一般的なタンパク質タグの説明：Hisタグ、GSTタグ、MBPタグ、FLAGタグ、蛍光タグ

タグは、組換えタンパク質の発現において様々な目的で使用されます。精製、同定、タンパク質間相互作用の研究に役立ちます。組換えタンパク質を扱った経験のある方なら、Hisタグ、GSTタグ、MBPタグ、FLAGタグを目にしたことがあるでしょう。これらは、組換えタンパク質の作製に使用される発現ベクター、精製に使用されるプロトコル、および検出に使用される抗体に記載されています。

タンパク質がSDS-PAGEで強い発現バンドを示したとしても、精製は非常に困難な場合がある。タンパク質が大きな不溶性凝集体を形成したり、抗体を用いて精製に成功したとしても、期待どおりにその抗体と反応しないことがある。

タンパク質タグは、それぞれ異なる目的で使用される。タグの特性を理解することで、必要な試薬を発注する前に、目的の実験を計画することができる。これにより、潜在的な問題を最小限に抑えることができる。

プロテインタグとは何か、そしてなぜ使用されるのか？

タグ付きタンパク質の仕組み

プロテインタグとは、組換えDNA技術によって標的タンパク質に融合された、短いペプチド、あるいはそれよりも大きなタンパク質のことである。

得られた融合タンパク質は、目的の標的タンパク質とタグから構成される。タグの特性により、タンパク質の精製、タンパク質の溶解性の向上、ウェスタンブロット法における抗体を用いた検出、その他の用途などに利用できる。タグ付きタンパク質は細胞内での追跡も可能である。

タンパク質タグは、標的タンパク質のN末端またはC末端に付加することができる。タンパク質の構造と実験の目的に応じて、最適な付加部位を選択する必要がある。

小さなタグはタンパク質の全体サイズにほとんど影響を与えない。一方、大きなタグはタンパク質の折り畳み、溶解性、および相互作用に影響を与える可能性がある。

タンパク質タグの選択は、単に適切な発現ベクターを見つけるだけにとどまらない。

実験目標に基づいたタグの選択

式にタグを選択する前に、その式で何を行う必要があるかを明確にしてください。

通常の親和性精製ではHisタグで十分ですが、溶解性の問題にはGSTやMBPなどのタグが非常に有効です。抗体を用いた検出では、FLAGタグが目的タンパク質の検出によく用いられます。蛍光タグはタンパク質の局在研究に非常に役立ちます。

短いペプチドタグとより大きな融合パートナーは、タンパク質の溶解性、精製、および機能に及ぼす影響が異なります。HisタグやFLAGタグなどの小さなタグは一般的に分子量の増加が少ない一方、GSTタグやMBPタグなどの大きなパートナーは特定のタンパク質の可溶性発現を向上させる可能性があります。最適な選択は、実験の目的と標的タンパク質の特性によって異なります。

すべてのタンパク質に最適な単一のタンパク質タグは存在しません。タグの選択は通常、発現宿主システム、計画されている下流の精製ステップ、発現タンパク質が本来の生物活性を保持する必要性の程度など、いくつかの基準に依存します。

タンパク質精製のためのHisタグとGSTタグ

彼のタグ：アフィニティークロマトグラフィー用の小型タグ

Hisタグは、組換えタンパク質生産において最も一般的に使用されるタンパク質タグの一つである。

典型的な6×Hisタグは、6つのヒスチジン残基（HHHHHH）からなる配列です。6×Hisタグはサイズが小さいため、目的のタンパク質に過度の重量増加を与えないという利点があります。

Hisタグ付きタンパク質は、一般的に固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（IMACとも呼ばれる）を用いて精製される。

ヒスチジンタグ付き融合タンパク質の親和性クロマトグラフィーでは、融合タンパク質のヒスチジン残基が、クロマトグラフィーマトリックスに結合したニッケルやコバルトなどの金属イオンと相互作用する。不純物を洗い流した後、結合した融合タンパク質は、イミダゾールを含む緩衝液とその他の適切な溶出条件を用いて溶出される。

