세포 배양에서 마이코플라스마를 검출, 제거 및 예방하는 방법

마이코플라스마는 세포 배양에서 흔히 발생하는 문제 중 하나로, 오랫동안 잠복해 있다가 서서히 진행될 수 있습니다. 배양액은 여전히 ​​맑아 보이고, 세포들은 여전히 ​​붙어 있을 수 있습니다. 처음에는 심각한 문제가 없어 보일 수 있습니다.

그러자 이상한 결과가 나타나기 시작합니다.

세포 성장 속도가 이전보다 느려졌다. 명확한 이유 없이 형질전환 효율이 떨어졌다. 배양액이 평소보다 빨리 노랗게 변했다. 일부 세포는 불규칙적으로 모여 군집을 이루는 반면, 다른 세포들은 떨어져 나갔다. 동일한 프로토콜로 수행한 두 실험에서 더 이상 같은 결과가 나오지 않았다.

그 시점에는 이미 마이코플라스마 오염이 배양액에 영향을 미치고 있을 수 있습니다.

이 미생물들은 크기가 약 50~300나노미터에 불과하여 일반적인 박테리아를 걸러내는 데 사용되는 일부 필터를 통과할 수 있습니다. 또한 마이코플라스마는 세포벽이 없기 때문에 일반적인 페니실린-스트렙토마이신 치료로는 확실한 예방 효과를 얻을 수 없습니다.

효과적인 오염 관리 계획은 세 가지 요소로 구성됩니다. 실험실은 오염을 조기에 감지하고, 감염된 배양액을 신속하게 처리하며, 동일한 문제가 재발할 가능성을 줄여야 합니다. 형광 기반 스크리닝을 사용하는 실험실의 경우, 완벽한 키트를 사용하면 염색, 고정, 마운팅 및 현미경 준비 과정을 간소화할 수 있습니다. 보다 포괄적인 오염 관리 프로세스를 구축하려는 연구자들은 시판 중인 제품들을 검토해 볼 수도 있습니다. 세포 배양 용액 일상적인 절차를 계획할 때.

마이코플라스마 감염을 놓치기 쉬운 이유는 무엇일까요?

문화는 여전히 정상적으로 보일 수 있습니다

심각한 오염은 더 쉽게 알아차릴 수 있습니다. 세포가 과립형으로 변하거나, 부분적으로 증식하거나, 플라스크에서 떨어져 나가거나, 정상적인 분열을 멈출 수 있습니다.

저농도 오염은 훨씬 덜 명확합니다. 세포는 대사 및 유전자 발현 변화를 겪으면서 계속 증식할 수 있습니다. 마이코플라스마는 배양 배지에서 영양분을 이용하며 아미노산 대사, 뉴클레오티드 합성, DNA 복제, RNA 생성 및 단백질 발현을 방해할 수 있습니다.

이는 실험실에서 작업자가 형질전환을 위한 매개변수를 지속적으로 조정하거나 혈청을 바꾸거나 분석을 반복하면서 실제 문제가 세포 재고에 있다는 사실을 깨닫지 못하는 경우 큰 좌절감을 초래할 수 있습니다.

일부 프로젝트는 다른 프로젝트보다 더 민감합니다. 세포 신호 전달, 약물 스크리닝, 유전자 발현, 사이토카인 분석 및 형질전환 작업 모두 영향을 받을 수 있습니다. 이러한 응용 분야를 연구하는 연구자들은 관련 사항도 확인해야 합니다. 세포생물학적 경로 실험 결과에서 예상치 못한 변화를 검토할 때.

일상적인 항생제 사용은 문제를 가릴 수 있습니다.

많은 연구실에서는 관례적으로 배지에 페니실린과 스트렙토마이신을 첨가합니다. 이러한 항생제는 일부 일반적인 박테리아를 억제하는 데 도움이 되지만, 마이코플라스마 예방 시스템으로 간주해서는 안 됩니다.

마이코플라스마는 세포벽이 없습니다. 따라서 세포벽 형성에 작용하는 항생제는 마이코플라스마에 거의 효과가 없습니다. 배양액은 깨끗하게 나올 수 있지만 오염은 계속될 수 있습니다.

