كيفية الكشف عن الميكوبلازما وإزالتها والوقاية منها في مزارع الخلايا

تُعدّ الميكوبلازما من مشاكل زراعة الخلايا التي قد تبقى خفية لفترة طويلة. قد يبدو الوسط صافياً، وقد تبقى الخلايا ملتصقة، ولا يبدو أن هناك أي مشكلة خطيرة في البداية.

ثم تبدأ النتائج الغريبة.

تنمو الخلايا ببطء أكثر من ذي قبل. تنخفض كفاءة نقل الجينات دون سبب واضح. يتحول لون الوسط إلى الأصفر أسرع من المعتاد. تتجمع بعض الخلايا في مجموعات غير منتظمة، بينما تنفصل خلايا أخرى. لم تعد تجربتان أُجريتا باستخدام نفس البروتوكول تعطيان نفس النتيجة.

قد يكون التلوث بالميكوبلازما قد أثر بالفعل على المزرعة بحلول تلك المرحلة.

يبلغ حجم هذه الكائنات الحية ما بين 50 و300 نانومتر فقط، مما يسمح لها بالمرور عبر بعض المرشحات المستخدمة لحجز البكتيريا الشائعة. كما أن الميكوبلازما تفتقر إلى جدار خلوي، لذا فإن العلاج الروتيني بالبنسلين والستربتومايسين لا يوفر حماية موثوقة.

يتطلب برنامج مكافحة التلوث الفعال ثلاثة عناصر أساسية: الكشف المبكر عن التلوث، والتعامل السريع مع المزارع المصابة، والحد من احتمالية تكرار المشكلة. بالنسبة للمختبرات التي تستخدم الفحص القائم على التألق، يمكن لمجموعة أدوات متكاملة تبسيط عمليات التلوين والتثبيت والتركيب والتحضير للفحص المجهري. كما يمكن للباحثين الذين يضعون خطة شاملة لإدارة التلوث مراجعة الأدوات المتاحة. محاليل زراعة الخلايا عند التخطيط للإجراءات اليومية.

لماذا يسهل تفويت الإصابة بالميكوبلازما؟

قد تبدو الثقافة طبيعية

يسهل ملاحظة التلوث الشديد. قد تصبح الخلايا حبيبية، أو تنمو في بقع، أو تنفصل عن القارورة، أو تتوقف عن الانقسام بشكل طبيعي.

يكون التلوث منخفض المستوى أقل وضوحًا بكثير. قد تستمر الخلايا في التكاثر أثناء خضوعها لتغيرات أيضية وتعبير جيني. تستخدم الميكوبلازما العناصر الغذائية من وسط الاستنبات، ويمكنها أن تتداخل مع استقلاب الأحماض الأمينية، وتخليق النيوكليوتيدات، وتضاعف الحمض النووي، وإنتاج الحمض النووي الريبي، والتعبير البروتيني.

قد يؤدي هذا إلى الكثير من الإحباط في المختبر عندما يقوم المشغل بتعديل معايير النقل الجيني باستمرار أو تبديل الأمصال أو تكرار الفحص، دون أن يدرك أن المشكلة تكمن في مخزون الخلايا.

بعض المشاريع أكثر حساسية من غيرها. قد تتأثر عمليات الإشارات الخلوية، وفحص الأدوية، والتعبير الجيني، وتحليل السيتوكينات، وعمليات نقل الجينات. كما قد يراجع الباحثون العاملون في هذه التطبيقات الجوانب ذات الصلة. مسارات بيولوجيا الخلية عند مراجعة التغيرات غير المتوقعة في نتائج التجارب.

قد تخفي المضادات الحيوية الروتينية المشكلة

تُضيف العديد من المختبرات البنسلين والستربتومايسين إلى الوسط الغذائي كإجراء روتيني. تُساعد هذه المضادات الحيوية في السيطرة على بعض أنواع البكتيريا الشائعة، ولكن لا ينبغي اعتبارها وسيلة للوقاية من الميكوبلازما.

لا تحتوي الميكوبلازما على جدار خلوي. لذا، فإن المضادات الحيوية التي تؤثر على تكوين الجدار الخلوي لا يكون لها تأثير يُذكر عليها. وقد تبقى المزرعة صافية بينما يستمر التلوث.

