Как повысить выход и качество плазмидной ДНК при экстракции: распространенные проблемы и способы их решения.

Выделение плазмидной ДНК кажется простым делом, если делать это несколько раз. Выращиваем бактерии, собираем осадок, лизируем клетки, очищаем ДНК и элюируем ее. Проблемы начинаются, когда конечный результат в пробирке оказывается не таким, как ожидалось.

Иногда концентрация очень низкая. В других случаях показания кажутся необычно высокими, но ДНК плохо подходит для клонирования, трансфекции или других последующих экспериментов. Часто в первую очередь винят набор для экстракции, хотя реальная проблема могла возникнуть еще на стадии культивирования бактерий или даже на первом этапе ресуспендирования.

В рутинных работах по молекулярной биологии самый простой способ устранения неполадок при выделении плазмид — это рассмотреть весь рабочий процесс, а не отдельный этап. Соларбио предоставляет широкий Ассортимент продукции в области молекулярной биологии Включает в себя выделение плазмид, очистку нуклеиновых кислот и соответствующие лабораторные реагенты.

Почему концентрация плазмидной ДНК в моей ДНК слишком высока?

Неожиданно высокая концентрация не всегда является хорошей новостью.

Одна из распространенных причин — загрязнение РНК. Если в раствор I не была добавлена ​​РНКаза А, или если РНКаза А утратила активность после длительного хранения, остаточная РНК может увеличить показание A260. В этом случае прибор показывает более высокую концентрацию нуклеиновых кислот, даже если часть этого сигнала не исходит от плазмидной ДНК.

Практическое решение простое. Убедитесь, что РНКаза А добавлена ​​в раствор I перед экстракцией. Если приготовленный раствор I хранился длительное время, перед началом приготовления следующей партии следует проверить наличие РНКазы А.

Для лабораторий, обрабатывающих стандартные образцы бактериальных плазмид, набор для экстракции плазмид D1100 Plasmid Extraction Mini Kit является одним из вариантов для подготовки плазмид в небольших масштабах.

Почему выход плазмидной ДНК слишком низок?

Низкий выход продукта — более сложная проблема, поскольку потери могут происходить на нескольких этапах. Предварительное исследование бактериальной культуры обычно экономит время.

Перед экстракцией проверьте бактериальную культуру.

Плохой рост бактерий означает, что плазмиды доступны в меньшем количестве еще до начала экстракции.

Если значение OD600 слишком низкое, это может означать просто недостаток бактериальной биомассы. Слишком длительное культивирование также может вызвать проблемы. После того, как бактерии переходят за пределы желаемой стадии роста, высвобождение нуклеаз и затрудненный лизис клеток могут повлиять на конечный выход плазмиды.

Загрязнение вносит еще один фактор в колбу. Нежелательные микроорганизмы конкурируют с целевыми бактериями и могут изменить состояние культуры. Старые культуры или культуры, прошедшие многократные пассажи, также менее предсказуемы.

Практический подход заключается в том, чтобы начать с одной свежей колонии, использовать подходящую среду, например, LB, с правильной концентрацией антибиотика и культивировать в течение 12-16 часов, не допуская чрезмерного роста.

Для создания плазмид с низкой копийностью требуется больше исходного материала.

Не каждая плазмида производит одинаковое количество ДНК.

Крупные плазмиды и плазмиды с низкой копийностью могут давать значительно меньше ДНК из того же объема культуры. Большой фрагмент ДНК, особенно размером более 10 кб, также может снижать эффективность репликации.

Если вектор можно изменить, использование плазмиды с большим количеством копий может упростить рабочий процесс. Если же необходимо сохранить плазмиду с малым количеством копий, увеличение объема бактериальной культуры с примерно 5 мл до 10–20 мл может обеспечить больше исходного материала.

Более подробный обзор реагентов для экстракции и очистки ДНК доступен в [ссылка на источник]. Основные реагенты в очистке ДНК: всеобъемлющее руководствочто полезно, когда проблема, по-видимому, связана не только с выходом плазмид.