장기간 항생제를 사용하면 상황을 알아차리기가 더 어려워질 수도 있습니다. 항생제가 마이코플라스마를 제거하지 않고 다른 박테리아만 억제하여, 겉보기에는 깨끗해 보이지만 신뢰할 수 있는 실험에 적합하지 않은 배양액을 얻게 될 수 있습니다.

세포 배양 마이코플라스마는 어디에서 오는가?

사람들은 공통의 정보원입니다.

생각보다 많은 오염은 일상적인 취급 과정에서 시작됩니다.

마이코플라스마는 타액과 호흡기 비말을 통해 전파될 수 있습니다. 열린 플라스크 위에서 대화를 나누거나, 장갑을 착용한 채 전화기를 만지거나, 문과 생물안전 캐비닛 사이를 이동하거나, 같은 장갑을 너무 오래 착용하는 경우 작업 공간에 오염 물질이 유입될 수 있습니다.

장갑에 소독 스프레이를 뿌린다고 해서 모든 표면 접촉이 사라지는 것은 아닙니다. 장갑이 의자, 노트북, 문 손잡이 또는 휴대폰에 닿은 후에는 새 장갑으로 교체하는 것이 일반적으로 더 안전합니다.

배양액이 쏟아지는 것도 흔한 원인 중 하나입니다. 캐비닛 안에서 작은 물방울이라도 피펫, 병, 랙, 그리고 주변 배양 용기에 묻을 수 있습니다. 따라서 실험이 끝날 때까지 미루지 말고 즉시 청소해야 합니다.

새로운 세포는 오염된 상태로 도착할 수 있습니다.

다른 연구실에서 받은 세포는 주 배양실에 바로 넣어서는 안 됩니다. 세포주는 겉보기에는 건강해 보여도 마이코플라스마를 보유하고 있을 수 있습니다.

일차 조직은 동물이나 인간의 물질에서 직접 추출되기 때문에 더 높은 위험성을 내포하고 있습니다. 아무리 신중한 샘플링을 하더라도 모든 오염원을 완전히 제거할 수는 없습니다.

새로운 세포는 별도로 배양하고 검사한 후 음성 결과가 확인될 때까지 격리 보관해야 합니다. 그런 다음 깨끗한 세포를 냉동 보관하여 나중에 사용할 수 있습니다.

공용 시약은 오염을 빠르게 확산시킵니다.

오염된 배지, PBS, 트립신 또는 혈청 병은 하나 이상의 세포주에 영향을 미칠 수 있습니다. 마찬가지로 피펫, 흡입 튜브 및 항온조를 함께 사용하는 경우에도 문제가 발생할 수 있습니다.

가장 안전한 습관은 간단합니다. 한 번에 하나의 세포주만 다루십시오. 시약은 소량씩 사용하십시오. 격리 시약은 일반 배양 시약과 분리하여 보관하십시오. 같은 시약병을 여러 작업 공간으로 옮기지 마십시오.

어떤 마이코플라스마 검출 방법이 가장 효과적일까요?

PCR 및 qPCR은 일상적인 선별 검사에 실용적입니다.

PCR 기반 검사는 몇 시간 내에 명확한 결과를 얻을 수 있기 때문에 널리 사용됩니다. 이 방법은 일반적으로 16S rRNA 유전자와 관련된 영역을 포함하여 마이코플라스마 DNA의 보존된 서열을 검출합니다.

이 방법은 새로운 세포 선별, 정기적인 세포 은행 점검, 문제 해결, 혈청 또는 배지 평가, 그리고 논문 발표 전 품질 관리 등에 적합합니다.

Solarbio는 세포 배양 작업에 사용되는 여러 마이코플라스마 검출 제품을 공급합니다. 이러한 제품에는 다음이 포함됩니다. CA1081 마이코플라스마 검사 키트(PCR 방식) 그리고 CA1082 마이코플라스마 신속 진단 키트(세포 배양용).

회히스트 염색은 빠른 확인에 유용합니다.

