Cómo detectar, eliminar y prevenir el micoplasma en cultivos celulares

El micoplasma es uno de esos problemas de cultivo celular que pueden pasar desapercibidos durante mucho tiempo. El medio de cultivo puede parecer transparente. Las células pueden permanecer adheridas. Al principio, no parece haber nada grave.

Entonces empiezan a aparecer los resultados extraños.

Las células crecen más lentamente que antes. La eficiencia de la transfección disminuye sin motivo aparente. El medio se torna amarillo más rápido de lo habitual. Algunas células se agrupan de forma irregular, mientras que otras se desprenden. Dos experimentos realizados con el mismo protocolo ya no dan el mismo resultado.

Para entonces, la contaminación por micoplasma ya podría estar afectando al cultivo.

Estos organismos miden tan solo entre 50 y 300 nm, lo que les permite atravesar algunos filtros utilizados para retener bacterias comunes. Además, el micoplasma carece de pared celular, por lo que el tratamiento habitual con penicilina-estreptomicina no ofrece una protección fiable.

Un plan de control eficaz requiere tres partes. El laboratorio debe detectar la contaminación precozmente, tratar rápidamente los cultivos infectados y reducir la probabilidad de que el mismo problema se repita. Para los laboratorios que utilizan pruebas de detección basadas en fluorescencia, un kit completo puede simplificar la tinción, la fijación, el montaje y la preparación para microscopía. Los investigadores que implementan un proceso de gestión de la contaminación más amplio también pueden consultar las opciones disponibles. soluciones para el cultivo celular al planificar los procedimientos diarios.

¿Por qué es fácil pasar por alto el micoplasma?

La cultura aún puede parecer normal.

La contaminación grave es más fácil de detectar. Las células pueden volverse granulares, crecer en parches, desprenderse del matraz o dejar de dividirse normalmente.

La contaminación de bajo nivel es mucho menos evidente. Las células pueden seguir proliferando mientras experimentan cambios metabólicos y en la expresión génica. Los micoplasmas utilizan nutrientes del medio de cultivo y pueden interferir con el metabolismo de los aminoácidos, la síntesis de nucleótidos, la replicación del ADN, la producción de ARN y la expresión de proteínas.

Esto puede generar mucha frustración en el laboratorio cuando un operador ajusta continuamente los parámetros de transfección, cambia de suero o repite un ensayo, sin darse cuenta de que el problema reside en realidad en el stock de células.

Algunos proyectos son más sensibles que otros. La señalización celular, la detección de fármacos, la expresión génica, el análisis de citoquinas y el trabajo de transfección pueden verse afectados. Los investigadores que trabajan con estas aplicaciones también pueden consultar la documentación pertinente. vías de la biología celular al revisar cambios inesperados en los resultados experimentales.

Los antibióticos de rutina pueden ocultar el problema.

Muchos laboratorios añaden penicilina y estreptomicina al medio de cultivo como práctica habitual. Estos antibióticos ayudan a controlar algunas bacterias comunes, pero no deben considerarse un sistema de prevención contra el micoplasma.

El micoplasma carece de pared celular. Por lo tanto, los antibióticos que actúan sobre la formación de la pared celular tienen poco efecto sobre él. El cultivo puede permanecer limpio mientras persista la contaminación.

El uso prolongado de antibióticos también puede dificultar la detección de la enfermedad. Puede suprimir otras bacterias sin eliminar el micoplasma, lo que resulta en un cultivo que, aunque aparentemente limpio, no es apto para realizar experimentos fiables.

¿De dónde procede el micoplasma en los cultivos celulares?

Las personas son una fuente común

Una cantidad sorprendente de contaminación comienza con la manipulación cotidiana.

El micoplasma puede transmitirse a través de la saliva y las gotitas respiratorias. Hablar por encima de un frasco abierto, tocar un teléfono con guantes, moverse entre las puertas y la cabina de bioseguridad, o mantener los mismos guantes puestos durante demasiado tiempo pueden introducir contaminantes en el área de trabajo.

Rociar los guantes con agua no elimina por completo el contacto con las superficies. Una vez que los guantes tocan una silla, un cuaderno, la manija de una puerta o un teléfono, generalmente es más seguro reemplazarlos.

