Как обнаружить, удалить и предотвратить появление микоплазмы в культуре клеток

Микоплазма — это одна из тех проблем клеточных культур, которая может долгое время оставаться незаметной. Питательная среда может выглядеть прозрачной. Клетки могут оставаться прикрепленными друг к другу. На первый взгляд, ничего серьезного не кажется.

Затем начинаются странные результаты.

Клетки растут медленнее, чем раньше. Эффективность трансфекции снижается без видимой причины. Среда желтеет быстрее обычного. Некоторые клетки собираются в неравномерные группы, в то время как другие отслаиваются. Два эксперимента, проведенные по одному и тому же протоколу, больше не дают одинаковых результатов.

К этому моменту микоплазменная контаминация уже может влиять на культуру.

Размер этих организмов составляет всего от 50 до 300 нм, что позволяет им проходить через некоторые фильтры, используемые для задержки обычных бактерий. Кроме того, у микоплазм отсутствует клеточная стенка, поэтому стандартное лечение пенициллином и стрептомицином не обеспечивает надежной защиты.

Рабочий план контроля должен состоять из трех частей. Лаборатория должна выявлять загрязнение на ранней стадии, оперативно обрабатывать инфицированные культуры и снижать вероятность повторного возникновения той же проблемы. Для лабораторий, использующих флуоресцентный скрининг, полный набор может упростить окрашивание, фиксацию, монтирование и подготовку образцов для микроскопии. Исследователи, разрабатывающие более широкую систему управления загрязнением, также могут ознакомиться с доступными вариантами. растворы для культивирования клеток при планировании ежедневных процедур.

Почему микоплазму легко пропустить?

Культура может по-прежнему выглядеть нормальной.

Сильное загрязнение заметить проще. Клетки могут стать зернистыми, разрастаться пятнами, отслаиваться от колбы или перестать нормально делиться.

Низкий уровень заражения гораздо менее очевиден. Клетки могут продолжать размножаться, претерпевая метаболические изменения и изменения в экспрессии генов. Микоплазмы используют питательные вещества из культуральной среды и могут вмешиваться в метаболизм аминокислот, синтез нуклеотидов, репликацию ДНК, производство РНК и экспрессию белков.

Это может вызывать сильное разочарование в лаборатории, когда оператор постоянно корректирует параметры трансфекции, меняет сыворотки или повторяет анализ, не понимая, что проблема на самом деле заключается в клеточном материале.

Некоторые проекты более чувствительны, чем другие. Они могут повлиять на клеточную сигнализацию, скрининг лекарственных препаратов, экспрессию генов, анализ цитокинов и трансфекцию. Исследователям, работающим с этими приложениями, также следует проверить соответствующие данные. пути клеточной биологии при анализе неожиданных изменений в результатах эксперимента.

Регулярное применение антибиотиков может скрыть проблему.

Во многих лабораториях в качестве стандартной процедуры в питательную среду добавляют пенициллин и стрептомицин. Эти антибиотики помогают контролировать некоторые распространенные бактерии, но их не следует рассматривать как средство профилактики микоплазмоза.

Микоплазма не имеет клеточной стенки. Поэтому антибиотики, воздействующие на образование клеточной стенки, оказывают на неё незначительное воздействие. Культура может оставаться прозрачной, в то время как заражение продолжается.

Длительное применение антибиотиков также может затруднить выявление проблемы. Они могут подавлять другие бактерии, не удаляя микоплазму, в результате чего у оператора остается культура, которая выглядит чистой, но непригодна для проведения надежных экспериментов.

Откуда берется микоплазма в клеточных культурах?

Люди — общий источник

Удивительно большое количество загрязнений начинается с обычных действий при обращении с предметами.

Микоплазмы могут переноситься через слюну и респираторные капли. Разговор через открытую колбу, прикосновение к телефону в перчатках, перемещение между дверями и боксом биологической безопасности или длительное ношение одних и тех же перчаток могут привести к попаданию загрязняющих веществ в рабочую зону.

Обработка перчаток спреем не устраняет полностью контакт с поверхностью. После того, как перчатки коснулись стула, блокнота, дверной ручки или телефона, обычно безопаснее надеть их обратно.

