Explication des étiquettes protéiques courantes : His, GST, MBP, FLAG et étiquettes fluorescentes

Les étiquettes sont utilisées à de nombreuses fins lors de l'expression des protéines recombinantes. Elles facilitent la purification, l'identification et l'étude des interactions protéiques. Si vous avez déjà travaillé avec des protéines recombinantes, vous avez certainement rencontré les étiquettes His, GST, MBP ou FLAG. Ces étiquettes sont mentionnées dans les vecteurs d'expression utilisés pour créer la protéine recombinante, dans les protocoles de purification et dans les anticorps utilisés pour sa détection.

Même lorsqu'une protéine présente une bande d'expression intense en électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE), sa purification peut s'avérer très difficile. La protéine peut former de gros agrégats insolubles ou, après avoir été purifiée avec succès à l'aide d'un anticorps, ne pas réagir comme prévu avec celui-ci.

Différents marqueurs protéiques sont utilisés à des fins diverses. La connaissance de leurs propriétés permet de planifier l'expérience souhaitée avant même de commander les réactifs nécessaires, ce qui contribue à minimiser plusieurs problèmes potentiels.

Que sont les étiquettes protéiques et pourquoi sont-elles utilisées ?

Comment fonctionnent les protéines marquées

Une étiquette protéique est un court peptide, voire une protéine plus grande, qui est fusionné à une protéine cible par la technologie de l'ADN recombinant.

La protéine de fusion résultante est composée de la cible d'intérêt et d'un marqueur. Les propriétés de ce marqueur permettent son utilisation pour la purification des protéines, l'amélioration de leur solubilité, leur détection par des anticorps lors de western blots et d'autres applications. Les protéines marquées peuvent également être suivies dans les cellules.

Une étiquette protéique peut être fixée à l'extrémité N-terminale ou C-terminale d'une protéine cible. Le site de fixation le plus approprié doit être sélectionné en fonction de la structure de la protéine et de l'objectif de l'expérience.

Les petites étiquettes ont un impact minime sur la taille globale de la protéine. En revanche, les étiquettes plus grandes peuvent affecter le repliement, la solubilité et les interactions de la protéine.

Choisir une étiquette protéique ne se résume pas à trouver un vecteur d'expression approprié.

Choisir les étiquettes en fonction des objectifs expérimentaux

Avant de pouvoir sélectionner une étiquette pour une expression, déterminez ce que vous devez faire avec cette expression.

Pour la purification par affinité de routine, une étiquette His est suffisante, tandis que pour résoudre les problèmes de solubilité, des étiquettes comme la GST et la MBP sont très utiles. Pour la détection par anticorps, l'étiquette FLAG est très souvent utilisée pour identifier les protéines d'intérêt. Les étiquettes fluorescentes sont très utiles pour étudier la localisation des protéines.

Les étiquettes peptidiques courtes et les partenaires de fusion plus volumineux ont des effets différents sur la solubilité, la purification et la fonction des protéines. Les petites étiquettes, comme His et FLAG, augmentent généralement la masse moléculaire de façon négligeable, tandis que les partenaires plus volumineux, tels que GST et MBP, peuvent améliorer l'expression soluble de certaines protéines. Le choix optimal dépend de l'objectif expérimental et des propriétés de la protéine cible.

Il n'existe pas d'étiquette protéique unique optimale pour toutes les protéines. Le choix de l'étiquette dépend généralement de plusieurs critères, notamment le système d'expression hôte, les étapes de purification ultérieures prévues et le degré d'importance du maintien de l'activité biologique naturelle de la protéine exprimée.

Étiquette His et étiquette GST pour la purification des protéines

Son étiquette : Une petite étiquette pour la chromatographie d'affinité

L'étiquette His est l'une des étiquettes protéiques les plus couramment utilisées dans la production de protéines recombinantes.

L'étiquette 6×His classique est une séquence de six résidus d'histidine, HHHHHH. Sa petite taille la rend particulièrement adaptée car elle n'alourdit pas significativement la protéine cible.

Les protéines marquées His sont généralement purifiées par chromatographie d'affinité sur métal immobilisé, également connue sous le nom d'IMAC.

Lors de la chromatographie d'affinité d'une protéine de fusion marquée à l'histidine, les résidus d'histidine de la protéine interagissent avec des ions métalliques tels que le nickel ou le cobalt, fixés sur une matrice chromatographique. Après élimination des impuretés par lavage, la protéine de fusion liée est éluée à l'aide d'un tampon contenant de l'imidazole et dans des conditions d'élution appropriées.