El derrame de medio de cultivo es otra fuente común de contaminación. Una pequeña salpicadura dentro del armario puede esparcir gotitas sobre pipetas, frascos, gradillas y recipientes de cultivo cercanos. Debe limpiarse de inmediato, en lugar de esperar hasta el final de la sesión.

Las nuevas células podrían llegar contaminadas.

Las células recibidas de otro laboratorio no deben introducirse directamente en la sala de cultivo principal. Una línea celular puede parecer sana y aun así contener micoplasma.

El tejido primario también conlleva un mayor riesgo porque proviene directamente de material animal o humano. Incluso un muestreo minucioso no puede eliminar todas las posibles fuentes de contaminación.

Las células nuevas deben cultivarse por separado, analizarse y mantenerse en cuarentena hasta que se confirme un resultado negativo. Posteriormente, se puede congelar una muestra libre de células para su uso posterior.

Los reactivos compartidos propagan la contaminación rápidamente.

Un frasco contaminado de medio de cultivo, PBS, tripsina o suero puede afectar a más de una línea celular. Lo mismo ocurre con las pipetas, los tubos de aspiración y los baños de agua compartidos.

La práctica más segura es sencilla: manipular una línea celular a la vez, usar pequeñas cantidades de reactivos, mantener los reactivos de cuarentena separados de los reactivos de cultivo habituales y evitar transportar el mismo frasco entre diferentes áreas de trabajo.

¿Qué método de detección de micoplasma funciona mejor?

La PCR y la qPCR son prácticas para el cribado rutinario.

Las pruebas basadas en PCR se utilizan ampliamente porque ofrecen un resultado claro en pocas horas. Este método suele detectar secuencias de ADN de micoplasma conservadas, incluidas regiones asociadas a los genes del ARNr 16S.

Es adecuado para la selección de nuevas células, las revisiones periódicas de bancos de células, la resolución de problemas, la evaluación de sueros o medios de cultivo y el control de calidad previo a la publicación.

Solarbio suministra varios productos para la detección de micoplasma en trabajos de cultivo celular. Estos incluyen: Kit de prueba de micoplasma CA1081 (método PCR) y Kit de prueba rápida de micoplasma CA1082 (para cultivo celular).

La tinción con Hoechst es útil para una comprobación rápida.

La tinción fluorescente con Hoechst es económica y no requiere equipos complicados más allá de un microscopio de fluorescencia adecuado. Para la detección basada en fluorescencia, Kit de detección de micoplasma CA1080 Está diseñado para la detección de micoplasmas mediante microscopio en cultivos celulares.

El kit incluye la solución de trabajo Hoechst 33258, la solución fijadora y el medio de montaje antifluorescencia para la tinción, la fijación y la preparación de portaobjetos.

En una muestra negativa de células Vero, la fluorescencia de Hoechst se limita principalmente a los núcleos, sin que se observen numerosos puntos fluorescentes finos fuera de ellos.

Cuando hay contaminación, pueden aparecer pequeños puntos fluorescentes alrededor de la superficie celular o entre las células.

Esta prueba resulta útil para el trabajo en el aula, para comprobaciones rápidas y para laboratorios con presupuestos limitados para pruebas.

Tiene sus limitaciones. Los restos celulares, los cuerpos apoptóticos y la fluorescencia de fondo pueden tener un aspecto similar al del micoplasma. Un resultado de tinción dudoso debe confirmarse mediante PCR.

Las pruebas de cultivo requieren más tiempo.

Las pruebas basadas en cultivos siguen siendo importantes en algunos entornos regulados y en los procesos de liberación de productos. La muestra se coloca en un medio de cultivo adecuado y se monitoriza para detectar el crecimiento de micoplasmas.

El principal problema es la rapidez. Los resultados pueden tardar entre 7 y 21 días. Esto no es práctico cuando un laboratorio necesita decidir rápidamente si se puede utilizar un lote de células.

Algunas especies de micoplasma son más difíciles de cultivar que otras, por lo que el método depende de los medios de cultivo adecuados y de operadores experimentados.

Las pruebas de luminiscencia ofrecen resultados rápidos.

Los ensayos rápidos de luminiscencia detectan la actividad enzimática o las señales metabólicas asociadas a micoplasmas viables. Son útiles cuando se necesita analizar muchas muestras en poco tiempo.

