Détection de l'IL-23 humaine par ELISA dans les surnageants de culture cellulaire, le sérum et le plasma

L'IL-23 est une cytokine fréquemment mesurée dans les études sur l'inflammation, la biologie des lymphocytes Th17, l'activation immunitaire, les maladies auto-immunes, les infections et l'immunité antitumorale. Étant un composant central de l'axe IL-23/IL-17, son dosage est souvent effectué conjointement avec celui de médiateurs apparentés tels que l'IL-17A, l'IL-22 et le GM-CSF. D'autres marqueurs de cette voie de signalisation peuvent également être analysés en fonction de la question biologique posée.

La procédure ELISA en elle-même n'est pas nécessairement complexe ; cependant, des variables pré-analytiques et biologiques peuvent fortement influencer le résultat. Le type cellulaire, les conditions de stimulation, la durée de culture, la manipulation et le stockage des échantillons, ainsi que la concentration attendue d'IL-23 peuvent tous affecter la valeur mesurée. Dans le sérum ou le plasma de donneurs sains, la concentration d'IL-23 peut être inférieure au seuil de détection du test, tandis que des cultures cellulaires produisant de l'IL-23 et correctement stimulées peuvent donner des concentrations facilement mesurables.

Les exemples suivants concernent des préparations de cellules sanguines périphériques, des cellules THP-1, des cellules Jurkat, du sérum et du plasma. Ils illustrent également un point important : l’adéquation de chaque modèle pour la mesure de l’IL-23 n’est pas équivalente, et les résultats doivent être interprétés en fonction du type cellulaire et des conditions de stimulation.

Qu'est-ce que l'IL-23 humaine ?

L'IL-23 est composée de deux sous-unités différentes.

L'IL-23 humaine appartient à la famille des cytokines IL-12. Il s'agit d'un hétérodimère et non d'une protéine à chaîne unique.

L'IL-23 est composée d'une sous-unité p19, codée par le gène IL23A, et d'une sous-unité p40, codée par le gène IL12B. Le précurseur humain de la sous-unité p19 est constitué de 189 acides aminés. La sous-unité p40 est également présente dans l'IL-12 ; les sous-unités p19 et p40 s'associent sous forme d'hétérodimère lié par des ponts disulfure pour former l'IL-23 biologiquement active.

Cette structure est importante pour la détection. Un test destiné à mesurer l'IL-23 intacte doit distinguer l'hétérodimère p19/p40 des protéines apparentées de la famille IL-12 et des sous-unités isolées, conformément à la spécificité validée du test. La spécificité d'espèce et de cible doit donc être confirmée avant le test.

Solarbio fournit des produits de détection des cytokines et autres solutions de recherche en immunologie pour les études cellulaires et les études basées sur des échantillons.

L'IL-23 contribue au maintien de la réponse Th17

L'IL-23 transmet son signal via un récepteur hétérodimérique composé d'IL-23R et d'IL-12Rβ1. Ce récepteur est exprimé sur plusieurs populations de cellules immunitaires réactives, notamment les lymphocytes T CD4+ activés et mémoires.

L'engagement du récepteur IL-23 active la voie de signalisation JAK2/TYK2 et principalement STAT3, STAT4 contribuant dans une moindre mesure selon les contextes cellulaires. Cette signalisation soutient le programme effecteur Th17, notamment l'expression de RORγt et la production d'IL-17A, d'IL-22 et de GM-CSF.

L'IL-23 est particulièrement importante pour le maintien, l'expansion et la fonction effectrice pathogène des cellules Th17, plutôt que d'être le seul initiateur de la différenciation des lymphocytes T naïfs. C'est pourquoi l'IL-23 est souvent mesurée dans les études sur l'inflammation chronique, les mécanismes auto-immuns, les infections et l'immunité antitumorale.

Les chercheurs qui étudient le réseau dans son ensemble peuvent utiliser Solarbio. section sur les voies de signalisation pour trouver des cibles et des produits de voies de signalisation apparentés.

Comment évaluer l'IL-23 dans les cultures de cellules sanguines périphériques ?

