Определение человеческого ИЛ-23 методом ИФА в супернатантах клеточных культур, образцах сыворотки и плазмы.

IL-23 — это цитокин, часто измеряемый в исследованиях воспаления, биологии Th17, активации иммунной системы, аутоиммунных заболеваний, инфекций и противоопухолевого иммунитета. Поскольку IL-23 является центральным компонентом оси IL-23/IL-17, его часто оценивают вместе с родственными медиаторами, такими как IL-17A, IL-22 и GM-CSF. В зависимости от биологического вопроса могут также анализироваться дополнительные маркеры сигнальных путей.

Сама процедура ИФА не обязательно сложна; однако преаналитические и биологические переменные могут сильно влиять на результат. Тип клеток, условия стимуляции, продолжительность культивирования, обработка и хранение образцов, а также ожидаемая концентрация ИЛ-23 — все это может влиять на измеряемое значение. В сыворотке или плазме здоровых доноров концентрация ИЛ-23 может быть ниже предела обнаружения анализа, тогда как в культурах клеток, продуцирующих ИЛ-23 и соответствующим образом стимулированных, можно получить легко измеримые концентрации.

Приведенные ниже примеры включают препараты клеток периферической крови, клетки THP-1, клетки Jurkat, сыворотку и плазму. Они также иллюстрируют важный момент: пригодность каждой модели для измерения IL-23 не одинакова, и результаты следует интерпретировать в контексте типа клеток и условий стимуляции.

Что такое человеческий ИЛ-23?

ИЛ-23 состоит из двух разных субъединиц.

Человеческий ИЛ-23 относится к семейству цитокинов ИЛ-12. Это гетеродимер, а не одноцепочечный белок.

IL-23 состоит из субъединицы p19, кодируемой геном IL23A, и субъединицы p40, кодируемой геном IL12B. Человеческий предшественник p19 имеет длину 189 аминокислот. Субъединица p40 является общей для IL-12, и p19 и p40 объединяются в дисульфидно-связанный гетеродимер, образуя биологически активный IL-23.

Эта структура имеет значение для обнаружения. Анализ, предназначенный для измерения интактного ИЛ-23, должен отличать гетеродимер p19/p40 от родственных белков семейства ИЛ-12 и изолированных субъединиц в соответствии с подтвержденной специфичностью анализа. Поэтому перед тестированием следует подтвердить видовую и целевую специфичность.

Компания Solarbio поставляет продукцию для обнаружения цитокинов и другие товары. решения для исследований в области иммунологии для исследований на основе клеток и образцов.

IL-23 помогает поддерживать Th17-ответ.

IL-23 передает сигналы через гетеродимерный рецептор, состоящий из IL-23R и IL-12Rβ1. Этот рецептор экспрессируется на нескольких популяциях иммунных клеток, реагирующих на стимуляцию, включая активированные и клетки памяти CD4+ T.

Взаимодействие с рецептором IL-23 активирует сигнальные пути, связанные с JAK2/TYK2, и преимущественно STAT3, при этом STAT4 в меньшей степени участвует во многих клеточных контекстах. Эта сигнализация поддерживает эффекторную программу Th17, включая экспрессию RORγt и продукцию IL-17A, IL-22 и GM-CSF.

IL-23 особенно важен для поддержания, размножения и патогенной эффекторной функции клеток Th17, а не является единственным инициатором дифференцировки наивных Т-клеток. Именно поэтому IL-23 часто измеряют в исследованиях хронического воспаления, аутоиммунных механизмов, инфекций и противоопухолевого иммунитета.

Исследователи, изучающие более широкую сеть, могут использовать Solarbio. раздел сигнального пути для поиска связанных целевых объектов и продуктов сигнальных путей.

Как следует оценивать уровень IL-23 в культурах клеток периферической крови?

Для стимуляции ЛПС необходима соответствующая подготовка клеток.