قد يؤدي الاستخدام المطول للمضادات الحيوية إلى صعوبة ملاحظة الحالة. فقد يثبط نمو البكتيريا الأخرى دون القضاء على الميكوبلازما، مما يترك للمُشغِّل مزرعة تبدو نظيفة ظاهريًا ولكنها غير مناسبة لإجراء تجارب موثوقة.

من أين تأتي الميكوبلازما في مزارع الخلايا؟

الناس مصدر مشترك

تبدأ كمية كبيرة من التلوث بشكل مفاجئ من خلال التعامل العادي مع المواد.

قد تنتقل الميكوبلازما عبر اللعاب والرذاذ التنفسي. ويمكن أن يؤدي التحدث فوق قارورة مفتوحة، أو لمس الهاتف أثناء ارتداء القفازات، أو التنقل بين الأبواب وخزانة السلامة البيولوجية، أو ارتداء القفازات نفسها لفترة طويلة جدًا، إلى دخول الملوثات إلى منطقة العمل.

رش القفازات لا يزيل آثار التلامس مع جميع الأسطح. فإذا لامست القفازات كرسيًا أو دفتر ملاحظات أو مقبض باب أو هاتفًا، فعادةً ما يكون استبدالها أكثر أمانًا.

يُعدّ انسكاب الوسط الغذائي مصدرًا شائعًا آخر. قد تتسبب رذاذات صغيرة داخل الخزانة في انتشار القطرات على الماصات والزجاجات والرفوف وأوعية الاستنبات المجاورة. لذا، يجب تنظيفها فورًا بدلًا من تركها حتى نهاية الجلسة.

قد تصل الخلايا الجديدة ملوثة

لا ينبغي إدخال الخلايا الواردة من مختبر آخر مباشرةً إلى غرفة الاستزراع الرئيسية. فقد تبدو سلالة الخلايا سليمة ظاهرياً، ولكنها قد تحمل الميكوبلازما.

كما أن الأنسجة الأولية تحمل مخاطر أكبر لأنها تأتي مباشرة من مواد حيوانية أو بشرية. وحتى مع أخذ العينات بعناية، لا يمكن إزالة جميع مصادر التلوث المحتملة.

ينبغي زراعة الخلايا الجديدة بشكل منفصل، وفحصها، وحفظها في الحجر الصحي حتى يتم التأكد من خلوها من الخلايا. ويمكن بعد ذلك تجميد مخزون نظيف لاستخدامه لاحقاً.

تساهم المواد الكيميائية المشتركة في انتشار التلوث بسرعة.

قد تؤثر زجاجة ملوثة من الوسط الغذائي، أو محلول الفوسفات الملحي، أو التربسين، أو المصل على أكثر من سلالة خلوية واحدة. وينطبق الأمر نفسه على الماصات المشتركة، وأنابيب الشفط، والحمامات المائية.

أفضل عادة هي البساطة. تعامل مع سلالة خلوية واحدة في كل مرة. استخدم كميات صغيرة من الكواشف. احتفظ بكواشف الحجر الصحي منفصلة عن كواشف الاستزراع الروتيني. تجنب حمل الزجاجة نفسها بين مناطق العمل المختلفة.

ما هي أفضل طريقة للكشف عن الميكوبلازما؟

يُعد كل من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) عمليين للفحص الروتيني.

يُستخدم اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على نطاق واسع لأنه يُعطي نتيجة واضحة في غضون ساعات قليلة. ويكشف هذا الأسلوب عادةً عن تسلسلات الحمض النووي المحفوظة للميكوبلازما، بما في ذلك المناطق المرتبطة بجينات الحمض النووي الريبوزي 16S.

وهو مناسب لفحص الخلايا الجديدة، والفحوصات الدورية لبنوك الخلايا، واستكشاف الأخطاء وإصلاحها، وتقييم المصل أو الوسط، ومراقبة الجودة قبل النشر.

تُوفر شركة Solarbio العديد من منتجات الكشف عن الميكوبلازما المستخدمة في زراعة الخلايا. وتشمل هذه المنتجات: مجموعة اختبار الميكوبلازما CA1081 (طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل) و مجموعة اختبار الميكوبلازما السريع CA1082 (لزراعة الخلايا).