Ses étiquettes figurent parmi les étiquettes les plus couramment utilisées pour l'expression des protéines bactériennes, notamment chez E. coli.

Outre une expression protéique suffisante, l'accessibilité de l'étiquette His est essentielle à la fixation sur la résine. Une étiquette His enfouie ne peut se fixer à la résine, ce qui peut entraîner une purification très médiocre.

De plus, la composition du tampon peut interférer avec la purification par affinité métallique, par exemple par des agents chélateurs ou par d'autres composants du tampon.

Étiquette GST : Amélioration de la solubilité et de la purification

La GST est une étiquette protéique d'environ 26 kDa appelée glutathion S-transférase.

Les étiquettes GST sont fréquemment utilisées dans les systèmes d'expression procaryotes. Certaines protéines recombinantes deviennent plus solubles après marquage par GST et peuvent être purifiées par chromatographie d'affinité sur glutathion.

Notez que, tandis qu'une petite étiquette His formerait normalement un partenaire de fusion plutôt petit, le partenaire de fusion GST forme un partenaire de fusion plutôt grand, ce qui peut être très utile si la protéine cible est instable, voire insoluble par elle-même.

Solarbio propose Protéine recombinante à étiquette GST (P02337) pour les recherches liées aux protéines.

Des études d'interaction protéique peuvent également être réalisées à l'aide de protéines de fusion GST. Celles-ci peuvent être utilisées dans des tests d'affinité GST classiques, après quoi la protéine marquée est fixée sur une résine de glutathion. Les protéines interagissant avec la protéine marquée peuvent ensuite être éliminées par lavage des autres protéines fixées sur d'autres résines et détectées par Western blot.

En pratique, l'utilisation de la GST présente des limites. La protéine peut se dimériser et la taille de l'étiquette peut affecter la conformation ou l'activité de la protéine cible.

Un site de clivage de protéase approprié peut être inclus dans le partenaire de fusion lors de la conception de la construction afin de supprimer l'étiquette GST après purification si nécessaire et d'éviter toute interférence avec votre expérience.

Étiquettes MBP et FLAG dans la recherche sur les protéines recombinantes

Étiquette MBP : une option utile pour les protéines peu solubles

Protéine de liaison au maltose (MBP). Il s'agit d'une protéine de 40 kDa utilisée comme étiquette pour les protéines exprimées chez les bactéries sous forme de protéine de fusion.

La protéine MBP peut améliorer la solubilité apparente de certaines protéines recombinantes pour lesquelles elle est exprimée.

L'expression de protéines eucaryotes dans E. coli peut s'avérer complexe en raison d'un repliement incorrect et de la formation de corps d'inclusion insolubles. L'utilisation d'une étiquette 6xHis peut faciliter ce processus.

Les protéines de fusion MBP peuvent également être purifiées par chromatographie d'affinité sur amylose.

La protéine recombinante MBP Tag (P02841) est disponible chez Solarbio sous le nom de protéines recombinantes Tag.

Le fait qu'une protéine devienne plus soluble ne signifie pas qu'elle est correctement repliée ou qu'elle est active.

Testez l'activité de votre protéine de fusion en tant que protéine purifiée et ne vous fiez pas uniquement à la quantité de protéine qui reste en solution sous forme de protéine de fusion.

Étiquette FLAG : Petite taille et détection d’anticorps pratique

FLAG est une étiquette peptidique très courte composée de 8 acides aminés et ayant la séquence DYKDDDDK.

Comparativement à GST et MBP, FLAG est une étiquette qui ajoute très peu de poids moléculaire à une protéine recombinante.

Le principal avantage d'une étiquette de liaison aux anticorps telle que l'étiquette FLAG réside dans la reconnaissance aisée de l'antigène correspondant par des anticorps spécifiques. Les protéines marquées FLAG peuvent être détectées à l'aide d'anticorps anti-FLAG et purifiées grâce à des matrices d'affinité anti-FLAG appropriées.

Les propriétés de l'étiquette FLAG permettent son utilisation dans le Western blot, l'immunoprécipitation et l'étude des complexes protéiques.

En plus de servir de motif de reconnaissance pour les anticorps anti-FLAG, la séquence FLAG contient un motif de reconnaissance pour l'enzyme entérokinase qui peut être utilisé pour cliver l'étiquette d'une protéine de fusion à condition que la fusion correcte soit réalisée et que des conditions de clivage appropriées soient utilisées.