회히스트 형광 염색은 저렴하고 적절한 형광 현미경 외에는 복잡한 장비가 필요하지 않습니다. 형광 기반 스크리닝의 경우, CA1080 마이코플라스마 검출 키트 이 시스템은 세포 배양에서 현미경을 이용한 마이코플라스마 검사를 위해 설계되었습니다.

이 키트에는 염색, 고정 및 슬라이드 제작을 위한 Hoechst 33258 작업 용액, 고정 용액 및 퇴색 방지 마운팅 용액이 포함되어 있습니다.

음성 베로 세포 샘플에서 회히스트 형광은 주로 핵에 국한되며, 핵 바깥쪽에는 수많은 미세한 형광점이 관찰되지 않습니다.

오염 물질이 존재할 경우, 세포 표면 주변이나 세포 사이에 작은 형광점이 나타날 수 있습니다.

이 테스트는 수업 활동, 빠른 확인, 그리고 테스트 예산이 제한적인 실험실에서 유용합니다.

하지만 한계도 있습니다. 세포 파편, 세포 사멸체, 배경 형광 등이 마이코플라스마와 유사하게 보일 수 있습니다. 염색 결과가 불확실한 경우 PCR 검사를 통해 확인해야 합니다.

배양 검사에는 더 많은 시간이 소요됩니다.

배양 기반 검사는 일부 규제 환경 및 제품 출시 절차에서 여전히 중요합니다. 검체를 적절한 배양 배지에 접종하고 마이코플라스마 증식 여부를 모니터링합니다.

가장 큰 문제는 속도입니다. 결과가 나오기까지 7일에서 21일이 걸릴 수 있습니다. 이는 실험실에서 세포 배치 사용 여부를 신속하게 결정해야 하는 상황에서는 실용적이지 않습니다.

일부 마이코플라스마 종은 다른 종보다 배양하기가 더 어렵기 때문에, 이 방법은 적절한 배지와 숙련된 작업자에 따라 달라집니다.

발광 테스트는 빠른 결과를 제공합니다

신속 발광 분석법은 생존 가능한 마이코플라스마와 관련된 효소 활성 또는 대사 신호를 감지합니다. 이 분석법은 짧은 시간 내에 많은 샘플을 검사해야 할 때 유용합니다.

실험실에는 호환 가능한 장비가 필요하며, 배경 간섭을 신중하게 확인해야 합니다. 위험도가 높은 작업의 경우, 신속한 결과가 나오더라도 PCR 또는 배양 검사를 통해 결과를 확인해야 할 수 있습니다.

어떤 방법이 자신의 세포 유형이나 테스트 일정에 적합한지 확신이 서지 않는 팀은 Solarbio의 서비스를 이용할 수 있습니다. 기술 서비스 제품 및 워크플로우 지원을 위한 리소스입니다.

오염된 세포주는 처리해야 할까요?

일부 문화는 버리는 것이 더 낫다.

치료가 항상 옳은 선택은 아닙니다.

세포주를 쉽게 교체할 수 있거나, 오염도가 심하거나, 이미 깨끗한 상태로 냉동 보관되어 있는 경우에는 폐기하는 것이 일반적으로 더 안전합니다. 심하게 오염된 배양액을 실험실에 보관하면 주변의 모든 세포주에 위험을 초래할 수 있습니다.

세포가 희귀하거나, 유전자 편집되었거나, 오랜 기간에 걸쳐 선별되었거나, 제한된 원발 조직에서 유래되었거나, 다시 얻기 어려운 경우라면 세포 복구가 더 합리적입니다.

감염된 배양액은 치료 시작 전에 격리해야 합니다. 배양기, 캐비닛, 흡입 시스템, 피펫, 항온수조 및 주변 표면도 세척해야 합니다. 작업 영역이 오염된 상태로 남아 있으면 세포만 치료하는 것은 큰 도움이 되지 않습니다.

자가 항생제 치료는 관리가 어렵습니다.

마크롤라이드계, 테트라사이클린계, 퀴놀론계 및 관련 화합물은 일부 마이코플라스마 종에 효과가 있을 수 있습니다. 어려운 점은 세포를 죽이지 않고 균을 제거할 수 있는 농도를 찾는 것입니다.