يُعد تلوين هوكست مفيدًا لإجراء فحص سريع

يُعدّ التلوين الفلوري باستخدام صبغة هوكست رخيصًا ولا يتطلب معدات معقدة باستثناء مجهر فلوري مناسب. أما بالنسبة للفحص القائم على الفلورة، مجموعة الكشف عن الميكوبلازما CA1080 تم تصميمه لإجراء فحوصات الميكوبلازما باستخدام المجهر في مزارع الخلايا.

تتضمن المجموعة محلول Hoechst 33258 للعمل، ومحلول التثبيت، ووسط التثبيت المضاد للبهتان للتلوين والتثبيت وإعداد الشرائح.

في عينة خلايا فيرو السلبية، يقتصر تألق هوكست بشكل رئيسي على النوى، دون وجود العديد من النقاط الفلورية الدقيقة خارج النوى.

عند وجود التلوث، قد تظهر نقاط فلورية صغيرة حول سطح الخلية أو بين الخلايا.

يُعد هذا الاختبار مفيدًا للعمل الصفي، والفحوصات السريعة، والمختبرات ذات ميزانيات الاختبار المحدودة.

لكن لهذه الطريقة حدود. فقد تبدو بقايا الخلايا والأجسام الميتة والفلورة الخلفية مشابهة للميكوبلازما. لذا، ينبغي تأكيد نتيجة التلوين المشكوك فيها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

يستغرق اختبار الثقافة وقتًا أطول

لا تزال الاختبارات القائمة على الاستنبات مهمة في بعض البيئات الخاضعة للرقابة وفي إجراءات إطلاق المنتجات. تُوضع العينة على أوساط استنبات مناسبة وتُراقب بحثًا عن نمو الميكوبلازما.

تكمن المشكلة الرئيسية في السرعة. قد تستغرق النتائج من 7 إلى 21 يومًا. وهذا غير عملي عندما يحتاج المختبر إلى اتخاذ قرار سريع بشأن إمكانية استخدام مجموعة من الخلايا.

بعض أنواع الميكوبلازما يصعب استزراعها أكثر من غيرها، لذا تعتمد الطريقة على الأوساط المناسبة والمشغلين ذوي الخبرة.

تُعطي اختبارات التألق نتائج سريعة

تكشف فحوصات التألق الضوئي السريعة عن نشاط الإنزيمات أو الإشارات الأيضية المرتبطة بالميكوبلازما الحية. وهي مفيدة عند الحاجة إلى فحص العديد من العينات في وقت قصير.

يحتاج المختبر إلى معدات متوافقة، ويجب فحص التداخلات الخلفية بعناية. في الأعمال عالية الخطورة، قد يتطلب الحصول على نتيجة سريعة تأكيدًا باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أو الزرع.

يمكن للفرق التي ليست متأكدة من الطريقة التي تناسب نوع خلاياها أو جدول اختبارها استخدام Solarbio الخدمة الفنية موارد لدعم المنتج وسير العمل.

هل ينبغي معالجة خط الخلايا الملوث؟

من الأفضل التخلي عن بعض الثقافات

العلاج ليس الخيار الصحيح دائماً.

إذا كان من السهل استبدال سلالة الخلايا، أو كانت شديدة التلوث، أو مخزنة مسبقًا كمخزون مجمد نظيف، فإن التخلص منها يكون عادةً أكثر أمانًا. إن الاحتفاظ بمزرعة شديدة التلوث في المختبر يُشكل خطرًا على جميع سلالات الخلايا المجاورة.

يكون الإنقاذ أكثر منطقية عندما تكون الخلايا نادرة، أو معدلة وراثيًا، أو مختارة على مدى فترة طويلة، أو مشتقة من أنسجة أولية محدودة، أو يصعب الحصول عليها مرة أخرى.

يجب عزل المزرعة المصابة قبل بدء العلاج. كما يجب تنظيف الحاضنة، والخزانة، ونظام الشفط، والماصات، والحمام المائي، والأسطح المجاورة. لن يكون لعلاج الخلايا وحدها فائدة كبيرة إذا بقيت منطقة العمل ملوثة.

يصعب السيطرة على العلاج بالمضادات الحيوية المنزلية

قد تكون الماكروليدات والتتراسيكلينات والكينولونات والمركبات ذات الصلة فعالة ضد بعض أنواع الميكوبلازما. ويكمن التحدي في إيجاد تركيز يقضي على الكائن الحي دون قتل الخلايا.

قد تؤدي جرعة يتحملها نوع خلوي معين إلى توقف نمو نوع خلوي آخر. وتُعد الخلايا الأولية الحساسة صعبة النمو بشكل خاص.

