細胞培養におけるマイコプラズマの検出、除去、および予防方法

マイコプラズマは、細胞培養において長期間潜伏する可能性のある問題の一つです。培地は透明に見えるかもしれませんし、細胞も付着したままかもしれません。最初は深刻な問題は何もないように見えるでしょう。

そして、奇妙な結果が起こり始める。

細胞の増殖速度が以前より遅くなる。明確な理由もなく、トランスフェクション効率が低下する。培地が通常より早く黄色に変色する。一部の細胞は不均一な集団を形成し、他の細胞は剥離する。同じプロトコルで実施した2回の実験で、同じ結果が得られなくなる。

その時点ですでにマイコプラズマ汚染が培養に影響を与えている可能性がある。

これらの微生物は大きさがわずか50～300nm程度であるため、一般的な細菌を捕捉するために使用される一部のフィルターを通過できます。また、マイコプラズマは細胞壁を持たないため、通常のペニシリン・ストレプトマイシン併用療法では確実な予防効果は得られません。

効果的な管理計画には3つの要素が必要です。検査室は汚染を早期に検出し、感染した培養物を迅速に処理し、同じ問題が再発する可能性を低減する必要があります。蛍光ベースのスクリーニングを使用する検査室では、完全なキットを使用することで、染色、固定、マウント、顕微鏡観察の準備を簡素化できます。より広範な汚染管理プロセスを構築する研究者は、利用可能な資料も参照できます。 細胞培養溶液 日々の業務を計画する際。

マイコプラズマはなぜ見落とされやすいのか？

文化は依然として普通に見えるかもしれない

重度の汚染は気づきやすい。細胞が顆粒状になったり、斑点状に増殖したり、フラスコから剥離したり、正常な分裂を停止したりする可能性がある。

低レベルの汚染は、はるかに目立ちにくい。細胞は代謝や遺伝子発現の変化を受けながらも増殖を続ける可能性がある。マイコプラズマは培養培地から栄養素を利用し、アミノ酸代謝、ヌクレオチド合成、DNA複製、RNA産生、タンパク質発現を阻害する可能性がある。

オペレーターがトランスフェクションのパラメーターを継続的に調整したり、血清を切り替えたり、アッセイを繰り返したりしているにもかかわらず、実際には問題が細胞ストックにあることに気づかない場合、研究室では大きなフラストレーションが生じる可能性があります。

プロジェクトによっては、他のプロジェクトよりも影響を受けやすいものがあります。細胞シグナル伝達、薬剤スクリーニング、遺伝子発現、サイトカイン分析、トランスフェクション作業などはすべて影響を受ける可能性があります。これらのアプリケーションに取り組む研究者は、関連する情報も確認する必要があります。 細胞生物学経路 実験結果に予期せぬ変化が見られた場合、それを検討する際に。

日常的な抗生物質投与は問題を隠蔽する可能性がある

多くの研究室では、標準的な習慣として培地にペニシリンとストレプトマイシンを添加している。これらの抗生物質は一般的な細菌の増殖を抑制するのに役立つが、マイコプラズマの予防策として用いるべきではない。

マイコプラズマは細胞壁を持たない。そのため、細胞壁形成に作用する抗生物質はほとんど効果がない。汚染が続いている間も、培養液は透明なままである可​​能性がある。

抗生物質を長期にわたって使用すると、状況を把握しにくくなる場合もあります。抗生物質はマイコプラズマを除去することなく他の細菌の増殖を抑制する可能性があり、その結果、見た目はきれいでも、信頼性の高い実験には適さない培養物になってしまうことがあります。

細胞培養におけるマイコプラズマはどこから来るのか？

人々は共通の源である

驚くほど多くの汚染は、ごく普通の取り扱いから始まる。

マイコプラズマは唾液や呼吸器飛沫によって運ばれる可能性があります。開いたフラスコの上で話したり、手袋をしたまま電話を触ったり、ドアとバイオセーフティキャビネットの間を移動したり、同じ手袋を長時間つけっぱなしにしたりすると、作業エリアに汚染物質を持ち込む可能性があります。

