トリプシン阻害活性測定：簡便な分光光度法

トリプシン阻害活性は簡単に言及できるものの、正確に測定するのは必ずしも容易ではない。見た目が透明な大豆抽出物でも、高濃度の活性阻害物質が含まれている可能性がある。植物サンプルが防御関連タンパク質を高レベルで発現していても、それが実際のトリプシン活性の阻害につながるわけではない。

そのため、活性測定法が有用です。この試験では、阻害タンパク質がトリプシンに及ぼす影響を測定します。阻害タンパク質の量を測定するのではなく、トリプシンへの影響を測定します。発色反応は、分光光度計またはマイクロプレートリーダーを用いて405 nmで読み取ります。

この方法は、食品サンプル、植物組織、飼料原料、精製タンパク質、その他の研究サンプルに実用的です。このテストを他の酵素またはタンパク質測定と組み合わせる必要がある研究室は、Solarbioの製品も確認できます。 ライフサイエンス研究ソリューション 関連製品およびワークフローサポートについては、こちらをご覧ください。

トリプシン阻害剤とは何ですか？

トリプシン阻害剤とは、トリプシンに結合してその酵素活性を低下させるタンパク質またはペプチドのことである。トリプシン阻害剤は、植物、動物、微生物など様々な生物に存在する。

トリプシンは、大きな食物タンパク質をより小さなペプチドに分解できるセリンプロテアーゼです。動物では、トリプシンは膵臓で不活性な前駆体であるトリプシノーゲンとして産生されます。トリプシノーゲンは動物の小腸で活性化され、トリプシンになります。

その活性化段階は重要です。消化器系に存在するトリプシンは非常に有用な酵素ですが、もしこの酵素が体内の他の組織で活性化すると、それらの組織に損傷を与えてしまいます。これは他のタンパク質によって自然に抑制されています。

植物において、トリプシン阻害剤は防御タンパク質であり、例えば、植物を餌とする昆虫やその他の生物の消化酵素の働きを阻害することができる。そのため、同じ種類の分子は、消化生理学、食品加工、植物保護、タンパク質調節といった分野で研究対象となり得る。

クニッツ型トリプシン阻害剤

クニッツ型トリプシン阻害剤は、より大きなタンパク質である。分子量は18～24kDaである。これらの阻害剤は通常、1つの反応部位と2～3組のジスルフィド結合を持つ。

多くのプロテアーゼ阻害剤は、トリプシン分子1個と1対1の複合体を形成する。阻害剤と酵素の複合体は非常に安定している。このような複合体中の酵素は、触媒活性の大部分を失う。

ウシ膵臓トリプシン阻害剤（BPTIまたはアプロチニンとも呼ばれる）は、その代表的な例である。ジャガイモから単離されたいくつかのプロテアーゼ阻害剤も、クニッツファミリーに属する。

食品および飼料の研究において、これらのタンパク質は熱処理後に研究される。処理後も阻害タンパク質の量は残っているものの、その活性は急激に低下する可能性がある。そのため、総タンパク質量を測定するよりも、活性試験の方が適している。

ボーマン・バークトリプシン阻害剤

ボーマン・バーク阻害因子は比較的小型で、分子量は6～10kDa程度であることが多い。構造はコンパクトで、通常7対のジスルフィド結合を含んでいる。

有用な特徴の一つは、2つの独立した反応部位を持つことができる点である。一方の部位はトリプシンを阻害し、もう一方の部位はキモトリプシンを阻害する。これにより、多くの単一部位阻害剤よりも広い阻害範囲が得られる。

これらは大豆、カボチャ、緑豆、小豆、ヒマワリ、ソバなどの植物性食品に含まれています。その安定した構造は、食品科学と機能性成分研究の両方において注目を集めています。

なぜ研究室ではトリプシン阻害活性を測定するのか？

同じ検査でも、全く異なる疑問に答えることができる。食品加工業者は、加熱によって抗栄養活性が低下したかどうかを知りたいかもしれない。植物研究者は、サンプル間の昆虫抵抗性を比較したいかもしれない。タンパク質研究所は、精製された阻害剤バッチの活性を調べているかもしれない。

テスト方法はほぼ同じだが、結果の解釈方法はプロジェクトによって異なる。

食品および飼料加工

生の豆類やその他の豆類には、トリプシン阻害物質がかなりの量含まれている場合があります。これらの食品を十分な加熱処理をせずに摂取すると、タンパク質の消化効率が低下する可能性があります。

体は消化酵素の産生量を増やすことで反応する可能性がある。長期的な摂食研究では、阻害物質の過剰摂取は膵臓の活動変化とも関連付けられている。

加熱によって阻害物質の活性は低下するが、加熱すればするほど良いとは限らない。加熱が弱すぎると、活性阻害物質が過剰に残ってしまう。逆に加熱が強すぎると、有用なタンパク質が損傷を受け、栄養価が低下する可能性がある。

