شرح العلامات البروتينية الشائعة: His، وGST، وMBP، وFLAG، والعلامات الفلورية

تُستخدم العلامات لأغراضٍ عديدة أثناء إنتاج البروتينات المؤتلفة. فهي تُساعد في تنقية البروتينات وتحديد هويتها ودراسة تفاعلاتها. إذا سبق لك العمل مع البروتينات المؤتلفة، فلا بد أنك صادفت علامة His أو علامة GST أو علامة MBP أو علامة FLAG. تُذكر هذه العلامات في نواقل التعبير المستخدمة لإنتاج البروتين المؤتلف، وفي بروتوكولات تنقيته، وفي الأجسام المضادة المستخدمة للكشف عنه.

حتى عندما يُظهر البروتين حزمة تعبير قوية على هلام SDS-PAGE، قد يكون تنقيته صعبًا للغاية. فقد يُشكّل البروتين تجمعات كبيرة غير قابلة للذوبان، أو قد لا يتفاعل مع هذا الجسم المضاد كما هو متوقع بعد تنقيته بنجاح باستخدام جسم مضاد.

تُستخدم علامات البروتين المختلفة لأغراض متنوعة. بمعرفة خصائص هذه العلامات، يُمكن التخطيط للتجربة المطلوبة قبل حتى طلب الكواشف اللازمة، مما يُساعد على تقليل العديد من المشاكل المحتملة.

ما هي علامات البروتين ولماذا تُستخدم؟

كيف تعمل البروتينات الموسومة

العلامة البروتينية هي عبارة عن ببتيد قصير أو حتى بروتين أكبر يتم دمجه مع بروتين مستهدف بواسطة تقنية الحمض النووي المؤتلف.

يتكون البروتين المدمج الناتج من البروتين المستهدف والعلامة. تُمكّن خصائص العلامة من استخدامها في تنقية البروتينات، وزيادة ذوبانها، والكشف عنها باستخدام الأجسام المضادة في لطخات ويسترن وغيرها من التطبيقات. كما يمكن تتبع البروتينات الموسومة داخل الخلايا.

يمكن ربط علامة بروتينية بالطرف الأميني (N-terminus) أو الطرف الكربوكسيلي (C-terminus) للبروتين المستهدف. وبناءً على بنية البروتين وهدف التجربة، يجب اختيار موقع الربط الأنسب.

لا تؤثر العلامات الصغيرة إلا بشكل طفيف على الحجم الإجمالي للبروتين. في المقابل، يمكن أن تؤثر العلامات الأكبر حجماً على طي البروتين وذوبانه وتفاعلاته.

إن اختيار علامة بروتينية يتجاوز مجرد إيجاد ناقل تعبير مناسب لها.

اختيار العلامات بناءً على الأهداف التجريبية

قبل أن تتمكن من تحديد علامة للتعبير، حدد ما تحتاج إلى القيام به مع التعبير.

في عمليات التنقية الروتينية باستخدام تقنية التقارب، يكفي استخدام علامة الهيستيدين، بينما تُعدّ علامات مثل GST وMBP مفيدة جدًا في حالات مشاكل الذوبان. أما في الكشف باستخدام الأجسام المضادة، فتُستخدم علامة FLAG بكثرة للكشف عن البروتينات المستهدفة. وتُعدّ العلامات الفلورية مفيدة جدًا في دراسات تحديد موقع البروتين.

تختلف علامات الببتيد القصيرة وشركاء الاندماج الأكبر حجمًا في تأثيرها على ذوبان البروتين وتنقيته ووظيفته. تضيف العلامات الصغيرة، مثل His وFLAG، وزنًا جزيئيًا أقل عمومًا، بينما قد تُحسّن الشركاء الأكبر حجمًا، مثل GST وMBP، التعبير القابل للذوبان لبعض البروتينات. يعتمد الاختيار الأمثل على الهدف التجريبي وخصائص البروتين المستهدف.

لا يوجد وسم بروتيني واحد مثالي لجميع البروتينات. يعتمد اختيار الوسم عادةً على عدة معايير، بما في ذلك نظام التعبير المضيف، وخطوات التنقية اللاحقة المخطط لها، ومدى أهمية احتفاظ البروتين المُعبَّر عنه بنشاطه البيولوجي الطبيعي.

بطاقة التعريف الخاصة به وبطاقة ضريبة السلع والخدمات لتنقية البروتين

علامته: علامة صغيرة لكروماتوغرافيا التقارب

تُعد علامة His واحدة من أكثر علامات البروتين استخدامًا في إنتاج البروتينات المؤتلفة.