手袋にスプレーをしても、接触したすべての表面が消えるわけではありません。手袋が椅子、ノートパソコン、ドアノブ、または電話に触れた場合は、交換する方が通常は安全です。

培地のこぼれもよくある原因の一つです。キャビネット内で培地が少し飛び散ると、ピペット、ボトル、ラック、近くの培養容器などに液滴が広がる可能性があります。こぼれた場合は、セッション終了まで放置せず、すぐに清掃する必要があります。

新しい細胞は汚染された状態で到着する可能性がある

他の研究室から受け取った細胞は、直接メインの培養室に入れてはいけません。細胞株は見た目には健康そうに見えても、マイコプラズマを保有している可能性があります。

一次組織は動物やヒト由来の物質から直接採取されるため、リスクも高くなります。たとえ入念なサンプリングを行ったとしても、あらゆる汚染源を完全に除去することはできません。

新しい細胞は個別に培養し、検査を行い、陰性結果が確認されるまで隔離保管する必要があります。その後、清潔な細胞株を冷凍保存して後日使用できます。

試薬の共有は汚染を急速に拡散させる

汚染された培地、PBS、トリプシン、または血清のボトルは、複数の細胞株に影響を与える可能性があります。ピペット、吸引チューブ、およびウォーターバスの共有についても同様です。

最も安全な習慣はシンプルです。一度に扱う細胞株は1種類だけにしましょう。試薬は少量ずつ分注してください。隔離用試薬は、日常的な培養用試薬とは分けて保管してください。同じボトルを異なる作業エリア間で持ち運ぶことは避けてください。

マイコプラズマ検出方法のうち、どれが最も効果的ですか？

PCRおよびqPCRは日常的なスクリーニングに実用的である

PCR検査は、数時間以内に明確な結果が得られるため、広く用いられている。この方法は通常、16S rRNA遺伝子に関連する領域を含む、保存されたマイコプラズマDNA配列を検出する。

これは、新規細胞のスクリーニング、定期的な細胞バンクのチェック、トラブルシューティング、血清または培地の評価、および出版前の品質管理に適しています。

Solarbioは、細胞培養作業用のマイコプラズマ検出製品を複数提供しています。これらには以下が含まれます。 CA1081 マイコプラズマ検査キット（PCR法） 和 CA1082 マイコプラズマ迅速検査キット（細胞培養用）.

ヘキスト染色法は迅速な検査に役立ちます

ヘキスト蛍光染色法は安価で、適切な蛍光顕微鏡以外に複雑な装置を必要としません。蛍光ベースのスクリーニングでは、 CA1080 マイコプラズマ検出キット 細胞培養における顕微鏡を用いたマイコプラズマ検査用に設計されています。

このキットには、染色、固定、スライド作製に必要なHoechst 33258作業溶液、固定液、および退色防止封入剤が含まれています。

陰性ベロ細胞サンプルでは、​​ヘキスト蛍光は主に核内に限定され、核の外側には多数の微細な蛍光ドットは見られない。

汚染が存在する場合、細胞表面周辺または細胞間に小さな蛍光斑点が現れることがある。

このテストは、授業での使用、簡単な確認、およびテスト予算が限られている研究室で役立ちます。

しかし、限界もあります。細胞破片、アポトーシス小体、およびバックグラウンド蛍光は、マイコプラズマと類似している場合があります。染色結果が疑わしい場合は、PCR検査で確認する必要があります。

培養検査には時間がかかる

培養検査は、規制対象となる環境や製品出荷プロセスにおいて依然として重要である。検体を適切な培養培地に置き、マイコプラズマの増殖をモニタリングする。

主な問題はスピードです。結果が出るまでに7日から21日かかる場合があります。細胞バッチが使用可能かどうかを迅速に判断する必要がある場合、これは実用的ではありません。

マイコプラズマの種類によっては培養が難しいものもあるため、培養方法は適切な培地と熟練した操作者に依存する。

発光検査は迅速な結果をもたらす

迅速発光アッセイは、生存可能なマイコプラズマに関連する酵素活性または代謝シグナルを検出する。短時間で多数のサンプルをスクリーニングする必要がある場合に有用である。