Для эксперимента по изучению ИЛ-23, индуцированного ЛПС, более подходящими являются мононуклеарные клетки периферической крови человека (МПК) или другие препараты, содержащие моноциты или другие антигенпрезентирующие клетки, чем очищенные лимфоциты периферической крови. ИЛ-23 преимущественно продуцируется активированными моноцитами, макрофагами и дендритными клетками, а реакции на ЛПС в препаратах клеток крови человека в значительной степени зависят от врожденных механизмов распознавания ЛПС. Если исходный материал был записан как «лимфоциты периферической крови», перед интерпретацией результата следует проверить метод выделения и содержание моноцитов.

В описанной здесь экспериментальной установке клетки культивировали в течение 24 или 96 часов, после чего собирали культуральную жидкость для измерения уровня человеческого ИЛ-23. Если используются концентрации ЛПС 50 нг/мл и 1 мкг/мл, их следует рассматривать как экспериментальные условия, специфичные для данного исследования, а не как универсальные рекомендуемые дозы.

При двух концентрациях ЛПС и двух временах сбора данных, данная схема позволяет получить четыре стимулированных условия. Сравнения следует проводить в одинаковые временные точки, а также с нестимулированным контролем для каждой временной точки.

Полученные результаты не следует интерпретировать как простое сравнение более высокой и более низкой дозы. В течение 96-часового культивирования истощение питательных веществ, изменения плотности клеток, гибель клеток, изменения клеточного состава, а также деградация или потребление цитокинов могут изменять измеренную концентрацию в супернатанте.

Контрольную группу без стимуляции следует поддерживать в идентичных условиях культивирования в каждой временной точке. Без этого контроля невозможно надежно отличить секрецию, индуцированную ЛПС, от базальной секреции или зависящих от времени изменений в культуре.

Необходимо сохранять единообразие в культурных деталях.

Небольшие изменения в методах культивирования могут привести к значительным различиям в измерениях цитокинов. Начальная плотность клеток, процентное содержание сыворотки, общий объем культуры, подготовка ЛПС, условия инкубации и метод сбора должны оставаться неизменными во всех группах. Для экспериментов с первичными клетками крови также следует регистрировать источник донора и метод выделения клеток, поскольку различия в содержании моноцитов могут сильно влиять на уровень ИЛ-23, индуцированный ЛПС.

Все надосадочные жидкости следует обрабатывать одинаково после сбора. Избегайте сравнения свежего образца с образцом, который подвергался многократным циклам замораживания-оттаивания.

Solarbio ассортимент исследовательской продукции Включает в себя наборы для ИФА, реагенты для культивирования клеток, стимуляторы и другие продукты, используемые в экспериментах с иммунными клетками.

Как работает обнаружение IL-23 в клетках THP-1?

Модель моноцитарных клеток со стимуляцией ЛПС

Клеточная линия моноцитарной лейкемии человека THP-1 широко используется в качестве воспроизводимой модели для исследований сигналов врожденного иммунитета и воспаления. Первичные клетки крови человека остаются биологически важными, но демонстрируют вариабельность от донора к донору и имеют ограниченную продолжительность жизни ex vivo; клетки THP-1 могут дополнять, но не должны автоматически заменять эксперименты с первичными клетками.

В этом примере клетки THP-1 культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки. ЛПС добавляли в конечных концентрациях 50 нг/мл и 500 нг/мл.

Супернатанты культуральной среды собирали через 24 и 48 часов, а затем анализировали на содержание человеческого ИЛ-23.

Две концентрации ЛПС не следует автоматически обозначать как «умеренную» и «сильную». Реакция клеток THP-1 на ЛПС зависит от состояния клеток, степени дифференцировки, плотности клеток, условий сыворотки и экспрессии рецепторов; более высокая концентрация ЛПС не обязательно приводит к пропорционально более высокой или более интерпретируемой реакции ИЛ-23.

Результаты анализа THP-1 не следует рассматривать так же, как результаты анализа первичных клеток.

Клетки THP-1 и первичные моноциты человека или периферические мононуклеарные клетки крови (PBMC) имеют различное происхождение и биологическое поведение. Их экспрессия рецепторов, состояние активации, характер роста и реакция на ЛПС могут различаться.

Результаты, полученные на клетках THP-1, следует сначала интерпретировать в рамках модели THP-1. Их не следует использовать в качестве прямой замены данных, полученных на первичных клетках иммунной системы человека.