한 세포주가 견딜 수 있는 용량이 다른 세포주의 성장을 억제할 수도 있습니다. 특히 민감한 원발성 세포는 다루기가 매우 어렵습니다.

저용량으로는 오염만 억제할 수 있습니다. 치료 중에는 배양 검사에서 음성으로 나왔다가 나중에 다시 양성으로 바뀔 수도 있습니다. 따라서 자가 항생제 치료는 전체 세포주를 사용하는 것보다는 소량의 내성 검사부터 시작해야 합니다.

시판되는 제거 시약은 사용하기 더 쉽습니다.

시판되는 마이코플라스마 제거 시약은 실험실에서 여러 항생제를 직접 제조하고 다양한 농도를 처음부터 테스트하는 수고를 덜어줍니다.

솔라바이오의 CA1090 마이코플라스마 제거제 그리고 CA1093 마이코플라스마 제거 시약 이 처리 방법은 오염된 세포 배양 워크플로우에 사용하도록 고안되었습니다. 세포 유형 및 오염 수준에 따라 여러 계대 배양을 거치면서 처리가 계속되는 경우가 많습니다.

세포는 제거 시약이 남아 있는 동안에만 검사해서는 안 됩니다. 처리 후에는 시약이 없는 배지에서 회복 기간을 거쳐야 합니다. 그런 다음 검사를 반복해야 합니다. 추가 배양 후 두 번째 음성 결과가 나오면 더 신뢰할 수 있는 결과를 얻을 수 있습니다.

마이코플라스마 오염을 예방하는 방법은 무엇일까요?

일상적인 사용 전에 세포를 격리하십시오.

모든 입고 세포주에는 기록이 있어야 합니다. 이 기록에는 출처, 도착 날짜, 계대 번호, 검사 결과, 담당자 및 보관 위치가 포함되어야 합니다.

배양액은 검사가 완료될 때까지 분리된 상태로 보관해야 합니다. 음성 결과가 나오면 깨끗한 마스터 스톡을 냉동 보관합니다. 그러면 수개월 동안 배양된 오래된 배양액 대신 이 마스터 스톡을 사용하여 향후 연구를 시작할 수 있습니다.

공용 장비는 정기적으로 청소하세요.

생물안전 캐비닛은 사용 전후에 청소해야 합니다. 배양기 물받이는 정기적으로 비우고 소독해야 합니다. 수조, 원심분리기 캐리어, 현미경 받침대, 흡입병, 피펫도 관리가 필요합니다.

Solarbio CA1091 마이코플라스마 제거 스프레이는 환경 세척 공정의 일부로 사용할 수 있습니다. CA1101 마이코플라스마 예방 시약은 세포 배양 시 예방적 용도로 사용 가능합니다. 실험실에서는 이를 확인할 수 있습니다. 제품 업데이트 오염 방지 자료를 검토할 때.

적절한 시기에 세포를 테스트하세요

활발한 세포 배양 연구실의 경우, 1년에 한 번 테스트하는 것으로는 충분하지 않습니다.

세포는 도착 즉시, 마스터 스톡을 냉동하기 전, 중요한 스톡을 해동한 후, 장기 실험을 시작하기 전, 다른 연구실과 세포를 공유하기 전, 그리고 비정상적인 성장이 나타날 때마다 검사해야 합니다.

3개월 간격의 검사는 많은 연구실에서 합리적인 시작점입니다. 처리량이 많은 시설이나 외부에서 세포주를 정기적으로 제공받는 연구실은 더 자주 검사해야 할 수도 있습니다.

정확한 기록은 검사 자체만큼이나 중요합니다. 모든 세포주에 명확한 이력이 있으면 오염이 어디에서 시작되었는지, 어떤 배양액이 노출되었는지 추적하기가 훨씬 쉬워집니다.

Solarbio는 세포생물학, 분자생물학, 면역학, 생화학, 염색, 분석 표준 및 소분자 연구 제품을 공급합니다. 경영 시스템은 ISO 9001, ISO 13485, ISO 14001 및 ISO 45001 인증을 획득했습니다.

결론

마이코플라스마 방제는 복잡한 시스템을 필요로 하지 않지만, 정기적인 관리가 필요합니다.