يتكون وسم 6×His النموذجي من تسلسل ستة بقايا هيستيدين، HHHHHH. يُعدّ صغر حجم وسم 6×His مناسبًا لأنه لا يُضيف وزنًا كبيرًا إلى البروتين المستهدف.

يتم تنقية البروتينات الموسومة بالهيستيدين بشكل شائع باستخدام كروماتوغرافيا تقارب المعادن المثبتة، والمعروفة أيضًا باسم IMAC.

في عملية الفصل الكروماتوغرافي التقاربي لبروتين اندماجي موسوم بالهيستيدين، تتفاعل بقايا الهيستيدين في البروتين الاندماجي مع أيونات معدنية مثل النيكل أو الكوبالت، المرتبطة بمادة كروماتوغرافية. بعد غسل أي شوائب، يُفصل البروتين الاندماجي المرتبط باستخدام محلول منظم يحتوي على الإيميدازول وظروف فصل مناسبة أخرى.

تعتبر علاماته من بين العلامات الأكثر استخدامًا للتعبير عن البروتين البكتيري، وخاصة في بكتيريا الإشريكية القولونية.

إضافةً إلى التعبير الكافي عن البروتين، تُعدّ إمكانية الوصول إلى علامة الهيستيدين مهمةً للارتباط بالراتنج. فوجود علامة هيستيدين مدفونة لا يسمح لها بالارتباط بالراتنج، مما قد يؤدي إلى نتائج تنقية ضعيفة للغاية.

كما أن تركيبة المحلول المنظم يمكن أن تتداخل مع عملية تنقية تقارب المعادن، على سبيل المثال عن طريق عوامل التخليب أو عن طريق مكونات أخرى من المحلول المنظم.

علامة ضريبة السلع والخدمات: تحسين الذوبان والتنقية

GST هو علامة بروتينية يبلغ وزنها الجزيئي حوالي 26 كيلو دالتون تسمى ناقلة الجلوتاثيون S.

تُستخدم علامات GST بشكل شائع في أنظمة التعبير بدائية النواة. تصبح بعض البروتينات المؤتلفة أكثر قابلية للذوبان بعد وضع علامة GST عليها، ويمكن تنقيتها باستخدام كروماتوغرافيا التقارب مع الجلوتاثيون.

لاحظ أنه في حين أن علامة His الصغيرة عادةً ما تشكل شريك اندماج صغيرًا إلى حد ما، فإن شريك اندماج GST يشكل شريك اندماج كبير إلى حد ما والذي يمكن أن يكون مفيدًا جدًا إذا كان البروتين المستهدف غير مستقر أو حتى غير قابل للذوبان بمفرده.

تقدم شركة سولاربيو بروتين GST Tag المؤتلف (P02337) للأبحاث المتعلقة بالبروتين.

يمكن أيضًا إجراء دراسات تفاعل البروتينات باستخدام بروتينات اندماجية مع GST. تُستخدم هذه البروتينات في اختبارات سحب GST التقليدية، حيث يتم ربط البروتين الموسوم براتنج الغلوتاثيون. بعد ذلك، تُغسل جميع البروتينات المتفاعلة مع البروتين الموسوم من جميع البروتينات الأخرى المرتبطة براتنجات أخرى، ثم تُكشف باستخدام تقنية ويسترن بلوت.

من الناحية العملية، توجد قيود على استخدام GST. يمكن للبروتين أن يشكل ثنائيات، ويمكن أن يؤثر حجم العلامة على بنية البروتين المستهدف أو نشاطه.

يمكن تضمين موقع انقسام بروتياز مناسب في شريك الاندماج أثناء تصميم التركيب لإزالة علامة GST بعد التنقية إذا لزم الأمر والتداخل مع تجربتك.

استخدام علامات MBP و FLAG في أبحاث البروتينات المؤتلفة

علامة MBP: خيار مفيد للبروتينات قليلة الذوبان

بروتين ربط المالتوز، MBP. هذا بروتين يبلغ وزنه 40 كيلو دالتون ويستخدم كعلامة للبروتينات التي يتم التعبير عنها في البكتيريا كبروتين اندماجي.

يمكن لبروتين MBP أن يحسن الذوبانية الظاهرية لبعض البروتينات المؤتلفة التي يتم التعبير عنها.