قد لا تؤدي الجرعة المنخفضة إلا إلى كبح التلوث. وقد تكون نتيجة الزرع سلبية أثناء العلاج، ثم تصبح إيجابية لاحقًا. لهذا السبب، ينبغي البدء باختبار تحمل المضادات الحيوية المنزلية على نطاق صغير، بدلًا من استخدام جميع الخلايا.

تُعد مواد الإزالة التجارية أسهل في الاستخدام

توفر الكواشف التجارية لإزالة الميكوبلازما على المختبر عناء تحضير العديد من المضادات الحيوية واختبار العديد من التركيزات من الصفر.

سولاربيو CA1090 كاسح الميكوبلازما و كاشف القضاء على الميكوبلازما CA1093 تُستخدم هذه الطرق لمعالجة عمليات زراعة الخلايا الملوثة. وغالبًا ما تستمر المعالجة عبر عدة دورات، وذلك حسب نوع الخلية ومستوى التلوث.

لا ينبغي فحص الخلايا فقط أثناء وجود عامل الإزالة. بعد المعالجة، تحتاج الخلايا إلى فترة نقاهة في وسط خالٍ من العامل. ثم يُعاد الفحص. وتُعطي نتيجة سلبية ثانية بعد مزيد من الاستزراع إجابةً أكثر موثوقية.

كيف يمكن الوقاية من التلوث بالميكوبلازما؟

عزل الخلايا قبل الاستخدام الروتيني

يجب أن يكون لكل خط خلوي وارد سجل. يجب أن يتضمن السجل مصدره، وتاريخ وصوله، ورقم المرور، ونتيجة الاختبار، والمشغل، وموقع التخزين.

يجب إبقاء المزرعة منفصلة حتى اكتمال الاختبار. بعد الحصول على نتيجة سلبية، يجب تجميد مخزون رئيسي نظيف. يمكن حينها البدء بالعمل المستقبلي من هذا المخزون بدلاً من مزرعة قديمة تم اختبارها لعدة أشهر.

نظف المعدات المشتركة بانتظام

يجب تنظيف خزانة السلامة البيولوجية قبل الاستخدام وبعده. كما يجب تفريغ صواني الماء في الحاضنات وتطهيرها بانتظام. كذلك، تحتاج الحمامات المائية، وحوامل أجهزة الطرد المركزي، ومنصات المجهر، وزجاجات الشفط، والماصات إلى عناية خاصة.

يمكن استخدام بخاخ إزالة الميكوبلازما CA1091 من Solarbio كجزء من عملية تنظيف البيئة. يتوفر كاشف الوقاية من الميكوبلازما CA1101 للاستخدام الوقائي في زراعة الخلايا. يمكن للمختبرات التحقق من ذلك. تحديثات المنتج عند مراجعة مواد مكافحة التلوث الخاصة بهم.

اختبار الخلايا في الوقت المناسب

لا يكفي إجراء الاختبار مرة واحدة في السنة لمختبر زراعة الخلايا النشط.

ينبغي فحص الخلايا عند وصولها، وقبل تجميد المخزون الرئيسي، وبعد إذابة المخزون المهم، وقبل إجراء تجربة طويلة، وقبل مشاركة الخلايا مع مختبر آخر، وكلما ظهر نمو غير عادي.

تُعدّ فترة الاختبار التي تبلغ ثلاثة أشهر نقطة انطلاق معقولة للعديد من مختبرات الأبحاث. أما المرافق ذات الإنتاجية العالية أو المختبرات التي تستقبل بانتظام خطوط خلايا خارجية، فقد تحتاج إلى إجراء الاختبارات بوتيرة أعلى.

تُعدّ السجلات الجيدة بنفس أهمية الاختبار نفسه. فعندما يكون لكل سلالة خلوية تاريخ واضح، يصبح من الأسهل بكثير تتبع مصدر التلوث وتحديد المزارع التي ربما تكون قد تعرضت له.

سولاربيو تُوفر الشركة منتجات بحثية في مجالات بيولوجيا الخلية، والبيولوجيا الجزيئية، وعلم المناعة، والكيمياء الحيوية، والتلوين، والمعايير التحليلية، والجزيئات الصغيرة. وتشمل أنظمة إدارتها شهادات ISO 9001، وISO 13485، وISO 14001، وISO 45001.