El laboratorio necesita equipos compatibles y se debe verificar cuidadosamente la interferencia de fondo. Para trabajos de alto riesgo, un resultado rápido puede requerir confirmación mediante PCR o cultivo.

Los equipos que no estén seguros de qué método se adapta a su tipo de célula o cronograma de pruebas pueden utilizar el de Solarbio. servicio técnico Recursos para el soporte de productos y flujos de trabajo.

¿Debe tratarse una línea celular contaminada?

Algunas culturas es mejor descartarlas.

El tratamiento no siempre es la opción correcta.

Si la línea celular es fácil de reemplazar, está muy contaminada o ya se encuentra almacenada como material congelado limpio, su eliminación suele ser más segura. Mantener un cultivo muy contaminado en el laboratorio supone un riesgo para todas las líneas celulares cercanas.

El rescate resulta más razonable cuando las células son escasas, han sido modificadas genéticamente, seleccionadas durante un largo período, provienen de un tejido primario limitado o son difíciles de obtener nuevamente.

El cultivo infectado debe aislarse antes de comenzar el tratamiento. La incubadora, la cabina, el sistema de aspiración, las pipetas, el baño de agua y las superficies cercanas también deben limpiarse. Tratar solo las células no será de mucha ayuda si el área de trabajo permanece contaminada.

El tratamiento antibiótico casero es difícil de controlar.

Los macrólidos, las tetraciclinas, las quinolonas y compuestos relacionados pueden ser eficaces contra algunas especies de micoplasma. La dificultad reside en encontrar una concentración que elimine el microorganismo sin matar las células.

Una dosis que tolera una línea celular puede impedir el crecimiento de otra. Las células primarias sensibles son especialmente problemáticas.

Una dosis baja puede limitarse a suprimir la contaminación. El cultivo puede dar negativo durante el tratamiento y volver a dar positivo posteriormente. Por este motivo, el tratamiento antibiótico casero debe comenzar con una pequeña prueba de tolerancia en lugar de utilizar todo el cultivo celular.

Los reactivos de eliminación comerciales son más fáciles de usar.

Los reactivos comerciales para la eliminación de micoplasmas evitan que el laboratorio tenga que preparar varios antibióticos y probar muchas concentraciones desde cero.

Solarbio CA1090 MYCOPLASMA Scavenger y Reactivo de eliminación de micoplasma CA1093 Están diseñados para flujos de trabajo de cultivo celular contaminados. El tratamiento suele continuar durante varios pases, dependiendo del tipo de célula y del nivel de contaminación.

Las células no deben analizarse únicamente mientras el reactivo de eliminación esté presente. Tras el tratamiento, necesitan un periodo de recuperación en un medio libre de reactivos. Posteriormente, se debe repetir la prueba. Un segundo resultado negativo tras un cultivo adicional proporciona una respuesta más fiable.

¿Cómo se puede prevenir la contaminación por micoplasma?

Ponga en cuarentena las celdas antes de su uso rutinario.

Cada línea celular entrante debe tener un registro. Este registro debe incluir su origen, fecha de llegada, número de paso, resultado de la prueba, operador y lugar de almacenamiento.

El cultivo debe mantenerse separado hasta que finalicen las pruebas. Tras un resultado negativo, se debe congelar una muestra maestra limpia. Los trabajos futuros podrán comenzar con esta muestra en lugar de con un cultivo antiguo que haya estado en uso durante meses.

Limpie regularmente los equipos compartidos.

La cabina de bioseguridad debe limpiarse antes y después de su uso. Las bandejas de agua de la incubadora deben vaciarse y desinfectarse periódicamente. Los baños de agua, los soportes de la centrífuga, las platina del microscopio, los frascos de aspiración y las pipetas también requieren atención.

El spray Solarbio CA1091 para la eliminación de micoplasmas se puede utilizar como parte de un proceso de limpieza ambiental. El reactivo CA1101 para la prevención de micoplasmas está disponible para su uso preventivo en cultivos celulares. Los laboratorios pueden comprobarlo. actualizaciones de productos al revisar sus materiales de control de la contaminación.

Pruebe las células en el momento adecuado.

Realizar pruebas una vez al año no es suficiente para un laboratorio de cultivo celular activo.