La stimulation par LPS nécessite une préparation cellulaire appropriée

Pour une expérience de production d'IL-23 induite par le LPS, l'utilisation de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) ou d'une autre préparation contenant des monocytes ou d'autres cellules présentatrices d'antigènes est plus appropriée que celle de lymphocytes du sang périphérique purifiés. L'IL-23 est principalement produite par les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques activés, et les réponses au LPS dans les préparations de cellules sanguines humaines dépendent largement des voies de détection innées du LPS. Si le matériel initial a été décrit comme « lymphocytes du sang périphérique », la méthode d'isolement et la teneur en monocytes doivent être vérifiées avant d'interpréter les résultats.

Dans le protocole expérimental décrit ici, les cellules ont été cultivées pendant 24 ou 96 heures, et le surnageant de culture a été recueilli pour le dosage de l'IL-23 humaine. Si des concentrations de LPS de 50 ng/mL et 1 μg/mL sont utilisées, elles doivent être considérées comme des conditions expérimentales spécifiques à l'étude et non comme des doses recommandées de manière universelle.

Avec deux concentrations de LPS et deux temps de prélèvement, le dispositif expérimental permet d'obtenir quatre conditions stimulées. Les comparaisons doivent être effectuées à des moments identiques et avec un témoin non stimulé pour chaque moment.

Ces résultats ne doivent pas être interprétés comme une simple comparaison entre une dose élevée et une dose faible. Au cours d'une culture de 96 heures, l'épuisement des nutriments, les variations de densité cellulaire, la mort cellulaire, les modifications de la composition cellulaire, ainsi que la dégradation ou la consommation des cytokines peuvent toutes altérer la concentration mesurée dans le surnageant.

Un témoin non stimulé doit être maintenu dans des conditions de culture identiques à chaque point de mesure. Sans ce témoin, il est impossible de distinguer avec certitude la sécrétion induite par le LPS de la sécrétion basale ou des variations temporelles au sein de la culture.

Les détails culturels doivent rester cohérents.

De petites modifications des techniques de culture peuvent entraîner des variations importantes dans les mesures de cytokines. La densité cellulaire initiale, le pourcentage de sérum, le volume total de culture, la préparation du LPS, les conditions d'incubation et la méthode de prélèvement doivent être maintenus constants entre les groupes. Pour les expériences sur les cellules sanguines primaires, l'origine du donneur et la méthode d'isolement cellulaire doivent également être consignées, car les variations de la concentration en monocytes peuvent fortement influencer la production d'IL-23 induite par le LPS.

Tous les surnageants doivent être traités de manière uniforme après leur prélèvement. Évitez de comparer un échantillon frais avec un échantillon ayant subi plusieurs cycles de congélation-décongélation.

Solarbio gamme de produits de recherche Il couvre les kits ELISA, les réactifs de culture cellulaire, les stimulants et autres produits utilisés dans les expériences sur les cellules immunitaires.

Comment fonctionne la détection de l'IL-23 dans les cellules THP-1 ?

Un modèle de cellules monocytaires avec stimulation par LPS

La lignée cellulaire de leucémie monocytaire humaine THP-1 est largement utilisée comme modèle reproductible pour l'étude de la signalisation immunitaire innée et de l'inflammation. Les cellules sanguines humaines primaires conservent leur importance biologique, mais présentent une variabilité interindividuelle et une durée de vie ex vivo limitée ; les cellules THP-1 peuvent compléter, mais ne doivent pas systématiquement remplacer, les expériences sur cellules primaires.

Dans cet exemple, les cellules THP-1 ont été cultivées dans un milieu RPMI-1640 contenant 10 % de sérum de veau fœtal. Le LPS a été ajouté à des concentrations finales de 50 ng/mL et 500 ng/mL.

Les surnageants de culture ont été collectés après 24 et 48 heures, puis testés pour l'IL-23 humaine.

Les deux concentrations de LPS ne doivent pas être automatiquement qualifiées de « modérées » et « fortes ». La réponse des cellules THP-1 au LPS dépend de l'état cellulaire, du stade de différenciation, de la densité cellulaire, des conditions sériques et de l'expression des récepteurs ; une concentration de LPS plus élevée ne produit pas nécessairement une réponse IL-23 proportionnellement plus élevée ou plus interprétable.

Les résultats obtenus avec les cellules THP-1 ne doivent pas être traités comme les résultats obtenus avec les cellules primaires.

Les cellules THP-1 et les monocytes humains primaires (PBMC) n'ont ni la même origine ni le même comportement biologique. L'expression de leurs récepteurs, leur état d'activation, leur profil de croissance et leur réponse au LPS peuvent différer.