Еще одним распространенным источником загрязнения является пролитая питательная среда. Небольшой брызг внутри шкафа может разбрызгивать капли на пипетки, бутылки, штативы и расположенные рядом емкости с культурами. Необходимо немедленно убрать загрязненный участок, а не оставлять это до конца сеанса.

Новые клетки могут прибывать зараженными.

Клетки, полученные из другой лаборатории, не следует помещать непосредственно в основное помещение для культивирования. Клеточная линия может выглядеть здоровой, но при этом содержать микоплазму.

Первичные ткани также несут больший риск, поскольку они получены непосредственно из животного или человеческого материала. Даже тщательный отбор проб не может устранить все возможные источники загрязнения.

Новые клетки следует культивировать отдельно, тестировать и хранить в карантине до подтверждения отрицательного результата. Затем чистый запас можно заморозить для последующего использования.

Использование одних и тех же реагентов быстро приводит к распространению загрязнения.

Загрязненная бутылка с питательной средой, фосфатно-солевым буфером, трипсином или сывороткой может повлиять на несколько клеточных линий. То же самое относится к общим пипеткам, аспирационным трубкам и водяным баням.

Самое безопасное правило простое. Работайте с одной клеточной линией за раз. Используйте небольшие порции реагентов. Храните карантинные реагенты отдельно от обычных реагентов для культивирования. Избегайте переноса одной и той же бутылки между разными рабочими зонами.

Какой метод обнаружения микоплазмы является наиболее эффективным?

ПЦР и qPCR являются практичными методами для рутинного скрининга.

Тестирование с использованием ПЦР широко применяется, поскольку дает четкий результат в течение нескольких часов. Этот метод обычно выявляет консервативные последовательности ДНК микоплазм, включая области, связанные с генами 16S рРНК.

Он подходит для скрининга новых клеток, регулярных проверок клеточных банков, устранения неполадок, оценки сывороток или питательных сред, а также контроля качества перед публикацией.

Компания Solarbio поставляет несколько продуктов для обнаружения микоплазм в клеточных культурах. К ним относятся: Набор для тестирования на микоплазму CA1081 (метод ПЦР) и Экспресс-тест на микоплазму CA1082 (для клеточных культур).

Окрашивание по Хёхсту полезно для быстрой проверки.

Флуоресцентное окрашивание по Хёхсту — недорогой метод, не требующий сложного оборудования, за исключением подходящего флуоресцентного микроскопа. Для скрининга на основе флуоресценции используется... Набор для обнаружения микоплазмы CA1080 Предназначен для микроскопического анализа на наличие микоплазмы в культурах клеток.

В комплект входят рабочий раствор Hoechst 33258, фиксирующий раствор и антивыцветающая среда для окрашивания, фиксации и подготовки предметных стекол.

В отрицательном образце клеток Vero флуоресценция Hoechst в основном сосредоточена в ядрах, без многочисленных мелких флуоресцентных точек за пределами ядер.

При наличии загрязнения вокруг поверхности клеток или между клетками могут появляться небольшие флуоресцентные точки.

Этот тест полезен для работы в классе, для быстрой проверки знаний и для лабораторий с ограниченным бюджетом на проведение исследований.

Однако у этого метода есть ограничения. Клеточные обломки, апоптотические тельца и фоновая флуоресценция могут выглядеть как микоплазма. Сомнительный результат окрашивания следует подтвердить методом ПЦР.

Проведение культурального исследования занимает больше времени.

В некоторых регулируемых областях и процессах выпуска продукции культуральный метод тестирования остается важным. Образец помещается на подходящую культуральную среду и контролируется на предмет роста микоплазм.

Главная проблема — скорость. Получение результатов может занять от 7 до 21 дня. Это непрактично, когда лаборатории необходимо быстро решить, можно ли использовать партию клеток.

Некоторые виды микоплазм также сложнее культивировать, чем другие, поэтому метод зависит от подходящих питательных сред и опытных специалистов.

Люминесцентные тесты дают быстрые результаты.

Экспресс-люминесцентные анализы позволяют обнаружить активность ферментов или метаболические сигналы, связанные с жизнеспособными микоплазмами. Они полезны, когда необходимо быстро исследовать большое количество образцов.