새로운 세포는 실험실 본관에 반입하기 전에 반드시 검사하십시오. 서로 다른 세포주와 시약은 분리하여 보관하십시오. 공용 장비는 정기적으로 소독하십시오. 배양액 상태가 양호할 때 깨끗한 마스터 스톡을 냉동 보관하십시오.

오염이 발견되면 먼저 세포를 격리하십시오. 가능하면 배양액을 교체하십시오. 세포가 가치 있는 경우, 통제된 제거 과정을 사용하고 처리 시약을 제거한 후 결과를 확인하십시오.

핵심은 배지의 색이 변하거나 세포가 플라스크에서 떨어져 나가기 시작할 때까지 기다리지 않는 것입니다. 그때쯤 되면 실험 데이터에 이미 영향을 미쳤을 수 있습니다.

적합한 탐지, 제거 또는 예방 제품을 선택하는 데 도움이 필요하시면, Solarbio 팀에 문의하세요..

에프AQ

Q1: 페니실린-스트렙토마이신은 마이코플라스마 감염을 예방할 수 있습니까?

A1: 아니요. 페니실린-스트렙토마이신은 마이코플라스마에 대한 확실한 보호 효과를 제공하지 못합니다. 마이코플라스마는 많은 표준 항생제가 표적으로 삼는 정상적인 세포벽 구조를 가지고 있지 않기 때문입니다.

Q2: 세포 배양액에서 마이코플라스마 검사는 얼마나 자주 실시해야 합니까?

A2: 많은 연구실에서는 3개월마다 검사를 실시합니다. 세포가 도착했을 때, 마스터 스톡을 냉동하기 전, 주요 실험을 시작하기 전, 그리고 비정상적인 성장이 나타날 때도 검사를 실시해야 합니다.

Q3: 배지를 육안으로 관찰하여 마이코플라스마 오염 여부를 확인할 수 있습니까?

A3: 확신할 수 없습니다. 초기 오염 시에는 배지가 투명한 상태를 유지할 수 있습니다. 빠른 황변, 느린 세포 성장, 불량한 형질전환 또는 비정상적인 형태는 경고 신호일 수 있지만, 적절한 검사가 여전히 필요합니다.

질문 4: 마이코플라스마 검출에 있어 PCR이 회히스트 염색법보다 더 나은가요?

A4: 두 가지 방법은 서로 보완적인 역할을 할 수 있습니다. 회히스트 염색법은 일상적인 모니터링 및 예비 스크리닝에 적합하고, PCR은 오염이 의심되는 경우 확증 검사 또는 더 높은 민감도가 요구되는 상황에 더 적합합니다. 중요 시료 또는 바이오의약품 배치 출하 검사의 경우, 결과의 신뢰성을 높이기 위해 배양 기반 방법(표준 방법)을 병용하거나 여러 방법을 교차 검증하는 것이 좋습니다.

Q5: 오염된 모든 세포주를 복구해야 할까요?

A5: 아니요. 교체 가능하거나 심하게 오염된 세포는 일반적으로 폐기하는 것이 더 안전합니다. 세포 복구는 주로 희귀 세포주, 일차 세포주, 선별된 세포주 또는 유전자 변형 세포주에 대해 고려됩니다.

Q6: 치료 후 세포를 언제 재검사해야 합니까?

A6: 마이코플라스마 제거 치료 후, 2-3회 계대배양(7-10일) 후 첫 번째 PCR 검사를 시행합니다. 두 번째 검사는 7일 간격으로 시행합니다. 두 번 연속 음성 결과가 나오면 초기 효능을 나타냅니다. 28일째에 음성 결과가 나올 때까지 지속적으로 모니터링하면 박멸이 확정됩니다.

Q7: Solarbio 제품 중 마이코플라스마 검출 및 제어에 사용되는 제품은 무엇입니까?

A7: Solarbio는 검출을 위한 CA1080, CA1081 및 CA1082, 제거를 위한 CA1090 및 CA1093, 환경 정화를 위한 CA1091, 그리고 예방을 위한 CA1101을 제공합니다.