Распространенные белковые метки: His, GST, MBP, FLAG и флуоресцентные метки.

Метки используются для многих целей при экспрессии рекомбинантных белков. Они помогают в очистке, идентификации и изучении белковых взаимодействий. Если вы работали с рекомбинантными белками, то наверняка сталкивались с His-меткой, GST-меткой, MBP-меткой или FLAG-меткой. Они упоминаются в экспрессионных векторах, используемых для создания рекомбинантного белка, в протоколах его очистки и в антителах, используемых для его обнаружения.

Даже если белок дает четкую полосу экспрессии на SDS-PAGE, его очень трудно очистить. Белок может образовывать большие нерастворимые агрегаты или, после успешной очистки с помощью антитела, может не реагировать с этим антителом должным образом.

Для разных целей используются разные белковые метки. Зная свойства меток, можно спланировать интересующий эксперимент еще до заказа необходимых реагентов. Это помогает свести к минимуму ряд потенциальных проблем.

Что такое белковые метки и зачем они используются?

Как работают меченые белки

Белковая метка — это короткий пептид или даже более крупный белок, который соединяется с целевым белком с помощью технологии рекомбинантной ДНК.

Полученный гибридный белок состоит из целевого белка и метки. Свойства метки позволяют использовать ее для очистки белков, повышения растворимости белков, обнаружения с помощью антител в вестерн-блоттинге и других областях применения. Меченые белки также можно отслеживать в клетках.

Белковый тег может быть присоединен к N-концу или к C-концу целевого белка. В зависимости от структуры белка и цели эксперимента необходимо выбрать более подходящее место присоединения.

Небольшие метки оказывают минимальное влияние на общий размер белка. Напротив, более крупные метки могут влиять на сворачивание белка, его растворимость и взаимодействия.

Выбор белковой метки — это не просто поиск подходящего вектора экспрессии для неё.

Выбор тегов на основе целей эксперимента.

Прежде чем выбрать тег для выражения, определите, что именно вам нужно с ним сделать.

Для стандартной аффинной очистки достаточно His-метки, тогда как для решения проблем с растворимостью очень полезны GST и MBP. Для обнаружения белков с помощью антител часто используется FLAG-метка. Флуоресцентные метки очень полезны для исследований локализации белков.

Короткие пептидные метки и более крупные слитые белки различаются по своему влиянию на растворимость, очистку и функцию белка. Небольшие метки, такие как His и FLAG, обычно увеличивают молекулярную массу, в то время как более крупные партнеры, такие как GST и MBP, могут улучшить растворимую экспрессию определенных белков. Оптимальный выбор зависит от экспериментальной цели и свойств целевого белка.

Не существует единого белкового тега, оптимального для всех белков. Выбор тега обычно зависит от нескольких критериев, включая систему экспрессии, запланированные этапы последующей очистки и степень важности сохранения экспрессируемым белком своей естественной биологической активности.

Его метка и метка GST для очистки белка

His Tag: Маленькая метка для аффинной хроматографии

His-метка — одна из наиболее часто используемых меток для белков в производстве рекомбинантных белков.

Типичная 6×His-метка представляет собой последовательность из 6 остатков гистидина, HHHHHH. Небольшой размер 6×His-метки делает её подходящей, поскольку она не добавляет слишком большой массы целевому белку.

Белки с His-меткой обычно очищают с помощью хроматографии с иммобилизованной металлоаффинной мембраной, также известной как IMAC.

При аффинной хроматографии гистидин-меченого гибридного белка остатки гистидина в гибридном белке взаимодействуют с ионами металлов, такими как никель или кобальт, которые прикреплены к хроматографической матрице. После удаления любых примесей связанный гибридный белок элюируют с помощью буфера, содержащего имидазол, и других подходящих условий элюирования.

Его метки входят в число наиболее часто используемых меток для экспрессии бактериальных белков, особенно в кишечной палочке (E. coli).