Las células deben analizarse al recibirlas, antes de congelar una muestra madre, después de descongelar una muestra importante, antes de un experimento prolongado, antes de compartir células con otro laboratorio y siempre que aparezca un crecimiento inusual.

Un intervalo de tres meses para las pruebas es un punto de partida razonable para muchos laboratorios de investigación. Las instalaciones de alto rendimiento o los laboratorios que reciben regularmente líneas celulares externas pueden necesitar realizar pruebas con mayor frecuencia.

Un buen registro de datos es tan importante como la prueba en sí. Cuando cada línea celular tiene un historial claro, resulta mucho más fácil rastrear dónde se originó la contaminación y qué cultivos pudieron haber estado expuestos.

Solarbio Suministra productos para investigación en biología celular, biología molecular, inmunología, bioquímica, tinción, estándares analíticos y moléculas pequeñas. Sus sistemas de gestión incluyen las certificaciones ISO 9001, ISO 13485, ISO 14001 e ISO 45001.

Conclusión

El control del micoplasma no requiere un sistema complicado, pero sí un trabajo regular.

Pruebe las células nuevas antes de que ingresen al laboratorio principal. Mantenga separadas las diferentes líneas celulares y los reactivos. Limpie el equipo compartido según lo programado. Congele una muestra madre limpia mientras el cultivo aún esté en buenas condiciones.

Cuando se detecte contaminación, aísle primero las células. Reemplace el cultivo siempre que sea posible. Si las células son valiosas, utilice un proceso de eliminación controlado y confirme el resultado una vez retirado el reactivo de tratamiento.

Lo fundamental es no esperar a que el medio cambie de color o a que las células empiecen a desprenderse del matraz. Para entonces, los datos experimentales ya podrían estar afectados.

Para obtener ayuda para elegir un producto adecuado de detección, eliminación o prevención, Contacta con el equipo de Solarbio.

FAQ

P1: ¿Puede la penicilina-estreptomicina prevenir la contaminación por micoplasma?

A1: No. La penicilina-estreptomicina no proporciona una protección fiable porque el micoplasma carece de la estructura normal de la pared celular a la que se dirigen muchos antibióticos estándar.

P2: ¿Con qué frecuencia se deben analizar los cultivos celulares para detectar micoplasma?

A2: Muchos laboratorios realizan pruebas cada tres meses. También se deben realizar pruebas cuando llegan las células, antes de congelar una muestra madre, antes de experimentos importantes y cuando aparece un crecimiento anormal.

P3: ¿Se puede identificar la contaminación por micoplasma observando el medio de cultivo?

A3: No con certeza. El medio puede permanecer transparente durante la fase inicial de contaminación. El amarilleamiento rápido, el crecimiento celular lento, la transfección deficiente o una morfología inusual pueden ser señales de alerta, pero aún se necesita una prueba adecuada.

P4: ¿Es la PCR mejor que la tinción con Hoechst para la detección de micoplasma?

A4: Ambos métodos pueden complementarse: la tinción con Hoechst es idónea para el monitoreo rutinario y el análisis preliminar, mientras que la PCR es más apropiada para la confirmación de casos de presunta contaminación o situaciones que requieren mayor sensibilidad. Para muestras críticas o pruebas de liberación de lotes biofarmacéuticos, se recomienda combinar métodos basados ​​en cultivos (el método de referencia) o emplear múltiples métodos para la validación cruzada y así mejorar la fiabilidad de los resultados.

P5: ¿Debería rescatarse cada línea celular contaminada?

A5: No. Las células reemplazables o muy contaminadas suelen desecharse de forma segura. El rescate se considera principalmente para líneas celulares raras, primarias, seleccionadas o modificadas genéticamente.

P6: ¿Cuándo se deben volver a analizar las células después del tratamiento?

A6: Tras el tratamiento de eliminación de micoplasma, realice la primera prueba de PCR después de 2-3 pases (7-10 días). Realice la segunda prueba con un intervalo de 7 días. Dos resultados negativos consecutivos indican una eficacia preliminar. El seguimiento continuo hasta obtener un resultado negativo el día 28 confirma la erradicación.

P7: ¿Qué productos de Solarbio cubren la detección y el control del micoplasma?

A7: Solarbio proporciona CA1080, CA1081 y CA1082 para detección, CA1090 y CA1093 para eliminación, CA1091 para limpieza ambiental y CA1101 para prevención.