Что происходит во время лизиса и нейтрализации клеток?

Даже в хорошей бактериальной культуре может образовываться некачественная плазмидная ДНК, если этап лизиса проведен неправильно.

Не следует проводить недостаточный или чрезмерный лизис клеток.

Слишком большое количество бактериального материала может превысить допустимую концентрацию используемого лизирующего раствора. В то же время, кратковременное воздействие раствора II может привести к недостаточному лизису части бактериальной популяции.

Слишком длительное выдерживание клеток в щелочных условиях лизиса создает другую проблему. Если время лизиса превышает примерно пять минут, геномная ДНК может быть повреждена и смешаться с препаратом плазмиды. Сильные щелочные условия также могут повлиять на качество плазмиды.

После добавления раствора II аккуратно, но тщательно перемешайте. Интенсивное перемешивание с помощью вихревого движения здесь не рекомендуется.

Компания Solarbio также поставляет продукцию. решения для исследований в области молекулярной биологии для лабораторий, работающих в области выделения, очистки ДНК и других применений нуклеиновых кислот.

Для нейтрализации необходимы правильное перемешивание и центрифугирование.

Раствор III должен надлежащим образом контактировать с лизатом.

После добавления реагента переворачивайте пробирку примерно 8–10 раз, пока не образуется достаточно однородный белый хлопьевидный осадок. Некачественное перемешивание может привести к неполной нейтрализации и повлиять на выделение плазмиды.

Центрифугирование — это следующий этап, где позже проявляются небольшие упрощения. Рабочие условия около 12 000–13 000 об/мин в течение 10–15 минут помогают отделить осадок от надосадочной жидкости, содержащей плазмиду.

Для работы с плазмидами, где важен контроль эндотоксинов, мини-набор для экстракции плазмид без эндотоксинов D1140 предлагает еще один формат для экстракции в небольших масштабах.

Как можно защитить плазмидную ДНК во время экстракции?

Плазмидная ДНК может быть утрачена или повреждена даже при правильной химии лизиса.

Одной из проблем является загрязнение нуклеазами. Вода, пробирки, наконечники пипеток и другие материалы, используемые при работе с нуклеиновыми кислотами, должны быть пригодны для этой задачи. Загрязнение ДНКазой может снизить целостность ДНК, а нежелательная активность РНКазы становится проблемой в процессах, связанных с РНК.

Важно также правильно обращаться с образцом. Интенсивное встряхивание не требуется на некоторых этапах подготовки плазмиды и может затруднить очистку образца.

Изменения температуры также не следует игнорировать. Необходимо поддерживать постоянные условия экстракции, особенно в областях лизиса и элюции.

Лаборатории, обрабатывающие большое количество образцов, могут предпочитать другой формат обработки. Мини-набор для экстракции плазмид DM1100 (метод с использованием магнитных шариков) предлагает вариант с использованием магнитных шариков наряду со стандартными методами экстракции.

Как следует элюировать плазмидную ДНК?

Последний этап может незаметно свести на нет все усилия по извлечению экстракта.

Использование очень большого объема элюции может позволить выделить ДНК, но при этом конечный образец окажется слишком разбавленным. Использование слишком малого количества жидкости создает противоположную проблему, поскольку мембрана может быть недостаточно увлажнена для полного высвобождения плазмиды.

Значение pH элюирующего раствора также имеет значение. Кислая дистиллированная вода или буфер TE с pH ниже 7,0 могут снизить выход плазмиды. Для этого этапа больше подходит pH в диапазоне 8,0–8,5.

Температура может помочь. Предварительный нагрев элюирующего раствора примерно до 60°C может улучшить высвобождение плазмидной ДНК из кремниевой мембраны. После добавления раствора оставьте его на мембране примерно на одну-две минуты перед центрифугированием, а не центрифугируйте сразу.