Les chercheurs à la recherche d'un produit d'étiquette recombinante correspondant peuvent considérer la protéine FLAG Tag recombinante (P02839).

Bien que petite, l'étiquette FLAG doit être placée en tenant compte du domaine fonctionnel le plus proche. Elle peut influencer les interactions de la protéine avec d'autres molécules, voire son accessibilité à l'anticorps de détection.

Tester les versions N-terminale et C-terminale du réactif de détection permet de résoudre un problème de détection sans avoir à fabriquer un anticorps.

Étiquettes de protéines fluorescentes pour la localisation et la détection

Variantes GFP et balises mCherry

Les étiquettes de protéines fluorescentes peuvent être utilisées pour observer la localisation et suivre le mouvement des protéines de fusion par microscopie de fluorescence.

Parmi les exemples courants, on peut citer eGFP, eCFP, eYFP et mCherry.

Chaque protéine fluorescente possède des maxima d'excitation et d'émission différents. Par conséquent, différents canaux d'imagerie peuvent être sélectionnés pour chaque protéine. Il est même parfois possible de suivre plusieurs protéines simultanément lors d'une même expérience.

La protéine mCherry est une protéine fluorescente rouge souvent utilisée pour la fabrication de protéines de fusion afin d'étudier la localisation des protéines. Solarbio propose la protéine recombinante mCHERRY Tag (P02838) pour la recherche.

Le marquage fluorescent permet de localiser les protéines à l'intérieur des cellules et d'étudier leur transport. Il permet également de déterminer comment les variations d'expression des gènes ou des protéines affectent leur distribution intracellulaire.

Il convient toutefois de noter que la fluorescence simple ne prouve pas nécessairement qu'une protéine donnée est fonctionnelle. De plus grandes protéines fluorescentes comme celles-ci peuvent interférer avec le comportement des protéines en fonction de leur position au sein de celles-ci.

L'expression, la maturité de la fluorescence et la fluorescence de fond doivent également être prises en compte lors de l'analyse des images.

Appariement des protéines recombinantes marquées avec les anticorps marqués

Pourquoi les anticorps marqués sont importants

L'utilisation d'anticorps « marqueurs » peut également s'avérer très pratique pour détecter les protéines de fusion, évitant ainsi de devoir générer un nouvel anticorps pour chaque cible.

Il est possible d'étudier des protéines non apparentées en utilisant plusieurs protéines différentes possédant la même étiquette GST. Leur détection peut être réalisée à l'aide d'un anticorps anti-GST approprié.

Solarbio Anticorps monoclonal anti-GST (K200006M) Ce dispositif est conçu pour la détection de la protéine GST-tag dans des applications expérimentales compatibles. Les chercheurs doivent confirmer la pertinence de l'anticorps en fonction du test prévu et des données de validation du produit.

En plus des anticorps mentionnés ci-dessus, nous proposons également Anticorps polyclonal anti-GST, Anticorps monoclonal anti-MBP Tag, anticorps polyclonal anti-MBP Tag, et Anticorps polyclonal anti-Flag.

Les anticorps monoclonaux et polyclonaux peuvent être très utiles dans différentes applications, mais ils reconnaissent des épitopes différents et possèdent des propriétés différentes.

Le choix d'un anticorps doit tenir compte de l'approche expérimentale, des conditions dans lesquelles l'échantillon a été préparé et de l'accessibilité de l'étiquette de fusion.

La spécificité des anticorps, l'accessibilité des épitopes et la méthode de production des anticorps peuvent influencer la détection des protéines marquées. Les technologies d'anticorps recombinants offrent également des possibilités pour le développement de réactifs de détection aux propriétés de liaison définies.

Détection de protéines de fusion fluorescentes à l'aide d'anticorps

Les protéines fluorescentes peuvent également être détectées grâce à des anticorps spécifiques à l'étiquette.

Cela peut s'avérer très utile dans de nombreuses situations : lorsque le signal de fluorescence est très faible ; lorsque les échantillons ont déjà été traités pour un Western blot ; ou simplement pour fournir un moyen supplémentaire de vérifier l'expression des protéines.

Pour la détection des protéines marquées mCherry, Anticorps monoclonal anti-mCherry Tag (K200015M) Les produits Solarbio peuvent être utilisés.

Nous fournissons également un certain nombre de produits recombinants multi-tags, notamment la protéine recombinante Tag-5 (P06425) et la protéine recombinante Tag-9 (P06426).