彼が開発したタグは、細菌タンパク質の発現、特に大腸菌における発現において、最も一般的に使用されているタグの一つである。

十分なタンパク質発現に加えて、Hisタグが樹脂に結合するためには、Hisタグが樹脂に容易にアクセスできることが重要です。Hisタグが樹脂内部に埋もれていると、樹脂に結合できず、精製結果が非常に悪くなる可能性があります。

また、緩衝液の組成によっては、キレート剤やその他の緩衝液成分などによって、金属親和性精製が阻害される可能性がある。

GSTタグ：溶解性と精製性の向上

GSTは、グルタチオンS-トランスフェラーゼと呼ばれる、約26kDaのタンパク質タグである。

GSTタグは、原核生物発現系でよく用いられる。一部の組換えタンパク質は、GSTタグを付けることで溶解性が向上し、グルタチオンを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。

小さなHisタグは通常、比較的小さな融合パートナーを形成するのに対し、GST融合パートナーはかなり大きな融合パートナーを形成することに注意してください。これは、標的タンパク質が単独では不安定であったり、不溶性であったりする場合に非常に有用です。

Solarbioは 組換え型GSTタグタンパク質（P02337） タンパク質関連の研究向け。

タンパク質間相互作用の研究は、GST融合タンパク質を用いて行うこともできます。これらの融合タンパク質は、従来のGSTプルダウンアッセイに用いることができ、その後、タグ付きタンパク質をグルタチオン樹脂に結合させます。続いて、タグ付きタンパク質と相互作用するすべてのタンパク質を、他の樹脂に結合した他のすべてのタンパク質から洗い流し、ウェスタンブロット法を用いて検出します。

実際には、GSTの使用にはいくつかの制限がある。タンパク質が二量体化する可能性があり、タグのサイズが標的タンパク質の立体構造や活性に影響を与える可能性がある。

必要に応じて、また実験に干渉しないように、構築物の設計時に適切なプロテアーゼ切断部位を融合パートナーに含めることで、精製後にGSTタグを除去できます。

組換えタンパク質研究におけるMBPタグとFLAGタグ

MBPタグ：難溶性タンパク質にとって有用な選択肢

マルトース結合タンパク質（MBP）。これは40kDaのタンパク質で、細菌内で融合タンパク質として発現されるタンパク質のタグとして使用されます。

MBPは、それが発現される一部の組換えタンパク質の見かけ上の溶解度を向上させることができる。

真核生物タンパク質を大腸菌で発現させるのは、タンパク質の折り畳みが不完全であったり、不溶性の封入体を形成したりするため、困難な場合があります。6xHisタグを使用することで、この問題を解決できます。

MBP融合タンパク質は、アミロースアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することもできる。

組換えMBPタグタンパク質（P02841）は、Solarbio社から組換えタグタンパク質として入手可能です。

タンパク質の溶解性が高くなったからといって、それが正しく折り畳まれているとか、活性を持っているとは限らない。

融合タンパク質の活性は、精製タンパク質としてテストし、溶液中に残っている融合タンパク質の量だけに頼らないようにしてください。

FLAGタグ：小型で便利な抗体検出

FLAGは8個のアミノ酸からなる非常に短いペプチドタグで、配列はDYKDDDDKです。

GSTやMBPと比較すると、FLAGは組換えタンパク質にほとんど分子量を付加しないタグである。

FLAGタグなどの抗体結合タグの主な利点は、対応する抗原を特異抗体で容易に認識できることである。FLAGタグ付きタンパク質は、抗FLAG抗体を用いて検出することができ、適切な抗FLAGアフィニティーマトリックスを用いて精製することができる。

FLAGタグの特性により、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、およびタンパク質複合体の研究に利用できる。

FLAG配列は、抗FLAG抗体の認識モチーフとして機能するだけでなく、酵素エンテロキナーゼの認識モチーフも含んでおり、適切な融合が行われ、適切な切断条件が用いられれば、融合タンパク質からタグを切断するために利用できる。