Les résultats obtenus avec les cellules THP-1 doivent d'abord être interprétés dans le contexte du modèle THP-1. Ils ne doivent pas se substituer directement aux données issues de cellules immunitaires humaines primaires.

Lorsque le signal du test est faible, que la courbe standard semble anormale ou que les analyses répétées ne concordent pas, Solarbio équipe de service technique peut aider à revoir le choix du produit et les conditions de test de base.

Les cellules Jurkat constituent-elles un modèle approprié pour la sécrétion d'IL-23 ?

La stimulation par PMA nécessite une interprétation prudente.

Les cellules Jurkat, une lignée de leucémie à lymphocytes T humains, sont largement utilisées pour l'étude de la signalisation des lymphocytes T. Cependant, les monocytes activés, les macrophages et les cellules dendritiques constituent les principales sources cellulaires établies d'IL-23 hétérodimérique sécrétée ; les cellules Jurkat ne représentent donc pas un modèle standard de production positive d'IL-23.

Dans le protocole décrit ici, le PMA a été utilisé à des concentrations finales de 0,2 μg/mL et 10 μg/mL pendant trois ou cinq jours avant le recueil du surnageant. Ces conditions de stimulation intenses et prolongées pour les cellules Jurkat ne doivent pas être présentées comme des conditions d'induction de l'IL-23 généralement recommandées. Tout signal d'IL-23 obtenu dans ces conditions doit être interprété en tenant compte des contrôles non stimulés et des données de viabilité cellulaire.

La large gamme de concentrations et l'exposition sur plusieurs jours rendent difficile une interprétation simple de la relation dose-réponse, car les changements de viabilité, de prolifération et d'état cellulaire peuvent dominer le résultat mesuré.

La viabilité et le nombre de cellules doivent être surveillés tout au long de l'expérience, notamment à forte concentration de PMA et après une exposition prolongée. Un signal ELISA détectable ne suffit pas à établir que les cellules Jurkat constituent un modèle de production d'IL-23 physiologiquement approprié ; tout résultat positif inattendu doit être confirmé par des contrôles appropriés et, si nécessaire, par une méthode orthogonale.

Le stimulant et le type cellulaire doivent correspondre à l'objectif de l'étude.

Le LPS et le PMA ne sont pas des stimulants interchangeables. Le LPS active la voie de signalisation dépendante de TLR4 dans les cellules immunitaires innées réactives, tandis que le PMA active directement les voies dépendantes de la protéine kinase C et est couramment utilisé pour déclencher la signalisation dans plusieurs modèles cellulaires.

L'objectif de l'expérience doit déterminer le modèle cellulaire et le stimulus. Les cellules THP-1 ou les cellules primaires de la lignée monocytaire peuvent être utilisées pour étudier les réponses innées au LPS. Les cellules Jurkat traitées au PMA peuvent être utiles pour les études de signalisation des lymphocytes T, mais cela ne fait pas des cellules Jurkat un modèle validé de sécrétion d'IL-23. Le résultat du test ELISA doit être interprété en tenant compte de la biologie du modèle choisi.

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Pourquoi le sérum et le plasma normaux peuvent-ils ne présenter aucune trace détectable d'IL-23 ?

Les résultats peuvent être inférieurs au seuil de détection.

Dans ce panel d'échantillons, 20 échantillons de plasma humain normal et 20 échantillons de sérum humain normal ont été testés, et l'IL-23 était en dessous de la limite de détection du test dans tous les échantillons.

Ce résultat ne prouve pas l'absence totale d'IL-23. Il signifie simplement que, dans les conditions de dosage utilisées, la concentration d'IL-23 présente était inférieure au seuil de détection du test.

De nombreuses cytokines, dont l'IL-23, peuvent circuler à de très faibles concentrations chez les individus sains. Les concentrations mesurées peuvent également être influencées par l'état immunitaire, une inflammation ou une infection, la prise de médicaments, l'âge, la manipulation des échantillons et d'autres facteurs biologiques ou préanalytiques.

Un résultat inférieur à la limite de détection n'indique pas automatiquement un échec de l'analyse. Il convient d'examiner au préalable la courbe d'étalonnage, les performances des blancs et des contrôles, la manipulation des échantillons et le protocole d'analyse. Si les performances de l'analyse sont acceptables, le résultat doit être rapporté comme étant inférieur à la limite de détection, ou conformément aux conventions de rapportage spécifiées par le fabricant, plutôt que d'indiquer une concentration exacte.