استنتاج

لا يتطلب التحكم في الميكوبلازما نظامًا معقدًا، ولكنه يتطلب عملًا منتظمًا.

اختبر الخلايا الجديدة قبل إدخالها إلى المختبر الرئيسي. حافظ على فصل سلالات الخلايا المختلفة والكواشف. نظّف المعدات المشتركة بانتظام. جمّد مخزونًا رئيسيًا نظيفًا بينما لا تزال المزرعة في حالة جيدة.

عند اكتشاف التلوث، اعزل الخلايا أولاً. استبدل المزرعة إن أمكن. إذا كانت الخلايا ذات قيمة، فاستخدم عملية إزالة مضبوطة وتأكد من النتيجة بعد إزالة كاشف المعالجة.

الهدف الأساسي هو عدم انتظار تغير لون الوسط أو بدء تساقط الخلايا من القارورة. فبحلول ذلك الوقت، قد تكون البيانات التجريبية قد تأثرت بالفعل.

للمساعدة في اختيار منتج مناسب للكشف أو الإزالة أو الوقاية، تواصل مع فريق Solarbio.

FAQ

س1: هل يمكن للبنسلين والستربتومايسين أن يمنعا التلوث بالميكوبلازما؟

ج1: لا. لا يوفر البنسلين-ستربتومايسين حماية موثوقة لأن الميكوبلازما تفتقر إلى بنية جدار الخلية الطبيعية التي تستهدفها العديد من المضادات الحيوية القياسية.

س2: كم مرة يجب فحص مزارع الخلايا للكشف عن الميكوبلازما؟

ج2: تجري العديد من المختبرات اختبارات كل ثلاثة أشهر. كما ينبغي إجراء الاختبارات عند وصول الخلايا، وقبل تجميد المخزون الرئيسي، وقبل التجارب الرئيسية، وعند ظهور نمو غير طبيعي.

س3: هل يمكن تحديد التلوث بالميكوبلازما من خلال فحص الوسط؟

ج٣: ليس بثقة. قد يبقى الوسط صافيًا خلال المراحل الأولى من التلوث. قد يكون الاصفرار السريع، أو بطء نمو الخلايا، أو ضعف عملية النقل الجيني، أو الشكل غير المعتاد علامات تحذيرية، ولكن لا يزال من الضروري إجراء اختبار مناسب.

س4: هل تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أفضل من صبغة هوكست للكشف عن الميكوبلازما؟

ج٤: يمكن للطريقتين أن تُكمّل كل منهما الأخرى: يُعدّ تلوين هوكست مناسبًا للمراقبة الروتينية والفحص الأولي، بينما يُعدّ تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أكثر ملاءمةً للاختبارات التأكيدية للتلوث المشتبه به أو الحالات التي تتطلب حساسية أعلى. بالنسبة للعينات الحساسة أو اختبارات إطلاق دفعات المستحضرات الصيدلانية الحيوية، يُوصى بالجمع بين الطرق القائمة على الاستنبات (المعيار الذهبي) أو استخدام طرق متعددة للتحقق المتبادل لتعزيز موثوقية النتائج.

س5: هل ينبغي إنقاذ كل خط خلوي ملوث؟

ج٥: لا. عادةً ما يكون التخلص من الخلايا القابلة للاستبدال أو شديدة التلوث أكثر أمانًا. يُنظر في خيار الإنقاذ بشكل أساسي لسلالات الخلايا النادرة أو الأولية أو المنتقاة أو المعدلة وراثيًا.

س6: متى يجب إعادة فحص الخلايا بعد العلاج؟

أ6: بعد علاج القضاء على الميكوبلازما، يُجرى اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الأول بعد مرور 2-3 دورات (7-10 أيام). يُجرى الاختبار الثاني بعد 7 أيام. تشير نتيجتان سلبيتان متتاليتان إلى فعالية أولية. ويؤكد الرصد المستمر حتى الحصول على نتيجة سلبية في اليوم 28 القضاء التام على الميكوبلازما.

س7: ما هي منتجات Solarbio التي تغطي الكشف عن الميكوبلازما ومكافحتها؟

A7: توفر شركة Solarbio منتجات CA1080 وCA1081 وCA1082 للكشف، وCA1090 وCA1093 للإزالة، وCA1091 للتنظيف البيئي، وCA1101 للوقاية.