細胞回収率を向上させるための適切な細胞凍結培地の選び方

細胞を固定状態で保存することは、一見するとごく簡単な実験作業のように思えます。しかし、非常に貴重な培養細胞が長期保存から回復しないとなると、非常に落胆します。解凍した細胞は、最初は一緒に解凍された培地の中で問題なく見えます。その後、細胞はゆっくりとシャーレの底に付着し、分裂を始めますが、分裂は不均一であったり、全く分裂しなかったりします。多くの人は、液体窒素タンクや細胞の解凍方法に原因があると考えがちです。しかし、多くの場合、すべての問題の原因はもっとずっと以前に潜んでいます。

凍結前の細胞の状態、凍結保護システム、DMSOへの曝露、凍結密度、そして凍結培地自体が、解凍後に何が起こるかに影響を与える。

そのため、細胞凍結培地は後回しにしてはいけません。優れた培地は、冷却中に細胞を保護しつつ、新たなストレス源を作り出す必要があります。Solarbioは、幅広いネットワークを通じて細胞生物学試薬および関連培養製品を提供しています。 Solarbio製品シリーズこれには、一般的な細胞株、感受性の高い細胞、免疫細胞、幹細胞、その他の研究モデル向けのさまざまな凍結保存製剤が含まれます。

細胞凍結培地がそれほど重要な理由とは？

凍結による損傷は、細胞が液体窒素に到達する前に始まる。

細胞は単に冷えるだけで損傷するわけではない。大きな問題は氷の形成である。

結晶は細胞内および細胞間隙に形成されることがあります。これらは細胞膜や細胞内部構造に深刻な損傷を与える可能性があります。冷却中、細胞は浸透圧ストレスを受けます。水が細胞内外を移動するため、周囲の細胞外液の濃度がますます高くなります。

凍結保存培地は、これらのストレスを軽減するように設計されています。これにより、細胞が凍結と解凍の両方で生存する可能性が高まります。

凍結プロセス全体をより詳しく知りたい研究者は、以下の記事も読むことができます。 細胞凍結保存ガイド：細胞を凍結し、バックアップ培養を安全に保つ方法これには、細胞の状態、凍結密度、冷却、保管、および解凍後の回復が含まれます。

DMSOは有用だが、取り扱いには注意が必要だ。

DMSOは、細胞培養において最も一般的な凍結保護剤の一つである。 Solarbio DMSO（ジメチルスルホキシド）（細胞培養グレード） DMSOは細胞培養によく用いられ、細胞内に入り込むことで冷却時の氷の形成による損傷を軽減する。そのため、多くの古典的な凍結保存液にはDMSOが含まれている。

利点と問題点が同時に存在する。DMSOは低温下では細胞を保護できるが、室温で長時間放置すると細胞生存率が低下する可能性がある。DMSOを含む凍結保存液を細胞懸濁液と混合したら、その後の取り扱いは不必要に長引かせないようにすべきである。

すぐに使えるルーチン処方をご希望の場合は、 Solarbio凍結保存培地 一般的な哺乳類細胞バンクの手順の構成要素として使用できる。

血清含有凍結保存液と血清不含凍結保存液、どちらを選ぶべきか？

美容液配合の処方は馴染み深いが、その定義は曖昧だ

血清を含む凍結保存液は依然として広く用いられている。血清とDMSOの組み合わせは、多くの確立された哺乳類細胞株で有効であり、長年にわたり研究室で使用されてきた。

このシステムの主な欠点は、バッチごとのばらつきが大きいことである。

血清には、タンパク質、ホルモン、成長因子、脂質、その他多くの生物学的成分が含まれています。これらの成分の濃度は、供給元やロットによって異なる場合があります。あるロットの血清で良好な回復を示した細胞株でも、検査室が別のロットの血清に変更すると、異なる挙動を示す可能性があります。

動物由来の成分を一切使用したくないプロジェクトも存在する。幹細胞研究、細胞療法関連の研究、繊細な免疫細胞研究、そしてより厳密に管理された培養システムなどは、より厳密な凍結環境によって恩恵を受けることが多い。

血清を含まない培地を使用することで、システムの制御が容易になります。

血清を含まない凍結​​保存培地を使用することで、血清に起因するばらつきがプロセスから排除されます。これにより、異なるバッチや作業者間で細胞バンクのプロトコルを標準化することが容易になります。

また、時間の節約にもなります。細胞を凍結するたびに血清とDMSOの混合液を調製する必要がなくなるからです。すぐに使える培地を使用することで、忙しい培養作業中に起こりがちな小さな調製ミスを減らすことができます。

血清を除去しつつも製剤中にDMSOを残しておきたい研究者向けに、 無血清細胞凍結保存培地（フェノールレッド含有） 視覚的に確認できるpH指示薬を備えた、明確なオプションを提供します。