検査室には互換性のある機器が必要であり、バックグラウンド干渉を慎重に確認する必要があります。リスクの高い作業では、迅速な結果が得られた場合でも、PCR検査や培養検査による確認が必要となる場合があります。

どの方法が細胞の種類や検査スケジュールに適しているか分からないチームは、Solarbioの 技術サービス 製品およびワークフローのサポートに関するリソース。

汚染された細胞株は処理すべきか？

捨て去るべき文化もある

治療は必ずしも正しい選択とは限らない。

細胞株の交換が容易な場合、汚染がひどい場合、または既に清浄な冷凍保存株として保管されている場合は、廃棄する方が通常は安全です。ひどく汚染された培養株を研究室に保管しておくと、近くにあるすべての細胞株にリスクが生じます。

細胞が希少である場合、遺伝子編集されている場合、長期間にわたって選抜された場合、限られた一次組織から得られた場合、または再入手が困難な場合、救済はより合理的である。

治療を開始する前に、感染した培養物を隔離する必要があります。インキュベーター、キャビネット、吸引システム、ピペット、ウォーターバス、および周囲の表面も洗浄する必要があります。作業エリアが汚染されたままでは、細胞だけを治療しても効果はほとんどありません。

自家製抗生物質治療は制御が難しい

マクロライド系、テトラサイクリン系、キノロン系、および関連化合物は、一部のマイコプラズマ種に対して効果を発揮する可能性がある。難しいのは、細胞を死滅させることなく病原体を除去する濃度を見つけることである。

ある細胞株が耐えられる用量でも、別の細胞株の増殖を阻害する可能性がある。感受性の高い初代培養細胞は特に扱いが難しい。

低用量では汚染を抑制するにとどまる可能性があります。治療中は培養検査で陰性となる場合でも、後日再び陽性となることがあります。そのため、自家製抗生物質治療は、全菌株ではなく、少量の耐性試験から始めるべきです。

市販の除去剤の方が使いやすい

市販のマイコプラズマ除去試薬を使用することで、検査室は複数の抗生物質を調製したり、様々な濃度の試薬を一から試験したりする手間を省くことができる。

Solarbioの CA1090 マイコプラズマスカベンジャー 和 CA1093 マイコプラズマ除去試薬 これらの薬剤は、汚染された細胞培養工程向けに設計されています。細胞の種類や汚染レベルによっては、処理を複数回の継代にわたって継続することがよくあります。

細胞は、除去試薬がまだ存在する状態で検査してはいけません。処理後、試薬を含まない培地で回復期間を設ける必要があります。その後、検査を再度行う必要があります。さらに培養して2回目の陰性結果が得られれば、より信頼性の高い結果が得られます。

マイコプラズマ汚染はどのように予防できますか？

日常使用前に細胞を隔離する

入荷する細胞株はすべて記録されるべきである。記録には、供給元、到着日、継代番号、試験結果、担当者、保管場所を記載する必要がある。

培養物は検査が完了するまで隔離しておく必要があります。陰性結果が出たら、クリーンなマスターストックを冷凍保存してください。そうすれば、数ヶ月間経過した古い培養物ではなく、このストックから今後の作業を開始できます。

共有機器は定期的に清掃してください。

バイオセーフティキャビネットは、使用前後に清掃する必要があります。インキュベーターの給水トレイは定期的に空にして消毒してください。ウォーターバス、遠心分離機のキャリア、顕微鏡のステージ、吸引ボトル、ピペットなども同様に注意が必要です。

Solarbio CA1091 マイコプラズマ除去スプレーは、環境洗浄プロセスの一部として使用できます。CA1101 マイコプラズマ予防試薬は、細胞培養の予防用途に使用できます。研究室では、 製品アップデート 汚染防止資材を見直す際。

適切なタイミングで細胞を検査する

活発な細胞培養ラボにとって、年に一度の検査では不十分である。

細胞は、到着時、マスターストックを凍結する前、重要なストックを解凍した後、長期実験を行う前、他の研究室と細胞を共有する前、および異常な増殖が見られた場合はいつでも検査する必要があります。