対応する組換えタグ製品を探している研究者は、組換えFLAGタグタンパク質（P02839）を検討することができます。

FLAGタグは小さいながらも、最も近い機能ドメインを考慮して配置する必要がある。FLAGタグは、タンパク質と他の分子との相互作用、さらには検出抗体のアクセス性にも影響を与える可能性がある。

検出試薬のN末端バージョンとC末端バージョンをテストすることで、抗体を作製することなく検出の問題を解決できる。

局在化および検出のための蛍光タンパク質タグ

GFP変異体とmCherryタグ

蛍光タンパク質タグを用いることで、蛍光顕微鏡を用いて融合タンパク質の位置を観察したり、その動きを追跡したりすることができる。

一般的な例としては、eGFP、eCFP、eYFP、mCherryなどが挙げられる。

蛍光タンパク質はそれぞれ異なる励起・発光極大値を持つため、タンパク質ごとに異なるイメージングチャネルを選択できる。場合によっては、1回の実験で複数のタンパク質を同時にモニタリングすることも可能だ。

mCherryは、タンパク質の局在を研究するための融合タンパク質の作製によく用いられる赤色蛍光タンパク質である。 ソレボ 研究用組換えmCHERRYタグタンパク質（P02838）を提供しています。

蛍光標識は、細胞内のタンパク質の位置を特定したり、タンパク質輸送を研究したりするために使用できる。また、遺伝子やタンパク質の発現の変化が細胞内のタンパク質の分布にどのように影響するかを調べるためにも使用できる。

ただし、単純な蛍光だけでは、特定のタンパク質が機能的であることを必ずしも証明するものではないことに注意が必要です。このような大型の蛍光タンパク質は、タンパク質内の位置によっては、タンパク質の挙動に影響を与える可能性があります。

画像解析を行う際には、発現量、蛍光成熟度、および背景蛍光も考慮に入れる必要がある。

組換えタグタンパク質とタグ抗体のマッチング

タグ抗体が重要な理由

「タグ」抗体を使用することで、個々の標的ごとに新しい抗体を作成する必要がなくなり、融合タンパク質の検出に非常に便利になる場合もある。

同じGSTタグを持つ複数の異なるタンパク質を用いることで、無関係なタンパク質を研究することができる。これらのタンパク質は、適切な抗GST抗体を用いて検出できる。

ソレボ 抗GSTタグモノクローナル抗体（K200006M） 本抗体は、互換性のある実験用途におけるGSTタグ検出用に設計されています。研究者は、目的とするアッセイおよび製品の検証データに基づいて、抗体の適合性を確認する必要があります。

上記に挙げた抗体に加えて、 抗GSTタグポリクローナル抗体, 抗MBPタグモノクローナル抗体抗MBPタグポリクローナル抗体、および 抗Flagタグポリクローナル抗体.

モノクローナル抗体とポリクローナル抗体は様々な用途で非常に有用であるが、認識するエピトープが異なり、特性も異なる。

抗体の選択にあたっては、実験手法、試料調製時の条件、および融合タグの入手しやすさを考慮する必要がある。

抗体の特異性、エピトープへのアクセス性、および抗体産生方法は、標識タンパク質の検出に影響を与える可能性がある。組換え抗体技術は、明確な結合特性を持つ検出試薬を開発するための選択肢も提供する。

抗体を用いた蛍光融合タンパク質の検出

蛍光タンパク質は、タグ特異的抗体を用いて検出することもできる。

これは、蛍光シグナルが非常に弱い場合、サンプルがすでにウェスタンブロッティング用に処理されている場合、または単にタンパク質発現を確認するための追加手段を提供する場合など、さまざまな状況で非常に役立ちます。

mCherryタグ付きタンパク質の検出には、 抗mCherryタグモノクローナル抗体（K200015M） Solarbio社の製品も使用できます。

当社は、組換え型マルチタグ製品も多数取り扱っており、組換え型Tag-5タンパク質（P06425）および組換え型Tag-9タンパク質（P06426）などが含まれます。