قد يُمثل التعبير عن البروتينات حقيقية النواة في بكتيريا الإشريكية القولونية تحديًا بسبب الطي غير الصحيح للبروتين وتكوّن أجسام تضمينية غير قابلة للذوبان. ويمكن التغلب على ذلك باستخدام علامة 6xHis.

يمكن أيضًا تنقية البروتينات المدمجة MBP باستخدام كروماتوغرافيا تقارب الأميلوز.

يتوفر بروتين MBP Tag المؤتلف (P02841) من Solarbio تحت اسم Recombinant Tag Proteins.

مجرد أن يصبح البروتين أكثر قابلية للذوبان، لا يعني ذلك أنه مطوي بشكل صحيح أو أنه نشط.

اختبر نشاط البروتين المدمج الخاص بك كبروتين نقي ولا تعتمد فقط على كمية البروتين المتبقية في المحلول كبروتين مدمج.

علامة FLAG: حجم صغير واكتشاف مريح للأجسام المضادة

FLAG عبارة عن علامة ببتيدية قصيرة جدًا تتكون من 8 أحماض أمينية ولها التسلسل DYKDDDDK.

بالمقارنة مع GST و MBP، فإن FLAG عبارة عن علامة تضيف وزنًا جزيئيًا ضئيلًا جدًا إلى البروتين المؤتلف.

تتمثل الميزة الرئيسية لعلامة ربط الأجسام المضادة، مثل علامة FLAG، في سهولة تعرف الأجسام المضادة النوعية على المستضد المقابل. ويمكن الكشف عن البروتينات الموسومة بعلامة FLAG باستخدام أجسام مضادة مضادة لعلامة FLAG، وتنقيها باستخدام مصفوفات مناسبة ذات ألفة عالية لعلامة FLAG.

تتيح خصائص علامة FLAG استخدامها في لطخة ويسترن، والترسيب المناعي، وفي دراسة المركبات البروتينية.

بالإضافة إلى كونها بمثابة عنصر تعريف للأجسام المضادة لـ FLAG، فإن تسلسل FLAG يحتوي على عنصر تعريف لإنزيم إنتيروكيناز والذي يمكن استخدامه لفصل العلامة من بروتين الاندماج بشرط أن يتم الاندماج الصحيح وأن يتم استخدام ظروف الفصل المناسبة.

يمكن للباحثين الذين يبحثون عن منتج علامة معاد تركيبه أن يأخذوا في الاعتبار بروتين علامة FLAG المعاد تركيبه (P02839).

على الرغم من صغر حجم علامة FLAG، إلا أنه ينبغي وضعها مع مراعاة أقرب نطاق وظيفي. إذ يمكن أن تؤثر على تفاعلات البروتين مع الجزيئات الأخرى أو حتى على إمكانية وصول الأجسام المضادة للكشف.

يمكن أن يؤدي اختبار النسخ الطرفية N والطرفية C من كاشف الكشف إلى حل مشكلة الكشف دون الحاجة إلى صنع جسم مضاد.

علامات البروتين الفلورية لتحديد الموقع والكشف

متغيرات GFP وعلامات mCherry

يمكن استخدام علامات البروتين الفلورية لمراقبة موقع البروتينات المدمجة وتتبع حركتها بواسطة المجهر الفلوري.

تشمل الأمثلة الشائعة eGFP و eCFP و eYFP و mCherry.

تتميز جميع البروتينات الفلورية بأطوال موجية قصوى مختلفة للإثارة والانبعاث. لذا، يمكن اختيار قنوات تصوير مختلفة لكل بروتين. وفي بعض الأحيان، يُمكن رصد أكثر من بروتين واحد في التجربة الواحدة.

mCherry هو بروتين فلوري أحمر اللون يُستخدم غالبًا في صنع البروتينات الاندماجية لدراسة توطين البروتين. سولاربيو يقدم بروتين mCHERRY Tag المؤتلف (P02838) لأغراض البحث.

يمكن استخدام تقنية الوسم الفلوري لتحديد مواقع البروتينات داخل الخلايا ودراسة نقل البروتينات. كما يمكن استخدامها لتحديد كيفية تأثير التغيرات في التعبير الجيني أو البروتيني على توزيع البروتينات داخل الخلية.

مع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن التألق البسيط لا يثبت بالضرورة أن بروتيناً معيناً وظيفي. فالبروتينات المتألقة الأكبر حجماً، مثل هذه، قد تتداخل مع سلوك البروتين تبعاً لموقعها داخل البروتين.