Помимо достаточной экспрессии белка, доступность His-метки важна для связывания с смолой. Скрытая His-метка не способна связываться со смолой, что может привести к очень плохим результатам очистки.

Кроме того, состав буфера может препятствовать аффинной очистке металлов, например, из-за хелатирующих агентов или других компонентов буфера.

Метка GST: Улучшение растворимости и очистки

GST — это белковая метка массой приблизительно 26 кДа, называемая глутатион-S-трансферазой.

Метки GST часто используются в прокариотических экспрессионных системах. Некоторые рекомбинантные белки становятся более растворимыми после мечения GST и могут быть очищены с помощью аффинной хроматографии с использованием глутатиона.

Следует отметить, что, хотя небольшой His-тег обычно образует довольно небольшого партнера для слияния, партнер для слияния с GST образует довольно большого партнера для слияния, что может быть очень полезно, если целевой белок нестабилен или даже нерастворим сам по себе.

Solarbio предлагает Рекомбинантный белок с GST-тегом (P02337) для исследований, связанных с белками.

Исследования взаимодействия белков также можно проводить с использованием GST-слитых белков. Их можно использовать в обычных GST-пулл-даун-анализах, после чего меченый белок прикрепляется к глутатионовой смоле. Затем все белки, взаимодействующие с меченым белком, можно смыть со всех других белков, прикрепленных к другим смолам, и обнаружить с помощью вестерн-блоттинга.

На практике использование GST имеет ограничения. Белок может димеризоваться, а размер метки может влиять на конформацию или активность целевого белка.

В процессе разработки конструкции в состав гибридного белка можно включить подходящий сайт расщепления протеазой, чтобы при необходимости удалить GST-метку после очистки, что может помешать проведению эксперимента.

Использование меток MBP и FLAG в исследованиях рекомбинантных белков

MBP Tag: полезная опция для плохо растворимых белков.

Мальтозосвязывающий белок, MBP. Это белок массой 40 кДа, используемый в качестве метки для белков, экспрессируемых в бактериях в виде гибридного белка.

MBP может улучшить кажущуюся растворимость некоторых рекомбинантных белков, для которых он экспрессируется.

Экспрессия эукариотических белков в E. coli может представлять собой сложную задачу из-за неправильного сворачивания и образования нерастворимых включений. Этому можно помочь, используя 6xHis-метку.

Белки слияния MBP также можно очистить с помощью аффинной хроматографии на амилозе.

Рекомбинантный белок MBP Tag (P02841) доступен от компании Solarbio в виде рекомбинантных белков Tag.

Тот факт, что ваш белок стал более растворимым, не означает, что он правильно свернулся или стал активным.

Проверяйте активность вашего гибридного белка в очищенном виде и не полагайтесь исключительно на количество белка, остающегося в растворе в виде гибридного белка.

FLAG Tag: Компактный размер и удобное обнаружение антител

FLAG — это очень короткий пептидный тег, состоящий из 8 аминокислот и имеющий последовательность DYKDDDDK.

В отличие от GST и MBP, FLAG — это метка, которая добавляет очень небольшую молекулярную массу к рекомбинантному белку.

Главное преимущество связывающей метки антител, такой как FLAG-метка, заключается в удобном распознавании соответствующего антигена специфическими антителами. Белки с FLAG-меткой могут быть обнаружены с помощью антител к FLAG-метке и очищены с использованием подходящих аффинных матриц к FLAG-метке.

Свойства FLAG-метки позволяют использовать ее в вестерн-блоттинге, иммунопреципитации и при изучении белковых комплексов.

Помимо того, что последовательность FLAG служит мотивом распознавания для антител к FLAG, она также содержит мотив распознавания для фермента энтерокиназы, который может быть использован для отщепления метки от гибридного белка при условии, что гибридный белок будет сформирован правильно и будут использованы соответствующие условия расщепления.