Лаборатория должна располагать совместимым оборудованием, а фоновые помехи следует тщательно проверять. Для работы с высоким риском для получения быстрого результата может потребоваться подтверждение с помощью ПЦР или культурального исследования.

Команды, которые не уверены, какой метод подходит для их типа клеток или графика тестирования, могут использовать Solarbio. техническое обслуживание ресурсы для поддержки продукта и рабочих процессов.

Следует ли обрабатывать зараженную клеточную линию?

Некоторые культуры лучше отбросить.

Лечение не всегда является правильным выбором.

Если клеточную линию легко заменить, она сильно загрязнена или уже хранится в чистом замороженном виде, утилизация, как правило, безопаснее. Хранение сильно загрязненной культуры в лаборатории создает риск для каждой соседней клеточной линии.

Спасение клеток более целесообразно, когда клетки редки, генетически отредактированы, отобраны в течение длительного периода, получены из ограниченного количества первичной ткани или их трудно получить повторно.

Перед началом лечения необходимо изолировать инфицированную культуру. Также следует очистить инкубатор, шкаф, аспирационную систему, пипетки, водяную баню и прилегающие поверхности. Лечение только клеток не принесет существенной пользы, если рабочая зона останется загрязненной.

Лечение антибиотиками в домашних условиях трудно контролировать.

Макролиды, тетрациклины, хинолоны и родственные им соединения могут быть эффективны против некоторых видов микоплазм. Сложность заключается в поиске такой концентрации, которая уничтожит микроорганизм, не убивая при этом клетки.

Доза, которую переносит одна клеточная линия, может остановить рост другой клеточной линии. Особенно сложно работать с чувствительными первичными клетками.

Низкая доза может лишь подавить контаминацию. Культура может дать отрицательный результат во время лечения, а затем снова стать положительной. По этой причине лечение антибиотиками в домашних условиях следует начинать с небольшого теста на переносимость, а не с целого клеточного запаса.

Коммерческие средства для удаления загрязнений проще в использовании.

Коммерческие реагенты для удаления микоплазм избавляют лабораторию от необходимости готовить несколько антибиотиков и проводить тестирование различных концентраций с нуля.

Solarbio CA1090 Утилизатор микоплазмы и CA1093 — реагент для уничтожения микоплазм. Предназначены для обработки загрязненных клеточных культур. Обработка часто продолжается в течение нескольких пассажей, в зависимости от типа клеток и уровня загрязнения.

Не следует проводить тестирование клеток только в присутствии удаляющего реагента. После обработки им необходим период восстановления в среде без реагента. Затем тестирование следует повторить. Второй отрицательный результат после дальнейшего культивирования дает более надежный ответ.

Как предотвратить заражение микоплазмой?

Карантинизация клеток перед плановым использованием

Каждая поступающая линия передачи данных должна иметь запись. Запись должна включать в себя источник, дату поступления, номер прохода, результат теста, оператора и место хранения.

Культуру следует хранить отдельно до завершения тестирования. После получения отрицательного результата чистый исходный материал следует заморозить. В дальнейшем можно начинать работу с этим материалом, а не со старой культурой, которая хранилась в течение нескольких месяцев.

Регулярно чистите оборудование общего пользования.

Бокс биологической безопасности необходимо чистить до и после использования. Поддоны для воды в инкубаторе следует регулярно опорожнять и дезинфицировать. Также необходимо уделять внимание водяным баням, контейнерам для центрифуг, предметным столикам микроскопа, аспирационным бутылкам и пипеткам.

Спрей для удаления микоплазмы Solarbio CA1091 можно использовать в рамках процесса очистки окружающей среды. Реагент для профилактики микоплазмоза CA1101 доступен для профилактического использования в клеточных культурах. Лаборатории могут проверить обновления продукта при проверке их материалов для контроля загрязнения.

Тестирование клеток в нужное время

Для действующей лаборатории клеточных культур недостаточно проводить тестирование раз в год.

Клетки следует тестировать при их поступлении, перед заморозкой основного запаса, после размораживания важного запаса, перед длительным экспериментом, перед передачей клеток в другую лабораторию, а также всякий раз, когда наблюдается необычный рост.