これらの製品は、一般的なタグ配列を組み合わせたものです。タグ認識や関連する検出システムに関わるあらゆる研究プロジェクトで活用できます。

実験で使用する抗体および用途に製品が適していることを必ず確認してください。

タグ付きタンパク質を扱う際によくある問題点

高発現は必ずしも容易な精製を意味するものではない

よくある間違いの一つは、通常高い発現を示すタグを選んでしまうことです。

タンパク質は高レベルで発現させた場合でも、精製過程で封入体や凝集体を形成することがある。

溶解性が主な課題である場合は、MBPまたはGST融合タンパク質が有用となる可能性があります。しかし、タンパク質が既に溶解性があり、簡単な精製のみが必要な場合は、より小さなHisタグを使用する方が良いでしょう。

発現、誘導、緩衝液条件、精製といった要素はすべて結果に影響を与える。

自社ラボで適切な発現系を確立できない顧客向けに、Solarbioは タンパク質発現関連の研究サービス 組換えタンパク質の生産および精製を含む。

発現後の弱い抗体シグナル

エピトープで標識されたタンパク質が抗体で検出できない場合、まず抗体に欠陥がないか確認してください。

タグにアクセスできない、融合タンパク質が分解した、あるいは予想よりも発現量が低いなどの可能性があります。

発現したタンパク質の計算された分子量を確認し、タグ領域が存在するかどうかをチェックする。

ウェスタンブロットでは、適切な陽性対照と陰性対照を含めることも有効です。既知のタグ付きタンパク質を認識する抗体が実験サンプルを認識しない場合、問題は融合タンパク質またはサンプル調製にある可能性があります。

結論

His、GST、MBP、FLAGなどのタグは、タンパク質研究における様々な問題を解決するために用いられる。

日常的なアフィニティー精製には、Hisタグ付きタンパク質が最も便利です。発現が困難なプロジェクトでは、GSTタグ付きタンパク質やMBPタグ付きタンパク質を目的タンパク質と融合タンパク質として共発現させることがよくあります。FLAGタグ付きタンパク質は、特異抗体を用いて精製および検出できます。蛍光タグは、生細胞内でのタンパク質の局在化を可能にします。

タグを選択するということは、適切な精製材料と検出抗体を選択することも意味する。

Solarbioは、組換えタンパク質研究を支援するため、組換えタグタンパク質、タグ特異的抗体、およびタンパク質発現サービスを提供しています。製品の選定や技術支援をご希望の場合は、対象タンパク質、発現系、精製要件、および想定される下流アプリケーションをお知らせください。

FAQ

Q1：HisタグとGSTタグの違いは何ですか？

A1：Hisタグは通常6つのヒスチジン残基を含む小さなペプチドであり、GSTは約26kDaのタンパク質です。Hisタグは一般的に金属アフィニティー精製に用いられます。GSTタグはグルタチオンアフィニティー精製をサポートし、タンパク質の溶解性を向上させる可能性がありますが、その大きさがタンパク質の挙動に影響を与える場合もあります。

Q2：組換えタンパク質の溶解性を向上させるのに最適なタンパク質タグはどれですか？

A2：MBPとGSTは、不溶性タンパク質によく用いられるタグです。MBPは、細菌で発現させた真核生物タンパク質に特に有効です。ただし、タンパク質の種類や、同じタンパク質の異なるバージョンによって結果が異なる場合があります。複数の異なる融合コンストラクトをテストすることをお勧めします。

Q3：FLAGタグ付きタンパク質はウェスタンブロットで検出できますか？

A3：はい、FLAGタグ付きタンパク質は、ウェスタンブロッティングまたは免疫沈降実験において、適切な抗FLAG抗体を用いることで検出できます。FLAGタグの短いペプチド配列は、抗体による特異的な認識を可能にします。FLAGタグ付きタンパク質の検出には、適合する抗体と最適なサンプル調製が必要です。