トリプシン阻害活性アッセイは、加工業者がそのバランスを確認するのに役立ちます。加工後も活性を維持している阻害物質について、直接的な結果が得られます。

Solarbioはより幅広い製品を提供しています 生化学分析キット 同一プロジェクト内で酵素活性、代謝産物、酸化ストレスマーカー、または関連するサンプル特性を測定する必要がある研究室向け。

植物防御研究

植物は、昆虫による摂食や病原菌の攻撃を受けた後に、トリプシン阻害物質の産生を増加させることがある。この阻害物質は摂食した昆虫の消化器系に入り込み、そのプロテアーゼ活性の一部を阻害する。

これは必ずしも昆虫を直接死に至らしめるわけではありません。多くの場合、消化効率を低下させます。成長が遅くなったり、摂食行動が変化したり、発育が遅れたりする可能性があります。

研究者は、植物の品種、処理群、またはストレス条件間で阻害活性を比較することができます。遺伝子発現データは、阻害遺伝子が活性化されているかどうかを示します。活性アッセイは、生成されたタンパク質が依然として機能しているかどうかを示します。

阻害剤の活性とストレスシグナル伝達または代謝変化を関連付けるプロジェクトの場合、Solarbioの 経路研究リソース 関連化合物、抗体、およびアッセイ製品の選定を支援できます。

生物学的モデルにおけるプロテアーゼ制御

トリプシン阻害剤は動物系においても保護的な役割を果たしている。SPINK1はその一例であり、膵臓内でのトリプシンの早期活性化を抑制する。

この制御が機能しなくなると、膵臓組織が活性消化酵素にさらされる可能性がある。これが、膵炎の研究においてトリプシン調節がしばしば議論される理由の一つである。

アプロチニンをはじめとするプロテアーゼ阻害剤は、炎症、虚血、浮腫などのモデルにおいても研究されてきた。これらの研究プロジェクトでは、通常、複数の測定指標が必要となる。酵素シグナルの低下は阻害を示している可能性があるが、それだけでは下流の生物学的変化のすべてを説明できるわけではない。

分光光度法はどのように機能するのですか？

基本的な化学反応は複雑ではない。トリプシンは発色基質と反応し、黄色い生成物を生成する。阻害剤がトリプシンの働きを阻害すると、生成される黄色い生成物の量は減少する。

ソーラーバイオ BC6860/BC6865トリプシン阻害活性測定キット これはこの原則に基づいています。

発色基質としてのBAPNA

BAPNAはトリプシンの基質として用いられる。トリプシンがBAPNAを加水分解すると、p-ニトロアニリンが放出される。

p-ニトロアニリン（p-NAと表記されることが多い）は黄色を呈し、405 nmで測定できる。トリプシンの活性が高いほどp-NAの生成量が多くなり、吸光度が高くなる。

試料にトリプシン阻害剤が含まれている場合、酵素の一部が阻害されます。その結果、BAPNAの加水分解が抑制され、p-NAの量が減少し、吸光度値が低下します。

したがって、このアッセイはサンプルとの接触後に残存するトリプシン活性を測定するものであり、阻害物質を直接染色したり測定したりするものではありません。

低い数値は何を意味するのでしょうか？

ブランク反応と対照反応が正しい場合、吸光度が低いほど阻害作用が強いことを意味するのが一般的です。

弱い阻害剤はトリプシンの大部分を活性のまま残すため、反応液は黄色のままとなり、高い数値を示す。強い阻害剤はより多くの酵素を阻害するため、黄色い生成物は少なくなる。

最終的な計算では、サンプル反応を必要な対照と比較します。結果は、阻害活性、阻害単位、またはサンプル重量もしくはタンパク質含有量で正規化された活性として報告される場合があります。

推奨測定範囲外のサンプルは希釈して再度測定する必要があります。線形範囲外の吸光度値を使用すると、見た目はきれいに見える計算結果になるかもしれませんが、信頼性に欠けます。

再現性の低下を引き起こす一般的な原因は何ですか？

ほとんどの問題は、テストの背後にある考え方から生じるのではなく、サンプル処理から生じる。

不均一なサンプル抽出

植物や食品のサンプルは、よく粉砕する必要があります。粗いサンプルや不均一なサンプルでは、​​部分によって放出される阻害物質の量が異なる場合があります。

試料重量、抽出量、混合時間、抽出温度、遠心分離条件は、各グループ間で同一に保つ必要があります。バッチ処理の途中でこれらのいずれかを変更すると、結果に影響が出る可能性があります。

濃い色や濁った抽出液は、バックグラウンドの吸光度を増加させる可能性があります。このような場合、サンプルブランクを用いると便利です。ブランクがない場合、サンプルの本来の色が反応生成物と誤認される可能性があります。

井戸間のタイミングのずれ

酵素反応は、プレートやチューブを扱っている間にも継続します。最初のサンプルが最後のサンプルよりも数分早く基質を受け取った場合、その差が最終的な吸光度に現れる可能性があります。

大型プレートの場合、マルチチャンネルピペットを使用すると、タイミングの制御が容易になることが多い。チューブを用いた実験では、すべてのサンプルを一度に開始するのではなく、小グループに分けて実験を行う方が良い場合がある。