Le sérum et le plasma sont des matrices différentes.

Le sérum et le plasma ne doivent pas être systématiquement regroupés en une seule catégorie analytique. Leurs méthodes de préparation diffèrent et des effets de matrice peuvent influencer les performances des dosages.

Le tube de prélèvement, l'anticoagulant utilisé pour le plasma, les conditions de coagulation du sérum, le délai de centrifugation, la température de conservation et le nombre de cycles de congélation-décongélation doivent tous être consignés. Ces variables revêtent une importance particulière lorsque la concentration cible se situe à la limite inférieure de la plage de mesure de l'analyse.

Quel kit ELISA IL-23 convient à l'échantillon ?

Kit ELISA IL-23 humain

Le SEKH-0034 Kit ELISA IL-23 humain peut être utilisé pour la détection quantitative de l'IL-23 humaine dans des types d'échantillons humains validés, notamment le sérum, le plasma et les surnageants de culture cellulaire, conformément aux instructions actuelles du produit.

Ce produit est pertinent pour la recherche sur l'inflammation, les études liées aux Th17, la stimulation des cellules immunitaires, les mécanismes auto-immuns, les infections et l'immunité antitumorale.

Le kit ELISA SEKH-0034 pour l'IL-23 humaine doit être utilisé avec des matrices d'échantillons validées conformément à la notice d'utilisation. Avant le test, il convient de vérifier que la concentration attendue des échantillons se situe dans la plage de mesure du test, ou qu'il est possible de l'y amener par une procédure de dilution validée.

Kits IL-23 pour autres espèces

SEKM-0024 Kit ELISA IL-23 pour souris est destiné aux échantillons de souris. Kit ELISA SEKR-0072 pour l'IL-23 chez le rat est utilisé pour les échantillons de rats, et Kit ELISA SEKCN-0130 pour l'IL-23 de poulet est disponible pour la recherche sur les poulets.

Un kit conçu pour une espèce ne doit pas être utilisé pour une autre espèce, sauf si la réactivité croisée a été testée et confirmée. Des noms de protéines similaires n'impliquent pas que les anticorps du test reconnaîtront la cible de la même manière.

Le kit ELISA IL-23 pour souris et les autres kits spécifiques à l'espèce doivent être sélectionnés en fonction du modèle animal utilisé dans l'étude.

La société Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., fondée en 2004, développe des produits pour l'immunologie, la biologie cellulaire, la biologie moléculaire et la biochimie. Pour plus d'informations sur ses produits et son système qualité, veuillez consulter son site web. page de l'entreprise Solarbio.

Que faut-il vérifier avant de lire le résultat final ?

Commencez par la courbe standard

La courbe d'étalonnage doit respecter les critères d'acceptation spécifiés pour le kit et utiliser la méthode d'ajustement de courbe recommandée. Les résultats des puits en réplique doivent être concordants dans les limites de précision spécifiées pour le test.

L'absorbance du blanc doit rester faible. Une absorbance élevée peut indiquer un lavage incomplet, une contamination, une manipulation incorrecte des réactifs ou une incubation excessive.

Les échantillons présentant des signaux supérieurs à la limite supérieure de quantification doivent être dilués et réanalysés si le protocole le permet. Les résultats inférieurs à la limite inférieure de quantification ne doivent pas être exprimés en concentrations exactes, et les résultats inférieurs à la limite de détection doivent être rapportés en conséquence.

Revenons à la préparation des échantillons

Des valeurs inattendues d'IL-23 amènent souvent les chercheurs à remettre en question le kit en premier lieu, mais la source de l'écart peut être survenue plus tôt dans le flux de travail.

La densité cellulaire a pu différer entre les groupes, le stimulant a pu être mal préparé ou le surnageant peut contenir des débris cellulaires. Les échantillons de sérum ou de plasma ont également pu subir des cycles de congélation-décongélation répétés.

Le pipetage, le lavage, la durée et la température d'incubation, ainsi que les paramètres du lecteur de microplaques doivent être rigoureux et constants. Le test ELISA est sensible aux variations de manipulation, notamment lorsque la concentration de cytokine est faible.

