Explicación de las etiquetas proteicas comunes: His, GST, MBP, FLAG y etiquetas fluorescentes.

Las etiquetas se utilizan para diversos fines durante la expresión de proteínas recombinantes. Facilitan la purificación, la identificación y el estudio de las interacciones proteicas. Si ha trabajado con proteínas recombinantes, seguramente se habrá encontrado con etiquetas como la His, la GST, la MBP o la FLAG. Estas se mencionan en los vectores de expresión utilizados para crear la proteína recombinante, en los protocolos de purificación y en los anticuerpos empleados para su detección.

Incluso cuando una proteína produce una banda de expresión intensa en SDS-PAGE, su purificación puede resultar muy difícil. La proteína puede formar agregados grandes e insolubles o, tras haber sido purificada con éxito mediante un anticuerpo, puede no reaccionar con este como se espera.

Se utilizan diferentes marcadores de proteínas para distintos fines. Conociendo las propiedades de estos marcadores, se puede planificar el experimento de interés incluso antes de solicitar los reactivos necesarios. Esto puede ayudar a minimizar varios problemas potenciales.

¿Qué son las etiquetas de proteínas y por qué se utilizan?

Cómo funcionan las proteínas marcadas

Una etiqueta proteica es un péptido corto, o incluso una proteína más grande, que se fusiona a una proteína objetivo mediante tecnología de ADN recombinante.

La proteína de fusión resultante consta de la proteína diana y la etiqueta. Las propiedades de la etiqueta permiten su uso para la purificación de proteínas, el aumento de su solubilidad, la detección con anticuerpos en Western blots y otras aplicaciones, entre otras. Las proteínas marcadas también pueden ser monitorizadas en células.

Se puede unir una etiqueta proteica al extremo N-terminal o al extremo C-terminal de una proteína diana. Dependiendo de la estructura de la proteína y del objetivo del experimento, se debe seleccionar el sitio de unión más adecuado.

Las etiquetas pequeñas tienen un impacto mínimo en el tamaño total de la proteína. Por el contrario, las etiquetas más grandes pueden afectar el plegamiento, la solubilidad y las interacciones de la proteína.

Elegir una etiqueta de proteína va más allá de simplemente encontrar un vector de expresión adecuado para ella.

Selección de etiquetas en función de los objetivos experimentales

Antes de poder seleccionar una etiqueta para la expresión, determine qué necesita hacer con ella.

Para la purificación por afinidad rutinaria, una etiqueta His es suficiente, mientras que para problemas de solubilidad, etiquetas como GST y MBP son muy útiles. Para la detección basada en anticuerpos, la etiqueta FLAG se usa con frecuencia para detectar proteínas de interés. Las etiquetas fluorescentes son muy útiles para estudios de localización de proteínas.

Las etiquetas peptídicas cortas y los socios de fusión más grandes difieren en sus efectos sobre la solubilidad, la purificación y la función de las proteínas. Las etiquetas pequeñas, como His y FLAG, generalmente añaden menos peso molecular, mientras que los socios más grandes, como GST y MBP, pueden mejorar la expresión soluble de ciertas proteínas. La elección óptima depende del objetivo experimental y de las propiedades de la proteína diana.

No existe una única etiqueta proteica que sea óptima para todas las proteínas. La elección de la etiqueta suele depender de varios criterios, como el sistema huésped de expresión, los pasos de purificación posteriores previstos y la importancia de que la proteína expresada conserve su actividad biológica natural.

Etiqueta His y etiqueta GST para la purificación de proteínas

Su etiqueta: Una pequeña etiqueta para la cromatografía de afinidad

La etiqueta His es una de las etiquetas proteicas más utilizadas en la producción de proteínas recombinantes.

La etiqueta 6×His típica es una secuencia de 6 residuos de histidina, HHHHHH. Su pequeño tamaño la hace adecuada porque no añade demasiado peso a la proteína de interés.

Las proteínas con etiqueta His se purifican habitualmente mediante cromatografía de afinidad de metales inmovilizados, también conocida como IMAC.

En la cromatografía de afinidad de una proteína de fusión con etiqueta de histidina, los residuos de histidina de la proteína de fusión interactúan con iones metálicos como el níquel o el cobalto, que están unidos a una matriz cromatográfica. Tras eliminar las impurezas mediante lavado, la proteína de fusión unida se eluye utilizando un tampón que contiene imidazol y otras condiciones de elución adecuadas.