Исследователи, ищущие соответствующий рекомбинантный продукт с меткой FLAG, могут рассмотреть рекомбинантный белок с меткой FLAG (P02839).

Несмотря на свои небольшие размеры, метку FLAG следует размещать с учетом ближайшего функционального домена. Она может влиять на взаимодействие белка с другими молекулами или даже на доступность для детектирующего антитела.

Тестирование N-концевых и C-концевых версий реагента для обнаружения может решить проблему обнаружения без необходимости создания антитела.

Флуоресцентные белковые метки для локализации и обнаружения

Варианты GFP и метки mCherry

Флуоресцентные белковые метки можно использовать для наблюдения за местоположением и отслеживания движения гибридных белков с помощью флуоресцентной микроскопии.

К распространённым примерам относятся eGFP, eCFP, eYFP и mCherry.

Все флуоресцентные белки имеют разные максимумы возбуждения и излучения. Таким образом, для разных белков можно выбирать разные каналы визуализации. В некоторых случаях даже возможно отслеживать более одного белка в одном эксперименте.

mCherry — это красный флуоресцентный белок, часто используемый для создания гибридных белков с целью изучения локализации белков. Соларбио Предлагает рекомбинантный белок mCHERRY Tag (P02838) для исследований.

Флуоресцентная маркировка может использоваться для определения местоположения белков внутри клеток и изучения транспорта белков. Она также может применяться для определения того, как изменения в экспрессии генов или белков влияют на распределение белков внутри клетки.

Однако следует отметить, что простая флуоресценция не обязательно доказывает функциональность данного белка. Более крупные флуоресцентные белки, подобные этим, могут влиять на поведение белка в зависимости от их положения внутри данного белка.

При анализе изображений также необходимо учитывать экспрессию, степень зрелости флуоресценции и фоновую флуоресценцию.

Сопоставление рекомбинантных белков-меток с антителами к меткам

Почему важны антитела-метки

Использование «меченых» антител также может быть очень удобным для обнаружения гибридных белков, поскольку не требуется создавать новое антитело для каждой отдельной мишени.

Неродственные белки можно изучать, используя несколько разных белков с одинаковым GST-тегом. Их можно обнаружить с помощью подходящих антител к GST.

Соларбио Моноклональное антитело против метки GST (K200006M) Предназначен для обнаружения GST-тегов в совместимых экспериментальных приложениях. Исследователям следует подтвердить пригодность антитела на основе предполагаемого анализа и данных валидации продукта.

Помимо перечисленных выше антител, мы также предлагаем Поликлональные антитела против метки GST, Моноклональное антитело против метки MBP, поликлональные антитела против метки MBP, и Поликлональные антитела против флаг-метки.

Моноклональные и поликлональные антитела могут быть очень полезны в различных областях применения, но они распознают разные эпитопы и обладают разными свойствами.

При выборе антитела необходимо учитывать экспериментальный подход, условия подготовки образца и доступность метки слияния.

Специфичность антител, доступность эпитопов и метод получения антител могут влиять на обнаружение меченых белков. Технологии рекомбинантных антител также предоставляют возможности для разработки реагентов для обнаружения с заданными связывающими свойствами.

Обнаружение флуоресцентных белков слияния с помощью антител

Флуоресцентные белки также можно обнаружить с помощью антител, специфичных к меткам.

Это может быть очень полезно в ряде ситуаций: когда флуоресцентный сигнал очень слабый; когда образцы уже были обработаны для вестерн-блоттинга; или просто для предоставления дополнительного способа проверки экспрессии белка.

Для обнаружения белков, помеченных mCherry, используется следующий метод: Моноклональное антитело против mCherry Tag (K200015M) Можно использовать продукцию Solarbio.

Мы также поставляем ряд рекомбинантных мульти-теговых продуктов, включая рекомбинантный белок Tag-5 (P06425) и рекомбинантный белок Tag-9 (P06426).