この種の製剤は、血清濃度の変動が懸念されるものの、DMSOによる凍結保護が許容されるような、日常的な細胞培養に適している。

凍結保存培地においてフェノールレッドは重要な役割を果たすのか？

フェノールレッドは日常的な取り扱いに役立つ

フェノールレッドは、細胞培養培地を扱う人なら誰でも知っている色です。培地環境の変化を素早く視覚的に知らせてくれます。

基本的な冷凍・解凍作業においては、これは便利な方法となり得る。適切なpH管理に取って代わるものではないが、日常的な取り扱い作業において、作業者に即座に視覚的な参考情報を提供する。

下流の検出が背景色に敏感な場合、選択肢は変わってきます。

フェノールレッドを含まない処方の方が、一部の検出作業に適している

回収した細胞を蛍光イメージング、色に基づく測定、またはバックグラウンド干渉が問題となるその他のアッセイに使用する場合は、フェノールレッドを含まないシステムが好ましい場合がある。

ソレボ 血清不含細胞凍結保存液（フェノールレッド不使用） このシステムは、凍結システムを血清フリーに保ちながら、このような要件を満たすように設計されています。

重要なのは、フェノールレッドを使うか使わないかという選択を、どちらかがより高度な方法に聞こえるからという理由で決めないことです。解凍後の作業内容に合わせて選択してください。標準的な細胞増殖実験と高感度な光学アッセイでは、必ずしも同じ培地組成が必要なわけではありません。

DMSOフリーの細胞凍結保存はどのような場合に有効なのか？

細胞の種類やワークフローによっては、異なる凍結保護システムが必要となる場合がある。

DMSOは広く使われているが、だからといって全ての細胞モデルで自動的に使用すべきというわけではない。

DMSOに曝露された後の回復が不十分な感受性の高い細胞も存在する。また、研究者たちは、下流の培養系に持ち込まれる残留DMSOの量を減らしたいと考えている。これは、幹細胞研究、免疫細胞応用、あるいは単に生存細胞数を数えることよりも解凍後の細胞機能が重要な研究において、特に重要となる。

DMSOフリー培地は、標準的なDMSOシステムに頼るのではなく、別の保護剤を使用します。「DMSOフリー」だからといって必ずしも「すべての細胞にとってより良い」とは限らないため、最終的な選択は実際の細胞種でテストする必要があります。

DMSOの回避が真の要件となる幹細胞ワークフローでは、 幹細胞凍結保存培地（DMSO不含） これは、より大規模な細胞バンクを準備する前に、小規模な回収試験を通じて評価できる選択肢の一つです。

感受性細胞は、単一の数値ではなく、回復の質によって評価されるべきである。

解凍後の生存率は有用だが、それだけがすべてではない。

細胞集団は解凍直後には高い生存率を示すものの、その後2日間は増殖が不良となる場合がある。幹細胞は生存するものの、その後の分化に必要な特性を失ってしまうことがある。免疫細胞は生存していても、機能的な反応が弱まることがある。

そのため、細胞の形態、付着または浮遊挙動、増殖、およびプロジェクトで使用される主要な機能マーカーを通して、回復状況を確認する必要がある。

細胞の同一性や継代履歴も重要である。以前に発表された 細胞株：信頼性の高いin vitro研究への第一歩 初期の種苗、継代管理、細胞の同一性、およびマイコプラズマの状態が、再現性のある試験管内実験と密接に関連している理由を説明する。

様々な細胞に適した凍結保存培地はどのように選べばよいのでしょうか？

日常的な細胞株には、通常、簡便性と再現性が求められる。

A549、CHO、Jurkatなど、研究で頻繁に使用される最も一般的な細胞株の場合、主な要件は細胞の回収と凍結プロセスの簡便性である。

複数の作業者が同じ細胞バンクを共有する場合、すぐに使用できる培地は理にかなっています。全員が同じ手順に従うため、凍結溶液をその日に誰が調製したかによって結果が大きく左右されることが少なくなります。

細胞の初期状態は依然として重要です。健康な対数増殖期の細胞は、過剰増殖した細胞、汚染された細胞、または強いストレスを受けた細胞よりも凍結保存に適しています。優れた培地を用いても、初期培養の状態が悪い細胞を修復することはできません。

幹細胞と免疫細胞にもっと注目する必要がある

iPSC、その他の幹細胞、PBMC、NK細胞、αβ-T細胞、γδ-T細胞、および関連する免疫細胞モデルは、多くの場合、許容範囲が狭い。

問題は細胞が生存するかどうかだけではない。研究者は、幹細胞性、分化能、表面マーカー、サイトカイン応答、増殖能力、その他の機能特性を維持する必要があるかもしれない。