Небольшие потери при обработке также суммируются. После первого центрифугирования бактерий тщательно удалите надосадочную жидкость, чтобы осадок не был излишне разбавлен. При добавлении раствора I осадок должен быть полностью ресуспендирован, без видимых комков.

Если проблема с извлечением данных повторяется после проверки основных шагов, Solarbio ресурсы технического обслуживания Также может использоваться для выбора продукции и технической поддержки.

Какой набор для выделения плазмид подходит для разных образцов?

Тип образца следует указывать перед названием набора.

Для стандартной подготовки плазмид в небольших объемах используется мини-набор для экстракции плазмид D1100. Макси-набор для экстракции плазмид D1110 предназначен для больших объемов подготовки. Для грамположительных бактерий существуют свои форматы экстракции, включая D1120 и D1130, а D1160 предназначен для экстракции плазмид дрожжей.

Для чувствительных к эндотоксинам применений можно использовать D1140 или D1150 в зависимости от требуемого масштаба приготовления. Обработка магнитными шариками доступна через DM1100.

Нет причин применять один и тот же рабочий процесс ко всем плазмидам. Исходный материал, количество копий плазмиды, объем образца, дальнейшее использование и требуемое качество ДНК — все это влияет на выбор.

Исследователи могут ознакомиться с информацией на сайте Solarbio. продукты экстракции нуклеиновых кислот при сравнении вариантов экстракции для различных рабочих процессов молекулярной биологии.

Вывод

Плохое выделение плазмидной ДНК обычно имеет причину, и дело не всегда в колонке или заключительном этапе элюции.

Загрязнение РНК может привести к тому, что концентрация будет казаться выше, чем есть на самом деле. Слабый рост бактерий, низкое количество копий плазмиды, плохое ресуспендирование, неполный лизис, грубое обращение, слабая нейтрализация или неподходящие условия элюции — все это может снизить количество или качество ДНК, которая в конечном итоге попадает в пробирку.

Полезно проводить поиск и устранение неисправностей в том же порядке, в котором выполняется эксперимент. Сначала проверьте культуру. Затем рассмотрите этапы ресуспендирования, лизиса, нейтрализации, центрифугирования, работы с колонкой и элюции.

Качественный препарат плазмиды должен не только обеспечивать высокую концентрацию на приборе. ДНК также должна быть чистой и пригодной для дальнейшего использования.

По вопросам, касающимся продуктов для выделения плазмид или других применений в молекулярной биологии, исследователи могут связаться с компанией Solarbio через [указать контактные данные]. Контактная страница.

Часто задаваемые вопросы

В1: Почему концентрация плазмидной ДНК у меня выше, чем ожидалось?

A1: Распространенной причиной является загрязнение РНК. Если РНКаза А отсутствует или больше не активна, остаточная РНК может увеличить показание A260 и привести к тому, что измеренная концентрация нуклеиновых кислот будет выглядеть выше фактического уровня плазмидной ДНК.

В2: Почему у меня получается низкий выход плазмидной ДНК?

A2: Низкая плотность бактерий, плохие условия культивирования, низкое количество копий плазмид, большие вставки, неполный лизис, деградация ДНК, неполная нейтрализация или неэффективная элюция — все это может снизить выход продукта. Лучше проверить весь процесс, начиная с культивирования бактерий, а не сосредотачиваться только на заключительном этапе экстракции.

В3: Как долго бактериальные клетки должны находиться в растворе II во время щелочного лизиса?

A3: Клетки нуждаются в достаточном времени для надлежащего лизиса, но щелочную обработку не следует неоправданно затягивать. В этом процессе соблюдение периода лизиса в пределах пяти минут помогает уменьшить проблемы, связанные с повреждением геномной ДНК и плазмид.

Вопрос 4: Какой уровень pH следует использовать для элюции плазмидной ДНК?

A4: Можно использовать дистиллированную воду или буфер TE с pH около 8,0–8,5. Кислотный элюирующий раствор с pH ниже 7,0 может снизить выход плазмиды из кремниевой мембраны.