يجب أيضًا مراعاة التعبير، ونضج التألق، والتألق الخلفي عند تحليل الصور.

مطابقة البروتينات المُعَدَّة ذات العلامات مع الأجسام المضادة للعلامات

لماذا تُعدّ الأجسام المضادة للعلامات مهمة؟

يمكن أن يكون استخدام الأجسام المضادة "الموسومة" مناسبًا جدًا أيضًا للكشف عن البروتينات الاندماجية بدلاً من الاضطرار إلى توليد جسم مضاد جديد لكل هدف على حدة.

يمكن دراسة البروتينات غير المرتبطة باستخدام عدة بروتينات مختلفة تحمل نفس علامة GST. ويمكن الكشف عنها باستخدام جسم مضاد مناسب لعلامة GST.

سولاربيو جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد لعلامة GST (K200006M) صُمم هذا المنتج للكشف عن علامات GST في التطبيقات التجريبية المتوافقة. ينبغي على الباحثين التأكد من ملاءمة الأجسام المضادة بناءً على الفحص المقصود وبيانات التحقق من صحة المنتج.

بالإضافة إلى الأجسام المضادة المذكورة أعلاه، نقدم أيضاً جسم مضاد متعدد النسائل مضاد لعلامة GST, جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد لعلامة MBP، الأجسام المضادة متعددة النسائل المضادة لعلامة MBP، و الأجسام المضادة متعددة النسائل المضادة لعلامة العلم.

يمكن أن تكون الأجسام المضادة أحادية النسيلة ومتعددة النسائل مفيدة للغاية في تطبيقات مختلفة، لكنها تتعرف على أجزاء مختلفة من المستضدات ولها خصائص مختلفة.

يجب أن يأخذ اختيار الجسم المضاد في الاعتبار النهج التجريبي، والظروف التي تم في ظلها تحضير العينة، وإمكانية الوصول إلى علامة الاندماج.

تؤثر خصوصية الأجسام المضادة، وسهولة الوصول إلى المستضدات، وطريقة إنتاج الأجسام المضادة على الكشف عن البروتينات الموسومة. كما توفر تقنيات الأجسام المضادة المؤتلفة خيارات لتطوير كواشف كشف ذات خصائص ارتباط محددة.

الكشف عن البروتينات الاندماجية الفلورية باستخدام الأجسام المضادة

يمكن أيضًا الكشف عن البروتينات الفلورية باستخدام الأجسام المضادة الخاصة بالعلامات.

يمكن أن يكون هذا مفيدًا جدًا في عدد من المواقف: عندما تكون إشارة التألق ضعيفة جدًا؛ عندما تتم معالجة العينات بالفعل من أجل لطخة ويسترن؛ أو ببساطة لتوفير وسيلة إضافية للتحقق من التعبير البروتيني.

للكشف عن البروتينات الموسومة بـ mCherry، جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد لعلامة mCherry (K200015M) يمكن استخدام منتجات Solarbio.

كما نوفر عددًا من المنتجات متعددة العلامات المؤتلفة، بما في ذلك بروتين Recombinant Tag-5 (P06425) وبروتين Recombinant Tag-9 (P06426).

هذه المنتجات عبارة عن مجموعات من تسلسلات العلامات الشائعة. ويمكن استخدامها في أي مشروع بحثي يتضمن التعرف على العلامات أو أنظمة الكشف ذات الصلة.

تأكد دائمًا من أن المنتج مناسب للأجسام المضادة والتطبيق الذي تستخدمه في تجاربك.

المشاكل الشائعة عند العمل مع البروتينات الموسومة

لا يعني التعبير العالي بالضرورة سهولة التنقية

أحد الأخطاء الشائعة هو اختيار وسم ينتج عنه عادةً تعبير عالٍ.

حتى عند التعبير عنه بمستويات عالية، يمكن للبروتين أن يشكل أجسامًا داخلية أو تجمعات أثناء عملية التنقية.

قد يكون استخدام بروتين اندماجي من نوع MBP أو GST مفيدًا إذا كانت مشكلة الذوبان هي المشكلة الرئيسية التي يجب معالجتها. مع ذلك، إذا كان البروتين لديك قابلًا للذوبان بالفعل وتحتاج فقط إلى تنقية بسيطة، فقد يكون استخدام علامة His أصغر حجمًا هو الخيار الأفضل.

تؤثر عوامل التعبير والحث وظروف المحلول المنظم والتنقية جميعها على النتائج.