Conclusion

La mesure de l'IL-23 humaine peut fournir des informations utiles dans les études sur l'inflammation et la réponse immunitaire, mais la concentration mesurée doit être interprétée dans le contexte de la conception expérimentale complète.

Pour les études sur l'IL-23 induite par le LPS, les PBMC contenant des monocytes, les monocytes primaires ou les cellules dendritiques, ainsi que les modèles de cellules myéloïdes correctement caractérisés, sont biologiquement plus appropriés que les lymphocytes purifiés. Les cellules THP-1 peuvent être évaluées avec le LPS dans des conditions de culture validées. Les cellules Jurkat peuvent être utiles pour les études de signalisation des lymphocytes T induite par le PMA, mais elles ne doivent pas être présentées comme un modèle standard de sécrétion d'IL-23 sans validation préalable.

Le sérum et le plasma normaux peuvent présenter des taux d'IL-23 inférieurs au seuil de détection. Ce résultat peut être valide si les contrôles et la courbe d'étalonnage du dosage sont normaux.

L’identification des espèces, la manipulation des échantillons, la constance des cultures et la réalisation des analyses ont toutes une incidence sur les données finales. Pour toute question relative au choix du kit ou aux conditions de test, les chercheurs peuvent contacter Solarbio avant de commencer l’analyse.

FAQ (questions fréquentes)

Q1 : Qu'est-ce que l'IL-23 humaine ?

A1 : L’IL-23 humaine est une cytokine hétérodimérique pro-inflammatoire appartenant à la famille de l’IL-12. Elle est composée de la sous-unité p19 codée par l’IL-23A et de la sous-unité p40 codée par l’IL-12B.

Q2 : Pourquoi l'IL-23 est-elle liée aux cellules Th17 ?

A2 : L’IL-23 transmet son signal via un complexe récepteur composé d’IL-23R et d’IL-12Rβ1. Ceci active la voie de signalisation associée à JAK2/TYK2, STAT3 étant le principal STAT en aval dans les réponses liées à Th17.

Q3 : L'IL-23 humaine peut-elle être détectée dans les surnageants de culture cellulaire ?

A3 : Oui. Les surnageants de culture cellulaire peuvent être testés lorsque le modèle cellulaire est capable de produire de l’IL-23 et que le type d’échantillon est validé pour le kit ELISA. Les PBMC contenant des monocytes, les monocytes/macrophages/cellules dendritiques primaires et les modèles de cellules myéloïdes correctement caractérisés sont généralement plus appropriés pour les études de sécrétion d’IL-23 que les lymphocytes purifiés ou les cellules Jurkat.

Q4 : Peut-on utiliser le LPS dans une expérience sur l'IL-23 ?

A4 : Oui. Le LPS peut stimuler la production d’IL-23 par les cellules immunitaires innées réactives, notamment les monocytes, les macrophages, les cellules dendritiques, les préparations de PBMC contenant des monocytes et certains modèles de cellules myéloïdes. Il ne faut pas supposer qu’il induit la sécrétion d’IL-23 par les lymphocytes purifiés.

Q5 : Le PMA peut-il être utilisé avec des cellules Jurkat ?

A5 : Le PMA peut activer les cellules Jurkat et est utile dans les études de signalisation des lymphocytes T, mais les cellules Jurkat ne constituent pas un modèle standard de production positive d’IL-23 sécrétée. Les surnageants de cellules Jurkat traitées au PMA ne doivent pas être présentés comme un contrôle positif validé de l’IL-23 sans données à l’appui.

Q6 : Pourquoi l'IL-23 est-elle parfois indétectable dans le sérum ou le plasma normal ?

A6 : L’IL-23 peut être présente à une concentration inférieure au seuil de détection du test. Ceci est fréquent pour les cytokines faiblement abondantes dans les échantillons normaux.

Q7 : Un kit ELISA IL-23 de souris peut-il tester des échantillons humains ?

A7 : Non. Les échantillons humains doivent être testés avec un kit ELISA IL-23 humain, sauf si le fabricant a spécifiquement validé la réactivité croisée.

Q8 : Que faut-il vérifier lorsque les puits dupliqués ne correspondent pas ?

A8 : La précision du pipetage, le mélange des échantillons, le lavage, le temps d'incubation, la position de la plaque, les bulles et la préparation des réactifs doivent tous être revus.