そこで、細胞の種類や用途に応じた凍結保存培地が役立ちます。Solarbio社は、一般的な細胞凍結保存、無血清細胞凍結保存、DMSO含有細胞凍結保存、DMSOフリー細胞凍結保存、および特殊な細胞凍結保存のニーズに対応する、さまざまな製剤を提供しています。

モデルが特殊であったり、複数の処方が有効である可能性がある場合、大規模な細胞バンクがすでに凍結された後に問題を発見するよりも、小規模な比較の方が安価です。研究者は、 Solarbioの技術サービス 特定の細胞モデルに適合する凍結保存システムの選定およびアプリケーションサポートに関して。

結論

優れた細胞凍結保存培地は、細胞を保存中に生存させるだけでなく、次の実験のための利用可能な出発点を維持するのにも役立ちます。

血清含有培地は、多くの一般的な細胞株において依然として実用的です。無血清培地は、血清によるばらつきを低減し、調製をより均一にします。フェノールレッド不使用製品は、背景色が不要なワークフローに適しています。DMSO不使用製剤は、感受性の高い細胞や、DMSOへの曝露を低減する必要があるプロジェクトにおいて、研究室に新たな選択肢を提供します。

すべての細胞にとって最適な凍結保存液は存在しない。

細胞の種類と、その後の実験内容から始めましょう。凍結前に培養液の状態を確認してください。DMSOが存在する場合は、DMSOへの曝露量を管理してください。そして、解凍後の結果を、即時の生存率だけでなく、より詳細な情報に基づいて判断してください。

適切な培地と適切な細胞処理を組み合わせることで、冷凍保存された細胞は本来の目的、つまり不確実性の新たな源ではなく、信頼できるバックアップとして機能するようになる。

FAQ

Q1：細胞凍結保存液の主な目的は何ですか？

A1：細胞凍結培地は、冷却および冷凍保存中に細胞を氷結晶の形成、浸透圧ストレス、その他の損傷から保護します。その目的は、解凍後の生存率と機能回復を向上させることです。

Q2：血清を含まない細胞凍結保存培地は、血清を含む培地よりも優れていますか？

A2：必ずしもそうとは限りません。無血清培地はより明確な組成を提供し、血清のロット間のばらつきを低減します。血清含有培地も、多くの一般的な細胞株では問題なく使用できます。最適な選択は、細胞モデルと必要な下流アプリケーションによって異なります。

Q3：細胞の凍結保存にDMSOが使用されるのはなぜですか？

A3：DMSOは凍結保護剤として作用します。細胞内に入り込み、冷却中に細胞に損傷を与える氷結晶の形成を抑制するのに役立ちます。DMSOは高温下で長時間曝露されると細胞の生存率にも影響を与える可能性があるため、添加後は細胞の取り扱いを効率的に行う必要があります。

Q4：DMSOを含まない凍結​​保存液を検討すべきなのはどのような場合ですか？

A4：DMSOを含まない製剤は、DMSOに敏感な細胞、幹細胞研究、免疫細胞のワークフロー、または残留DMSOが後続のアプリケーションに影響を与える可能性のある実験に有用である可能性があります。ただし、回収率は実際の細胞タイプで検証する必要があります。

Q5：フェノールレッドは細胞の凍結に影響を与えますか？

A5：フェノールレッドは主にpH指示薬であり、主要な凍結保護成分ではありません。回収した細胞を色感応性または蛍光ベースのアッセイに使用する場合は、フェノールレッドを含まない製剤の方が望ましい場合があります。

Q6：iPSC、PBMC、NK細胞、および一般的な細胞株に対して、同じ凍結保存培地を使用できますか？

A6：一般的な製剤は複数の細胞種に有効な場合もありますが、感受性の高い細胞にはより特異的な条件が必要となる場合が多いです。iPSC、PBMC、NK細胞、T細胞、その他の特殊な細胞モデルについては、大規模な細胞バンクを準備する前に、解凍後の生存率と機能性を試験する必要があります。

Q7：良質な凍結保存液を使用した場合でも、細胞の回復が不十分なのはなぜですか？

A7：問題は凍結前に発生する可能性があります。細胞の過密、汚染、凍結前の生存率の低さ、過剰な消化、不適切な細胞密度、DMSOへの長時間の曝露、冷却制御の不備、または不適切な解凍はすべて回収率を低下させる可能性があります。

Q8：細胞を解凍した後、何をチェックすべきですか？

A8：細胞の生存率、形態、付着または浮遊状態、増殖、および重要な機能マーカーを直ちに確認してください。感受性の高い細胞の場合、真の回復状態が明らかになるまでに24～72時間かかる場合があります。