温度も重要です。試薬を長時間放置したり、反応チューブを同じ条件下で保管しなかったりすると、トリプシンの活性が変化する可能性があります。

特殊なサンプルタイプを扱う研究室は、Solarbioに問い合わせることができます。 技術サービスチーム 抽出、希釈、およびアッセイ設定について。

コントロールが欠落しています

サンプルチューブだけでは不十分です。酵素活性、基質バックグラウンド、サンプルの色、および吸光度の非酵素的変化に対するコントロールが必要です。

特にプレートがほぼ満杯になったとき、ウェルを節約するためにコントロールを除去したくなる誘惑に駆られる。しかし、それはたいてい後々問題を引き起こす。バックグラウンドの影響が不明な場合、結果の説明ははるかに困難になる。

技術的な繰り返し測定も行うべきです。繰り返し測定の結果に大きな差がある場合は、まずピペット操作、混合、時間、および試料の透明度を確認してください。

この検査と併用できる関連検査はどれですか？

トリプシン阻害活性は、多くの場合、研究の一部分にすぎません。

BC2310/BC2315トリプシン活性アッセイキットは、プロジェクトでトリプシン自体を測定する必要がある場合に役立ちます。酵素活性と阻害活性を並行して測定することで、トリプシン活性が低い場合と、正常なトリプシン活性が強く阻害されている場合という、2つの異なる状況を区別することができます。

その他の関連製品には、BC1020/BC1025キサンチンオキシダーゼ阻害活性測定キット、BC6380/BC6385 α-グルコシダーゼ阻害活性測定キット、およびBC6450/BC6455 β-ガラクトシダーゼ阻害活性測定キットがあります。

これらのアッセイは、複数の酵素阻害剤を同じサンプルまたは抽出条件下で比較するスクリーニング作業に役立ちます。Solarbioはまた、製品の最新情報やアプリケーション情報を、 研究ニュースセクション.

この種の検査にSolarbioを選ぶ理由とは？

Solarbio社は2004年以来、ライフサイエンス研究用製品を提供しています。同社の製品ラインナップには、生化学アッセイキット、抗体、ELISAキット、細胞生物学試薬、染色製品、分析標準品、分子構成要素、低分子化合物などが含まれます。

同社はISO 13485、ISO 9001、ISO 14001、およびISO 45001のマネジメントシステムに基づいて業務を行っています。同社の試験センターはCNASの認定を受けています。会社、製品開発、および品質システムに関する詳細は、以下のウェブサイトでご覧いただけます。 Solarbioについて ページ。

日常的な酵素アッセイにおいて役立つものは、ごく基本的なものです。安定した試薬、明確な手順、適切なコントロール、そしてサンプルが期待どおりに反応しない場合に適切に対応できる担当者です。通常、2回目の測定結果が1回目と一致するかどうかは、これらの要素によって決まります。

結論

トリプシン阻害活性アッセイは、試料がトリプシンをどの程度阻害するかを測定する。トリプシンはBAPNAを加水分解し、黄色のp-NAを放出する。阻害が強いほどp-NAの量は少なくなり、405 nmにおける吸光度が低下する。

この方法は、大豆、豆類、植物組織、食品、飼料、精製阻害剤製剤、および生物学的試料に適用できます。試料の調製とタイミングには注意が必要です。ブランク反応と対照反応についても同様です。

BC6860/BC6865トリプシン阻害活性アッセイキットは、この作業のためのシンプルな分光光度法オプションを研究室に提供します。サンプル適合性、抽出条件、または関連製品について不明な点がある研究者は、 Solarbioに問い合わせる 最初の実行を設定する前に。

FAQ

Q1：トリプシン阻害活性アッセイは何を測定するのですか？

A1：これは、試料がトリプシン活性を低下させる能力を測定するものです。結果は、阻害タンパク質の総量ではなく、機能的な阻害を反映しています。

Q2：なぜBAPNAがテストで使用されるのですか？

A2：BAPNAはトリプシンの発色基質です。トリプシンはBAPNAを加水分解し、黄色のp-ニトロアニリンを放出します。このp-ニトロアニリンは405 nmで測定できます。

Q3：吸光度が低いほど阻害作用が強いということですか？

A3：はい。トリプシンの阻害が強くなると、BAPNAの加水分解が減り、p-ニトロアニリンの生成量も減ります。そのため、吸光度が低下します。

Q4：大豆やその他の豆類も検査対象になりますか？

A4：はい。大豆、緑豆、小豆、その他の植物性試料は、適切な抽出処理後であれば検査可能です。着色または濁った試料の場合は、適切なブランク試料を併用してください。

Q5：なぜ繰り返し測定値が異なるのですか？

A5：一般的な原因としては、粉砕ムラ、ピペット操作ミス、反応時間の違い、温度変化、混合不良、試料の濁り、またはブランク設定の誤りなどが挙げられます。

Q6：トリプシン阻害活性はトリプシン活性と同じですか？

A6：いいえ。トリプシン活性は、酵素が基質をどれだけ効率的に分解するかを測定するものです。トリプシン阻害活性は、試料がその酵素活性をどれだけ強く低下させるかを測定するものです。