Sus etiquetas se encuentran entre las más utilizadas para la expresión de proteínas bacterianas, especialmente en E. coli.

Además de una expresión proteica suficiente, la accesibilidad de la etiqueta His es importante para la unión a la resina. Una etiqueta His oculta no puede unirse a la resina y, por lo tanto, puede dar lugar a resultados de purificación muy deficientes.

Además, la composición del tampón puede interferir con la purificación por afinidad de metales, por ejemplo, mediante agentes quelantes o por otros componentes del tampón.

Etiqueta GST: Mejora de la solubilidad y la purificación

GST es una proteína marcadora de aproximadamente 26 kDa llamada glutatión S-transferasa.

Las etiquetas de GST se utilizan con frecuencia en sistemas de expresión procariotas. Algunas proteínas recombinantes se vuelven más solubles tras ser marcadas con GST y pueden purificarse mediante cromatografía de afinidad con glutatión.

Cabe señalar que, si bien una pequeña etiqueta His normalmente formaría un socio de fusión bastante pequeño, el socio de fusión GST forma un socio de fusión bastante grande, lo que puede ser muy útil si la proteína objetivo es inestable o incluso insoluble por sí sola.

Solarbio ofrece Proteína recombinante con etiqueta GST (P02337) para investigaciones relacionadas con proteínas.

También se pueden realizar estudios de interacción proteica utilizando proteínas de fusión GST. Estas se emplean en ensayos convencionales de precipitación con GST, tras lo cual la proteína marcada se une a una resina de glutatión. Posteriormente, todas las proteínas que interactúan con la proteína marcada se pueden separar de las demás proteínas unidas a otras resinas mediante lavado y detectar mediante Western blot.

En la práctica, el uso de GST presenta limitaciones. La proteína puede dimerizarse y el tamaño de la etiqueta puede afectar la conformación o la actividad de la proteína diana.

Se puede incluir un sitio de escisión de proteasa adecuado en el socio de fusión durante el diseño del constructo para eliminar la etiqueta GST después de la purificación, si fuera necesario, y evitar que interfiera con su experimento.

Etiquetas MBP y FLAG en la investigación de proteínas recombinantes

Etiqueta MBP: Una opción útil para proteínas poco solubles

Proteína de unión a maltosa, MBP. Se trata de una proteína de 40 kDa que se utiliza como marcador para proteínas expresadas en bacterias como proteína de fusión.

La MBP puede mejorar la solubilidad aparente de algunas proteínas recombinantes en las que se expresa.

La expresión de proteínas eucariotas en E. coli puede resultar complicada debido al plegamiento incorrecto y a la formación de cuerpos de inclusión insolubles. Esto puede solucionarse utilizando una etiqueta 6xHis.

Las proteínas de fusión MBP también pueden purificarse mediante cromatografía de afinidad con amilosa.

La proteína recombinante MBP Tag (P02841) está disponible en Solarbio como proteína recombinante Tag.

El hecho de que una proteína se vuelva más soluble no significa que esté plegada correctamente ni que esté activa.

Compruebe la actividad de su proteína de fusión como proteína purificada y no se fíe únicamente de la cantidad de proteína que permanece en solución como proteína de fusión.

Etiqueta FLAG: Detección de anticuerpos de tamaño pequeño y conveniente

FLAG es una etiqueta peptídica muy corta que consta de 8 aminoácidos y tiene la secuencia DYKDDDDK.

En comparación con GST y MBP, FLAG es una etiqueta que añade muy poco peso molecular a una proteína recombinante.

La principal ventaja de una etiqueta de unión a anticuerpos, como la etiqueta FLAG, reside en el reconocimiento sencillo del antígeno correspondiente por anticuerpos específicos. Las proteínas marcadas con FLAG pueden detectarse mediante anticuerpos anti-FLAG y purificarse utilizando matrices de afinidad anti-FLAG adecuadas.

Las propiedades de la etiqueta FLAG permiten su uso en Western blot, inmunoprecipitación y en el estudio de complejos proteicos.

Además de servir como motivo de reconocimiento para los anticuerpos anti-FLAG, la secuencia FLAG contiene un motivo de reconocimiento para la enzima enterocinasa, que puede utilizarse para escindir la etiqueta de una proteína de fusión, siempre que se realice la fusión correcta y se empleen las condiciones de escisión adecuadas.