Эти продукты представляют собой комбинации распространенных последовательностей меток. Они могут быть полезны в любом исследовательском проекте, связанном с распознаванием меток или аналогичными системами обнаружения.

Всегда проверяйте, подходит ли продукт для антитела и области применения, которые вы используете в своих экспериментах.

Распространенные проблемы при работе с мечеными белками

Высокая экспрессия не всегда означает лёгкую очистку.

Одна из распространенных ошибок — выбор тега, который обычно вызывает высокую экспрессию.

Даже при высокой экспрессии белок может образовывать включения или агрегаты в процессе очистки.

Если основной проблемой является растворимость, может быть полезен гибридный белок на основе MBP или GST. Однако, если ваш белок уже растворим и вам требуется лишь простая очистка, то более компактный His-тег может быть лучшим выбором.

На результаты влияют такие факторы, как экспрессия гена, индукция, буферные условия и очистка.

Для клиентов, которые не могут создать подходящую систему экспрессии в своей лаборатории, Solarbio также предлагает исследовательские услуги, связанные с экспрессией белков включая производство и очистку рекомбинантных белков.

Слабые сигналы антител после экспрессии

Белок, помеченный эпитопом, не обнаруживается антителом? Тогда сначала проверьте, не является ли антитело дефектным!

Возможно, метка недоступна, гибридный белок мог деградировать, или же уровень экспрессии может быть ниже ожидаемого.

Проверьте рассчитанную молекулярную массу экспрессированного белка и наличие меченого участка.

Также полезно включать подходящие положительные и отрицательные контроли в вестерн-блоттинг. Если антитело, распознающее известный меченый белок, не распознает экспериментальный образец, то проблема может заключаться в гибридном белке или в подготовке образца.

Вывод

His, GST, MBP, FLAG и другие метки используются для решения различных задач в исследованиях белков.

Для стандартной аффинной очистки наиболее удобны белки с His-меткой. В сложных проектах экспрессии белки с GST- и MBP-метками часто можно совместно экспрессировать с интересующим белком в виде гибридного белка. Белки, экспрессируемые с FLAG-меткой, могут быть очищены и обнаружены с помощью специфических антител. Флуоресцентные метки позволяют локализовать белки в живых клетках.

Выбор метки также подразумевает выбор подходящего очищающего материала и антител для обнаружения.

Компания Solarbio предоставляет рекомбинантные белки-метки, антитела, специфичные для меток, и услуги по экспрессии белков для поддержки исследований в области рекомбинантных белков. Для выбора продукта или получения технической помощи исследователи могут предоставить информацию о целевом белке, системе экспрессии, требованиях к очистке и предполагаемом дальнейшем применении.

Часто задаваемые вопросы

В1: В чем разница между бирой His и биркой GST?

A1: Его метка представляет собой небольшой пептид, обычно содержащий шесть остатков гистидина, тогда как GST — это белок приблизительно 26 кДа. Его метки обычно используются для аффинной очистки с металлами. Метки GST поддерживают аффинную очистку с глутатионом и могут улучшить растворимость белков, хотя их больший размер может влиять на поведение белков.

В2: Какой белковый тег лучше всего подходит для повышения растворимости рекомбинантных белков?

A2: MBP и GST — это широко используемые метки для нерастворимых белков. MBP особенно полезен для эукариотических белков, экспрессируемых в бактериях. Однако результаты могут различаться для разных белков и даже для разных версий одного и того же белка. Лучше всего протестировать несколько различных гибридных конструкций.

В3: Можно ли обнаружить белки с FLAG-меткой методом вестерн-блоттинга?

A3: Да, белки с FLAG-меткой можно обнаружить с помощью соответствующих антител к FLAG-метке в экспериментах по вестерн-блоттингу или иммунопреципитации. Короткая пептидная последовательность FLAG-метки обеспечивает специфическое распознавание антителами. Для обнаружения белков с FLAG-меткой необходимы совместимые антитела, а также оптимальная подготовка образцов.