Ces produits sont des combinaisons de séquences d'étiquettes courantes. Ils peuvent être utiles dans tout projet de recherche impliquant la reconnaissance d'étiquettes ou des systèmes de détection connexes.

Vérifiez toujours qu'un produit convient à l'anticorps et à l'application que vous utilisez dans vos expériences.

Problèmes courants liés à l'utilisation de protéines marquées

Une expression élevée ne signifie pas toujours une purification facile.

Une erreur fréquente consiste à choisir une étiquette qui génère généralement une forte expression.

Même exprimée à des niveaux élevés, une protéine peut former des corps d'inclusion ou des agrégats lors de sa purification.

Une protéine de fusion MBP ou GST peut s'avérer utile si la solubilité est le principal problème à résoudre. Cependant, si votre protéine est déjà soluble et qu'une simple purification suffit, une étiquette His plus courte sera probablement un meilleur choix.

L'expression, l'induction, les conditions du tampon et la purification influencent toutes les résultats.

Pour les clients qui ne parviennent pas à mettre en place un système d'expression adapté dans leur laboratoire, Solarbio propose également services de recherche liés à l'expression des protéines y compris la production et la purification de protéines recombinantes.

Faibles signaux d'anticorps après expression

Une protéine marquée par un épitope est indétectable par un anticorps ? Vérifiez d’abord si l’anticorps est défectueux !

Il se peut que l'étiquette soit inaccessible, que la protéine de fusion se soit dégradée ou que l'expression soit plus faible que prévu.

Vérifiez le poids moléculaire calculé de la protéine exprimée et assurez-vous de la présence de la région marquée.

Il est également utile d'inclure des contrôles positifs et négatifs appropriés lors des western blots. Si un anticorps reconnaissant une protéine marquée connue ne reconnaît pas l'échantillon expérimental, le problème peut provenir de la protéine de fusion ou de la préparation de l'échantillon.

Conclusion

Les étiquettes His, GST, MBP, FLAG et autres servent à résoudre différents types de problèmes dans la recherche sur les protéines.

Pour la purification par affinité de routine, les protéines marquées His sont les plus pratiques. Dans les projets d'expression complexes, les protéines marquées GST et MBP peuvent souvent être co-exprimées avec la protéine d'intérêt sous forme de fusion. Les protéines exprimées avec une étiquette FLAG peuvent être purifiées et détectées à l'aide d'anticorps spécifiques. Les étiquettes fluorescentes permettent la localisation des protéines dans les cellules vivantes.

Choisir l'étiquette, c'est aussi choisir le matériel de purification et les anticorps de détection appropriés.

Solarbio fournit des protéines recombinantes marquées, des anticorps spécifiques de ces marqueurs et des services d'expression protéique pour accompagner la recherche sur les protéines recombinantes. Pour le choix des produits ou l'assistance technique, les chercheurs peuvent préciser la protéine cible, le système d'expression, les exigences de purification et l'application en aval prévue.

FAQ (questions fréquentes)

Q1 : Quelle est la différence entre l'étiquette His et l'étiquette GST ?

A1 : L’étiquette His est un petit peptide contenant généralement six résidus d’histidine, tandis que la GST est une protéine d’environ 26 kDa. Les étiquettes His sont couramment utilisées pour la purification par affinité métallique. Les étiquettes GST permettent la purification par affinité au glutathion et peuvent améliorer la solubilité des protéines, bien que leur taille plus importante puisse affecter leur comportement.

Q2 : Quel marqueur protéique est le plus adapté pour améliorer la solubilité des protéines recombinantes ?

A2 : Les étiquettes MBP et GST sont couramment utilisées pour les protéines insolubles. L’étiquette MBP est particulièrement utile pour les protéines eucaryotes exprimées chez les bactéries. Cependant, les résultats peuvent varier selon les protéines et même selon les différentes versions d’une même protéine. Il est donc préférable de tester plusieurs constructions de fusion différentes.

Q3 : Les protéines marquées FLAG peuvent-elles être détectées par Western blot ?

A3 : Oui, les protéines marquées FLAG peuvent être détectées par Western blot ou immunoprécipitation à l’aide d’anticorps anti-FLAG appropriés. La courte séquence peptidique de l’étiquette FLAG permet une reconnaissance spécifique par les anticorps. La détection de ces protéines nécessite des anticorps compatibles et une préparation optimale des échantillons.