توفر شركة Solarbio أيضًا للعملاء الذين لا يستطيعون إنشاء نظام تعبير مناسب في مختبراتهم خدمات بحثية متعلقة بتعبير البروتين بما في ذلك إنتاج البروتينات المؤتلفة وتنقيتها.

إشارات ضعيفة للأجسام المضادة بعد التعبير

إذا لم يتمكن الجسم المضاد من الكشف عن بروتين موسوم بعلامة محددة، فتحقق أولاً مما إذا كان الجسم المضاد معيباً!

قد لا يكون الوسم قابلاً للوصول، أو قد يكون البروتين المدمج قد تحلل، أو قد يكون التعبير أقل من المتوقع.

تحقق من الوزن الجزيئي المحسوب للبروتين المُعبر عنه وتحقق من وجود المنطقة الموسومة.

من المفيد أيضاً تضمين ضوابط إيجابية وسلبية مناسبة في فحوصات ويسترن بلوت. إذا لم يتعرف جسم مضاد يتعرف على بروتين موسوم معروف على العينة التجريبية، فقد تكمن المشكلة في البروتين المدمج أو في تحضير العينة.

استنتاج

تُستخدم علامات His و GST و MBP و FLAG وغيرها لحل أنواع مختلفة من المشاكل في أبحاث البروتين.

تُعدّ البروتينات الموسومة بالهيستيدين (His-tagged) الأنسب لتنقية البروتينات الروتينية باستخدام تقنية التقارب. في مشاريع التعبير المعقدة، يمكن غالبًا التعبير المشترك عن البروتينات الموسومة بـ GST وMBP مع البروتين المطلوب كبروتين اندماجي. أما البروتينات المعبر عنها بعلامة FLAG، فيمكن تنقيتها والكشف عنها باستخدام أجسام مضادة نوعية. وتُمكّن علامات التألق من تحديد موقع البروتينات في الخلايا الحية.

إن اختيار العلامة يعني أيضاً اختيار مادة التنقية المناسبة والأجسام المضادة للكشف.

تُقدّم شركة Solarbio بروتينات مُعاد تركيبها تحمل علامات مميزة، وأجسامًا مضادة مُخصصة لهذه العلامات، وخدمات إنتاج البروتينات لدعم أبحاث البروتينات المُعاد تركيبها. للحصول على المساعدة في اختيار المنتج أو الدعم الفني، يُمكن للباحثين تزويدنا بالبروتين المستهدف، ونظام التعبير، ومتطلبات التنقية، والتطبيق النهائي المُراد استخدامه.

أسئلة متكررة

س1: ما الفرق بين بطاقة His وبطاقة GST؟

أ1: علامة الهيستيدين هي ببتيد صغير يحتوي عادةً على ستة بقايا هيستيدين، بينما GST هو بروتين يبلغ وزنه الجزيئي حوالي 26 كيلو دالتون. تُستخدم علامات الهيستيدين بشكل شائع في تنقية البروتينات باستخدام تقنية فصل البروتينات بتقارب المعادن. تدعم علامات GST تنقية البروتينات باستخدام تقنية فصل البروتينات بتقارب الجلوتاثيون، وقد تُحسّن من ذوبان البروتين، على الرغم من أن حجمها الأكبر قد يؤثر على سلوك البروتين.

س2: ما هو أفضل وسم بروتيني لتحسين قابلية ذوبان البروتين المؤتلف؟

ج٢: تُستخدم علامات MBP وGST بشكل شائع للبروتينات غير الذائبة. وتُعدّ MBP مفيدة بشكل خاص للبروتينات حقيقية النواة المُعبَّر عنها في البكتيريا. مع ذلك، قد تختلف النتائج باختلاف البروتينات، وحتى باختلاف نسخ البروتين نفسه. لذا، يُفضَّل اختبار عدة تركيبات اندماجية مختلفة.

س3: هل يمكن الكشف عن البروتينات الموسومة بـ FLAG بواسطة تقنية Western blot؟

ج٣: نعم، يمكن الكشف عن البروتينات الموسومة بعلامة FLAG باستخدام الأجسام المضادة المناسبة لعلامة FLAG في تجارب التلطيخ الغربي أو الترسيب المناعي. يسمح تسلسل الببتيد القصير لعلامة FLAG بالتعرف النوعي بواسطة الأجسام المضادة. يتطلب الكشف عن البروتينات الموسومة بعلامة FLAG استخدام أجسام مضادة متوافقة، بالإضافة إلى تحضير مثالي للعينة.