Los investigadores que busquen un producto de etiqueta recombinante correspondiente pueden considerar la proteína de etiqueta FLAG recombinante (P02839).

La etiqueta FLAG, aunque pequeña, debe colocarse teniendo en cuenta el dominio funcional más cercano. Puede afectar las interacciones de la proteína con otras moléculas o incluso la accesibilidad al anticuerpo de detección.

Probar las versiones N-terminal y C-terminal del reactivo de detección puede resolver un problema de detección sin necesidad de fabricar un anticuerpo.

Etiquetas de proteínas fluorescentes para localización y detección

Variantes de GFP y etiquetas mCherry

Mediante microscopía de fluorescencia, se pueden utilizar marcadores de proteínas fluorescentes para observar la ubicación y rastrear el movimiento de las proteínas de fusión.

Algunos ejemplos comunes son eGFP, eCFP, eYFP y mCherry.

Todas las proteínas fluorescentes presentan diferentes máximos de excitación y emisión. Por lo tanto, se pueden seleccionar distintos canales de imagen para cada proteína. En ocasiones, incluso es posible monitorizar más de una proteína en un mismo experimento.

mCherry es una proteína fluorescente roja que se utiliza a menudo para crear proteínas de fusión con el fin de estudiar la localización de proteínas. Solarbio Ofrece proteína recombinante mCHERRY Tag (P02838) para investigación.

El marcaje fluorescente permite localizar proteínas dentro de las células y estudiar su transporte. También puede utilizarse para determinar cómo los cambios en la expresión génica o proteica afectan la distribución de proteínas dentro de la célula.

Cabe señalar, sin embargo, que la simple fluorescencia no demuestra necesariamente que una proteína determinada sea funcional. Las proteínas fluorescentes de mayor tamaño, como estas, pueden interferir con el comportamiento de la proteína dependiendo de su posición dentro de ella.

Al analizar las imágenes, también deben tenerse en cuenta la expresión génica, la madurez de la fluorescencia y la fluorescencia de fondo.

Emparejamiento de proteínas recombinantes con anticuerpos específicos para dichas proteínas.

¿Por qué son importantes los anticuerpos de marcaje?

El uso de anticuerpos "marcadores" también puede resultar muy conveniente para detectar proteínas de fusión, en lugar de tener que generar un nuevo anticuerpo para cada objetivo individual.

Es posible estudiar proteínas no relacionadas utilizando varias proteínas diferentes con la misma etiqueta GST. Estas proteínas pueden detectarse mediante un anticuerpo anti-GST adecuado.

Solarbio Anticuerpo monoclonal anti-etiqueta GST (K200006M) Está diseñado para la detección de etiquetas GST en aplicaciones experimentales compatibles. Los investigadores deben confirmar la idoneidad del anticuerpo basándose en el ensayo previsto y los datos de validación del producto.

Además de los anticuerpos mencionados anteriormente, también ofrecemos Anticuerpo policlonal anti-etiqueta GST, Anticuerpo monoclonal anti-MBP, Anticuerpo policlonal anti-MBP Tag y Anticuerpo policlonal anti-etiqueta Flag.

Los anticuerpos monoclonales y policlonales pueden ser muy útiles en diferentes aplicaciones, pero reconocen diferentes epítopos y tienen propiedades diferentes.

La selección de un anticuerpo debe tener en cuenta el método experimental, las condiciones en las que se preparó la muestra y la accesibilidad de la etiqueta de fusión.

La especificidad del anticuerpo, la accesibilidad del epítopo y el método de producción del anticuerpo pueden influir en la detección de proteínas marcadas. Las tecnologías de anticuerpos recombinantes también ofrecen opciones para desarrollar reactivos de detección con propiedades de unión definidas.

Detección de proteínas de fusión fluorescentes con anticuerpos

Las proteínas fluorescentes también pueden detectarse con anticuerpos específicos para cada etiqueta.

Esto puede resultar muy útil en diversas situaciones: cuando la señal de fluorescencia es muy débil; cuando las muestras ya han sido procesadas para Western blot; o simplemente para proporcionar un medio adicional para comprobar la expresión de proteínas.

Para la detección de proteínas marcadas con mCherry, el Anticuerpo monoclonal anti-etiqueta mCherry (K200015M) Se puede utilizar el producto de Solarbio.

También suministramos varios productos recombinantes con múltiples etiquetas, entre ellos la proteína recombinante Tag-5 (P06425) y la proteína recombinante Tag-9 (P06426).