Для многих исследовательских лабораторий разумным отправным пунктом является трехмесячный интервал между проверками. Высокопроизводительным лабораториям или тем, которые регулярно получают клеточные линии извне, может потребоваться проводить проверки чаще.

Качественная документация так же важна, как и сам тест. Когда каждая клеточная линия имеет четкую историю, становится гораздо проще отследить, где началось загрязнение и какие культуры могли подвергнуться воздействию.

Соларбио Компания поставляет продукцию для исследований в области клеточной биологии, молекулярной биологии, иммунологии, биохимии, окрашивания, аналитических стандартов и малых молекул. Ее системы управления включают ISO 9001, ISO 13485, ISO 14001 и ISO 45001.

Вывод

Для борьбы с микоплазмами не требуется сложная система, но необходима регулярная работа.

Проверяйте новые клетки перед их попаданием в основную лабораторию. Храните разные клеточные линии и реагенты отдельно. Регулярно проводите очистку общего оборудования. Замораживайте чистый исходный запас, пока культура находится в хорошем состоянии.

При обнаружении загрязнения сначала изолируйте клетки. По возможности верните культуру на место. Если клетки представляют ценность, используйте контролируемый процесс удаления и подтвердите результат после удаления реагента, использованного для обработки.

Главное — не ждать, пока среда изменит цвет или клетки начнут осыпаться из колбы. К этому моменту экспериментальные данные уже могут быть искажены.

Для получения помощи в выборе подходящего средства для обнаружения, удаления или предотвращения, Свяжитесь с командой Solarbio.

ФАКВ

В1: Может ли комбинация пенициллина и стрептомицина предотвратить заражение микоплазмой?

A1: Нет. Пенициллин-стрептомицин не обеспечивает надежной защиты, поскольку микоплазма не имеет нормальной структуры клеточной стенки, на которую воздействуют многие стандартные антибиотики.

В2: Как часто следует проводить тестирование клеточных культур на наличие микоплазмы?

A2: Во многих лабораториях тестирование проводится каждые три месяца. Тестирование также следует проводить при поступлении клеток, перед заморозкой исходного материала, перед крупными экспериментами и при появлении аномального роста.

Вопрос 3: Можно ли выявить микоплазменное загрязнение, изучив питательную среду?

A3: Не с уверенностью. Среда может оставаться прозрачной на ранних стадиях загрязнения. Быстрое пожелтение, медленный рост клеток, плохая трансфекция или необычная морфология могут быть предупреждающими признаками, но все равно необходим надлежащий тест.

Вопрос 4: Является ли ПЦР более эффективным методом обнаружения микоплазм, чем окрашивание по Хёхсту?

A4: Эти два метода могут дополнять друг друга: окрашивание по Хёхсту хорошо подходит для рутинного мониторинга и предварительного скрининга, тогда как ПЦР больше подходит для подтверждающего тестирования предполагаемого загрязнения или сценариев, требующих более высокой чувствительности. Для критически важных образцов или контроля качества биофармацевтических партий рекомендуется комбинировать методы, основанные на культивировании (золотой стандарт), или использовать несколько методов для перекрестной проверки, чтобы повысить надежность результатов.

В5: Следует ли спасать каждую зараженную клеточную линию?

A5: Нет. Заменяемые или сильно загрязненные клетки обычно безопаснее утилизировать. Восстановление в основном рассматривается для редких, первичных, отобранных или генетически модифицированных клеточных линий.

В6: Когда следует повторно тестировать клетки после лечения?

A6: После лечения, направленного на элиминацию микоплазмы, проведите первый ПЦР-тест через 2-3 пассажа (7-10 дней). Второй тест проведите с интервалом в 7 дней. Два последовательных отрицательных результата указывают на предварительную эффективность. Непрерывный мониторинг до получения отрицательного результата на 28-й день, подтверждающего эрадикацию.

Вопрос 7: Какие продукты Solarbio предназначены для обнаружения и контроля микоплазм?

A7: Компания Solarbio предлагает CA1080, CA1081 и CA1082 для обнаружения, CA1090 и CA1093 для удаления, CA1091 для очистки окружающей среды и CA1101 для предотвращения загрязнения.