Когда сигнал анализа слабый, стандартная кривая выглядит необычно, или результаты повторных измерений не совпадают, — сообщает компания Solarbio. группа технического обслуживания может помочь в выборе продукта и определении основных условий тестирования.

Являются ли клетки Jurkat подходящей моделью для изучения секреции ИЛ-23?

Стимуляция PMA требует осторожной интерпретации результатов.

Клетки Jurkat — это линия клеток человеческой Т-клеточной лейкемии, широко используемая для исследований Т-клеточной сигнализации. Однако активированные моноциты, макрофаги и дендритные клетки являются основными установленными клеточными источниками секретируемого гетеродимерного ИЛ-23, поэтому клетки Jurkat не являются стандартной моделью для положительной продукции ИЛ-23.

В описанной здесь схеме PMA использовали в конечных концентрациях 0,2 мкг/мл и 10 мкг/мл в течение трех или пяти дней перед сбором супернатанта. Это сильные и длительные условия стимуляции для клеток Jurkat, и их не следует рассматривать как общепринятые условия индукции IL-23. Любой сигнал IL-23, полученный в этих условиях, следует интерпретировать вместе с нестимулированными контрольными образцами и данными о жизнеспособности клеток.

Широкий диапазон концентраций и многодневное воздействие затрудняют простую интерпретацию зависимости «доза-эффект», поскольку изменения жизнеспособности, пролиферации и состояния клеток могут доминировать в измеряемом результате.

Жизнеспособность и количество клеток следует контролировать на протяжении всего эксперимента, особенно при более высокой концентрации PMA и после длительного воздействия. Наличие обнаруживаемого сигнала ELISA само по себе не доказывает, что клетки Jurkat являются физиологически подходящей моделью для продукции IL-23; неожиданные положительные результаты следует подтверждать с помощью соответствующих контролей и, при необходимости, ортогонального метода.

Стимулятор и тип клеток должны соответствовать цели исследования.

ЛПС и ПМА — это не взаимозаменяемые стимуляторы. ЛПС активирует TLR4-зависимую передачу сигналов в реагирующих клетках врожденного иммунитета, тогда как ПМА напрямую активирует пути, зависящие от протеинкиназы С, и обычно используется для запуска передачи сигналов в нескольких клеточных моделях.

Цель эксперимента должна определять клеточную модель и стимул. Для изучения врожденных иммунных ответов на ЛПС можно использовать клетки THP-1 или первичные клетки моноцитарного происхождения. Клетки Jurkat с PMA могут быть полезны для изучения сигналов Т-клеток, но это не делает клетки Jurkat валидированной моделью секреции ИЛ-23. Результаты ИФА следует интерпретировать в рамках биологии выбранной модели.

Компания Solarbio публикует лабораторные статьи и обновления продукции которые охватывают методы обнаружения с помощью ИФА, клеточные эксперименты и распространенные проблемы тестирования.

Почему в нормальной сыворотке и плазме крови не обнаруживается ИЛ-23?

Результаты могут оказаться ниже предела обнаружения.

В данной выборке были протестированы 20 образцов нормальной плазмы крови человека и 20 образцов нормальной сыворотки крови человека, и во всех образцах уровень IL-23 был ниже предела обнаружения анализа.

Этот результат не доказывает полного отсутствия IL-23. Он означает, что в условиях используемого анализа любое присутствующее количество IL-23 было ниже заявленной предела обнаружения анализа.

Многие цитокины, включая ИЛ-23, могут циркулировать в крови здоровых людей в очень низких концентрациях. Измеренные концентрации также могут зависеть от иммунного статуса, воспаления или инфекции, приема лекарств, возраста, обработки образцов и других биологических или преаналитических факторов.

Результат ниже предела обнаружения не означает автоматически, что анализ не пройден. В первую очередь следует проверить калибровочную кривую, характеристики холостого и контрольного образцов, обработку образцов и процедуру анализа. Если результаты анализа приемлемы, их следует сообщать как результат ниже предела обнаружения или в соответствии с установленными производителем правилами отчетности, а не присваивать точную концентрацию.