Estos productos son combinaciones de secuencias de etiquetas comunes. Pueden ser útiles en cualquier proyecto de investigación que involucre el reconocimiento de etiquetas o sistemas de detección relacionados.

Verifique siempre que el producto sea adecuado para el anticuerpo y la aplicación que esté utilizando en sus experimentos.

Problemas comunes al trabajar con proteínas marcadas

Una alta expresión no siempre significa una purificación fácil.

Un error que se comete con frecuencia es elegir una etiqueta que normalmente produce una alta expresión.

Incluso cuando se expresa en niveles elevados, una proteína puede formar cuerpos de inclusión o agregados durante el proceso de purificación.

Una proteína de fusión MBP o GST puede ser útil si la solubilidad es el principal problema a resolver. Sin embargo, si su proteína ya es soluble y solo necesita una purificación sencilla, una etiqueta His más pequeña podría ser la mejor opción.

La expresión, la inducción, las condiciones del tampón y la purificación influyen en los resultados.

Para los clientes que no pueden establecer un sistema de expresión adecuado en su laboratorio, Solarbio también ofrece Servicios de investigación relacionados con la expresión de proteínas incluyendo la producción y purificación de proteínas recombinantes.

Señales débiles de anticuerpos tras la expresión

¿Una proteína marcada con un epítopo no se detecta con un anticuerpo? ¡Entonces, primero compruebe si el anticuerpo está defectuoso!

Es posible que la etiqueta no sea accesible, que la proteína de fusión se haya degradado o que la expresión sea menor de lo esperado.

Verifique el peso molecular calculado de la proteína expresada y compruebe la presencia de la región marcada.

También es útil incluir controles positivos y negativos adecuados en los Western blots. Si un anticuerpo que reconoce una proteína marcada conocida no reconoce la muestra experimental, el problema podría estar en la proteína de fusión o en la preparación de la muestra.

Conclusión

Las etiquetas His, GST, MBP, FLAG y otras sirven para resolver diferentes tipos de problemas en la investigación de proteínas.

Para la purificación por afinidad rutinaria, las proteínas con etiqueta His son las más convenientes. En proyectos de expresión complejos, las proteínas con etiquetas GST y MBP a menudo se pueden coexpresar con la proteína de interés como una proteína de fusión. Las proteínas expresadas con una etiqueta FLAG se pueden purificar y detectar con anticuerpos específicos. Las etiquetas fluorescentes permiten la localización de proteínas en células vivas.

Elegir la etiqueta también implica elegir el material de purificación y los anticuerpos de detección adecuados.

Solarbio ofrece proteínas recombinantes con etiquetas, anticuerpos específicos para dichas etiquetas y servicios de expresión de proteínas para apoyar la investigación en el campo de las proteínas recombinantes. Para la selección de productos o asistencia técnica, los investigadores pueden proporcionar la proteína objetivo, el sistema de expresión, los requisitos de purificación y la aplicación posterior prevista.

Preguntas frecuentes

P1: ¿Cuál es la diferencia entre la etiqueta His y la etiqueta GST?

A1: La etiqueta His es un péptido pequeño que generalmente contiene seis residuos de histidina, mientras que la GST es una proteína de aproximadamente 26 kDa. Las etiquetas His se utilizan comúnmente para la purificación por afinidad con metales. Las etiquetas GST facilitan la purificación por afinidad con glutatión y pueden mejorar la solubilidad de la proteína, aunque su mayor tamaño puede afectar su comportamiento.

P2: ¿Qué etiqueta de proteína es la mejor para mejorar la solubilidad de la proteína recombinante?

A2: MBP y GST son marcadores comúnmente utilizados para proteínas insolubles. MBP es particularmente útil para proteínas eucariotas expresadas en bacterias. Sin embargo, los resultados pueden variar según la proteína e incluso según la versión de la misma. Lo ideal es probar varias construcciones de fusión diferentes.

P3: ¿Se pueden detectar las proteínas marcadas con FLAG mediante Western blot?

A3: Sí, las proteínas marcadas con FLAG pueden detectarse mediante anticuerpos anti-FLAG adecuados en experimentos de Western blot o inmunoprecipitación. La corta secuencia peptídica de la etiqueta FLAG permite su reconocimiento específico por los anticuerpos. La detección de proteínas marcadas con FLAG requiere anticuerpos compatibles y una preparación óptima de la muestra.