заменить валидацию малых молекул?

Нет. Химическое ингибирование и генетическое нокаутирование отвечают на связанные, но разные вопросы. Использование обоих методов дает более полное представление, поскольку соединения действуют быстро, тогда как нокаутирование может вызывать долговременную клеточную адаптацию.

Почему два ингибитора должны иметь разные химические структуры?

Структурно схожие ингибиторы могут обладать одинаковой нецелевой активностью. Различия в структуре снижают вероятность того, что оба соединения вызовут один и тот же ложный фенотип по одной и той же несвязанной причине.

Как проверить, не мешает ли данное соединение проведению анализа жизнеспособности клеток?

Проведите контрольный эксперимент только с исследуемым соединением, без клеток. Если сигнал анализа изменится, возможно, соединение реагирует с красителем или химическим реагентом. В этом случае следует использовать второй анализ, основанный на другом методе.