Сыворотка и плазма — это разные матрицы.

Сыворотку и плазму не следует автоматически объединять в одну аналитическую группу. Методы их приготовления различаются, и матричные эффекты могут влиять на эффективность анализа.

Необходимо задокументировать тип пробирки для сбора образцов, используемый антикоагулянт для плазмы, условия свертывания сыворотки, время центрифугирования, температуру хранения и количество циклов замораживания-оттаивания. Эти переменные становятся особенно важными, когда целевая концентрация находится вблизи нижней границы диапазона, определяемого методом анализа.

Какой набор для ИФА на IL-23 подходит для данного образца?

Набор для ИФА человеческого ИЛ-23

В SEKH-0034 Набор для ИФА на человеческий IL-23 Может использоваться для количественного определения человеческого ИЛ-23 в валидированных типах образцов человеческого материала, включая сыворотку, плазму и супернатанты клеточных культур, в соответствии с действующими инструкциями по применению продукта.

Данный продукт актуален для исследований воспаления, исследований, связанных с Th17-клетками, стимуляции иммунных клеток, аутоиммунных механизмов, инфекций и противоопухолевого иммунитета.

Набор для ИФА SEKH-0034 Human IL-23 следует использовать с матрицами образцов, валидированными в соответствии с действующей инструкцией к продукту. Перед тестированием также следует учитывать ожидаемую концентрацию, чтобы образцы попадали в диапазон, определяемый анализом, или могли быть приведены в этот диапазон с помощью валидированной процедуры разведения.

Наборы IL-23 для других видов

SEKM-0024 Набор для ИФА для мыши IL-23 предназначен для образцов мышей. Набор для ИФА SEKR-0072 для определения IL-23 у крыс используется для образцов крыс, и Набор для ИФА SEKCN-0130 для определения IL-23 у кур доступен для исследований на курах.

Набор, предназначенный для одного вида, не следует использовать для другого вида, если перекрестная реактивность не была проверена и подтверждена. Схожие названия белков не означают, что антитела в анализе будут распознавать целевой белок одинаково.

Набор для ИФА на мышиный ИЛ-23, а также другие видоспецифические наборы следует выбирать в зависимости от модели животного, используемой в исследовании.

Компания Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. была основана в 2004 году и занимается разработкой продукции для иммунологии, клеточной биологии, молекулярной биологии и биохимии. Более подробная информация о продукции и системе качества доступна на сайте компании. Страница компании Solarbio.

Что следует проверить перед ознакомлением с окончательным результатом?

Начните со стандартной кривой.

Калибровочная кривая должна соответствовать указанным в наборе критериям приемлемости и использовать рекомендуемый метод аппроксимации кривой. Результаты измерений в повторных лунках должны совпадать в пределах указанных в анализе пределов точности.

Показатель абсорбции в контрольном образце должен оставаться низким. Высокий показатель в контрольном образце может указывать на неполное промывание, загрязнение, неправильное обращение с реагентами или чрезмерную инкубацию.

Образцы с сигналами выше верхнего предела обнаружения анализа следует разбавить и повторно протестировать, если это позволяет протокол. Результаты ниже нижнего предела количественного определения не следует указывать в виде точных концентраций, а результаты ниже предела обнаружения следует указывать соответствующим образом.

Вернемся к подготовке образцов.

Неожиданные значения IL-23 часто заставляют исследователей сначала усомниться в эффективности набора реагентов, но источник расхождения мог возникнуть на более раннем этапе работы.

Плотность клеток могла различаться между группами, стимулятор мог быть приготовлен неправильно, или в надосадочной жидкости могли содержаться клеточные обломки. Образцы сыворотки или плазмы также могли подвергаться многократным циклам замораживания-оттаивания.

Необходимо также обеспечить согласованность в выборе параметров пипетирования, промывания, времени и температуры инкубации, а также настроек микропланшетного ридера. Метод ELISA чувствителен к различиям в обращении с образцами, особенно при низкой концентрации цитокина.