多くの研究室にとって、3ヶ月ごとの検査間隔は妥当な出発点となる。ハイスループット施設や、外部から定期的に細胞株を受け取る研究室では、より頻繁な検査が必要となる場合がある。

検査そのものと同じくらい、適切な記録が重要です。すべての細胞株に明確な履歴があれば、汚染がどこから始まったのか、どの培養株が汚染に曝された可能性があるのか​​を追跡することがはるかに容易になります。

ソレボ 細胞生物学、分子生物学、免疫学、生化学、染色、分析標準、および低分子研究用製品を提供しています。同社の経営管理システムは、ISO 9001、ISO 13485、ISO 14001、およびISO 45001に準拠しています。

結論

マイコプラズマ対策には複雑なシステムは必要ないが、定期的な対策は必要だ。

新しい細胞は、メインラボに入れる前に必ず検査してください。異なる細胞株や試薬は分けて保管してください。共有機器は定期的に洗浄してください。培養状態が良好なうちに、清潔なマスターストックを凍結保存してください。

汚染が確認された場合は、まず細胞を分離してください。可能な場合は培養液を交換してください。細胞が貴重な場合は、制御された除去プロセスを用いて、処理試薬を除去した後の結果を確認してください。

重要なのは、培地の色が変わったり、細胞がフラスコから剥がれ落ち始めたりするまで待たないことです。その頃には、実験データにすでに影響が出ている可能性があるからです。

適切な検出、除去、または予防製品の選択については、 Solarbioチームにお問い合わせください.

FAQ

Q1：ペニシリン・ストレプトマイシンはマイコプラズマ汚染を予防できますか？

A1：いいえ。ペニシリン・ストレプトマイシンは、マイコプラズマが多くの標準的な抗生物質が標的とする正常な細胞壁構造を欠いているため、確実な予防効果を発揮しません。

Q2：細胞培養物中のマイコプラズマ検査はどのくらいの頻度で行うべきですか？

A2：多くの研究室では3ヶ月ごとに検査を行っています。細胞が到着した時、マスターストックを凍結する前、主要な実験を行う前、異常な増殖が見られた時にも検査を行うべきです。

Q3：培地を見るだけでマイコプラズマ汚染を特定できますか？

A3：確信は持てません。初期の汚染段階では培地は透明なままかもしれません。急速な黄変、細胞増殖の遅延、形質転換効率の低下、または異常な形態は警告サインとなる可能性がありますが、適切な検査が必要です。

Q4：マイコプラズマの検出において、PCR法はヘキスト染色法よりも優れていますか？

A4：2つの方法は互いに補完し合うことができます。ヘキスト染色法は日常的なモニタリングや予備スクリーニングに適していますが、PCR法は汚染が疑われる場合の確認検査や、より高い感度が求められる状況に適しています。重要なサンプルやバイオ医薬品のロット出荷試験においては、培養法（ゴールドスタンダード）を組み合わせるか、複数の方法を用いて相互検証を行い、結果の信頼性を高めることをお勧めします。

Q5：汚染された細胞株はすべて救済すべきでしょうか？

A5：いいえ。交換可能な細胞や高度に汚染された細胞は、通常は廃棄する方が安全です。細胞救済は、主に希少細胞株、初代細胞株、選抜細胞株、または遺伝子改変細胞株に対して検討されます。

Q6：治療後、細胞を再検査すべき時期はいつですか？

A6：マイコプラズマ除去治療後、2～3回の継代培養（7～10日後）後に最初のPCR検査を実施します。2回目の検査は7日間隔で実施します。2回連続で陰性であれば、暫定的な有効性を示します。28日目に陰性となるまで継続的にモニタリングを行い、根絶を確認します。

Q7：Solarbio社の製品のうち、マイコプラズマの検出と制御に対応しているのはどれですか？

A7：Solarbio社は、検出用としてCA1080、CA1081、CA1082、除去用としてCA1090、CA1093、環境浄化用としてCA1091、予防用としてCA1101を提供しています。