Вывод

Измерение уровня человеческого ИЛ-23 может предоставить полезную информацию в исследованиях воспаления и иммунного ответа, но измеренную концентрацию необходимо интерпретировать в контексте всей экспериментальной схемы.

Для исследований IL-23, индуцированного ЛПС, биологически более подходящими являются содержащие моноциты периферические мононуклеарные клетки крови (PBMC), первичные моноциты или дендритные клетки, а также соответствующим образом охарактеризованные модели миелоидных клеток, чем очищенные лимфоциты. Клетки THP-1 можно оценивать с помощью ЛПС в проверенных условиях культивирования. Клетки Jurkat могут быть полезны для исследований сигнализации Т-клеток, опосредованной PMA, но их не следует представлять в качестве стандартной модели секреции IL-23 без подтверждающей валидации.

В нормальных сыворотках и плазме уровень ИЛ-23 может быть ниже предела обнаружения. Это может быть достоверным результатом, если контрольные образцы и стандартная кривая показывают нормальные результаты.

Соответствие видов, обработка образцов, стабильность культуры и выполнение анализа — все это влияет на конечные данные. По вопросам выбора набора реагентов или условий проведения анализа исследователи могут обратиться в компанию Solarbio до начала анализа.

Часто задаваемые вопросы

В1: Что такое человеческий ИЛ-23?

A1: Человеческий ИЛ-23 — это провоспалительный гетеродимерный цитокин из семейства ИЛ-12. Он состоит из субъединицы p19, кодируемой ИЛ-23А, и субъединицы p40, кодируемой ИЛ-12В.

В2: Почему ИЛ-23 связан с клетками Th17?

A2: IL-23 передает сигналы через рецепторный комплекс, состоящий из IL-23R и IL-12Rβ1. Это активирует сигнальный путь, связанный с JAK2/TYK2, при этом STAT3 является преобладающим нисходящим STAT в Th17-опосредованных ответах.

В3: Можно ли обнаружить человеческий ИЛ-23 в супернатантах клеточных культур?

A3: Да. Супернатанты клеточных культур можно тестировать, если клеточная модель способна продуцировать ИЛ-23, а тип образца валидирован для набора ELISA. Моноциты, содержащие периферические мононуклеарные клетки крови (PBMC), первичные моноциты/макрофаги/дендритные клетки и соответствующим образом охарактеризованные модели миелоидных клеток, как правило, больше подходят для исследований секреции ИЛ-23, чем очищенные лимфоциты или клетки Jurkat.

Вопрос 4: Можно ли использовать ЛПС в эксперименте с ИЛ-23?

A4: Да. ЛПС может стимулировать выработку ИЛ-23 в реагирующих клетках врожденного иммунитета, включая моноциты, макрофаги, дендритные клетки, препараты периферических мононуклеарных клеток крови, содержащие моноциты, и некоторые модели миелоидных клеток. Не следует предполагать, что он вызывает секрецию ИЛ-23 из очищенных лимфоцитов.

В5: Можно ли использовать PMA с клетками Jurkat?

A5: PMA может активировать клетки Jurkat и полезен в исследованиях сигнализации Т-клеток, но клетки Jurkat не являются стандартной моделью положительной продукции секретируемого IL-23. Супернатанты клеток Jurkat, обработанные PMA, не следует представлять в качестве подтвержденного положительного контроля IL-23 без подтверждающих данных.

В6: Почему ИЛ-23 иногда не обнаруживается в нормальной сыворотке или плазме?

A6: IL-23 может присутствовать в концентрации ниже предела обнаружения анализа. Это часто встречается у цитокинов с низкой концентрацией в нормальных образцах.

Вопрос 7: Можно ли использовать набор для ИФА определения IL-23 у мышей для анализа образцов человеческого организма?

A7: Нет. Образцы человеческого материала следует тестировать с помощью набора для ИФА на человеческий ИЛ-23, если производитель специально не подтвердил перекрестную реактивность.

В8: Что следует проверить, если дублирующиеся лунки не совпадают?

A8: Необходимо проверить точность дозирования, перемешивание образцов, промывку, время инкубации, положение планшета, образование пузырьков и подготовку реагентов.