Comment détecter, éliminer et prévenir les mycoplasmes en culture cellulaire

Les mycoplasmes font partie de ces problèmes de culture cellulaire qui peuvent rester longtemps latents. Le milieu peut paraître encore clair et les cellules peuvent rester adhérentes. Au premier abord, rien ne semble anormal.

C'est alors que les résultats étranges commencent.

Les cellules se développent plus lentement qu'auparavant. L'efficacité de la transfection diminue sans raison apparente. Le milieu jaunit plus rapidement que d'habitude. Certaines cellules s'agglutinent de façon irrégulière, tandis que d'autres se détachent. Deux expériences réalisées selon le même protocole ne donnent plus les mêmes résultats.

À ce stade, la contamination par mycoplasmes peut déjà affecter la culture.

Ces organismes, dont la taille varie de 50 à 300 nm environ, peuvent ainsi traverser certains filtres utilisés pour retenir les bactéries courantes. De plus, les mycoplasmes sont dépourvus de paroi cellulaire ; par conséquent, un traitement classique à la pénicilline-streptomycine n’offre pas une protection fiable.

Un plan de contrôle efficace repose sur trois piliers. Le laboratoire doit détecter précocement toute contamination, traiter rapidement les cultures infectées et limiter les risques de récidive. Pour les laboratoires utilisant le dépistage par fluorescence, un kit complet simplifie la coloration, la fixation, le montage et la préparation pour la microscopie. Les chercheurs mettant en place un processus de gestion de la contamination plus large peuvent également consulter les ressources disponibles. solutions de culture cellulaire lors de la planification des procédures quotidiennes.

Pourquoi est-il facile de passer à côté d'une infection à mycoplasme ?

La culture peut encore paraître normale

Une contamination importante est plus facile à repérer. Les cellules peuvent devenir granuleuses, se développer par endroits, se détacher du flacon ou cesser de se diviser normalement.

Une contamination à faible dose est beaucoup moins visible. Les cellules peuvent continuer à proliférer tout en subissant des modifications métaboliques et d'expression génique. Les mycoplasmes utilisent les nutriments du milieu de culture et peuvent perturber le métabolisme des acides aminés, la synthèse des nucléotides, la réplication de l'ADN, la production d'ARN et l'expression des protéines.

Cela peut engendrer beaucoup de frustration au laboratoire lorsqu'un opérateur ajuste continuellement les paramètres de transfection, change de sérum ou répète un test, sans se rendre compte que le problème provient en réalité du stock cellulaire.

Certains projets sont plus sensibles que d'autres. La signalisation cellulaire, le criblage de médicaments, l'expression génique, l'analyse des cytokines et la transfection peuvent tous être affectés. Les chercheurs travaillant sur ces applications peuvent également consulter les informations pertinentes. voies de biologie cellulaire lors de l'examen des changements inattendus dans les résultats expérimentaux.

La prise systématique d'antibiotiques peut masquer le problème.

De nombreux laboratoires ajoutent systématiquement de la pénicilline et de la streptomycine au milieu de culture. Ces antibiotiques permettent de contrôler certaines bactéries courantes, mais ne doivent pas être considérés comme un système de prévention des mycoplasmes.

Mycoplasma ne possède pas de paroi cellulaire. Les antibiotiques agissant sur la formation de cette paroi sont donc peu efficaces. La culture peut rester limpide malgré la persistance de la contamination.

L'utilisation prolongée d'antibiotiques peut également rendre la situation plus difficile à détecter. Elle peut supprimer d'autres bactéries sans éliminer le mycoplasme, laissant ainsi à l'opérateur une culture d'apparence saine mais impropre à des expériences fiables.

D'où proviennent les mycoplasmes cultivés en culture cellulaire ?

Les gens sont une source commune

Une quantité surprenante de contamination commence par une manipulation ordinaire.

Les mycoplasmes peuvent être véhiculés par la salive et les gouttelettes respiratoires. Parler au-dessus d'un flacon ouvert, toucher un téléphone en portant des gants, se déplacer entre les portes et l'enceinte de sécurité biologique, ou garder les mêmes gants trop longtemps peuvent introduire des contaminants dans la zone de travail.

Désinfecter les gants ne supprime pas tous les contacts avec les surfaces. Une fois que les gants ont touché une chaise, un ordinateur portable, une poignée de porte ou un téléphone, il est généralement plus sûr de les changer.

Les déversements de milieu de culture constituent une autre source fréquente de contamination. Une petite éclaboussure à l'intérieur de l'enceinte peut projeter des gouttelettes sur les pipettes, les flacons, les supports et les récipients de culture voisins. Il convient de nettoyer immédiatement et non pas d'attendre la fin de la session.

Les nouvelles cellules peuvent arriver contaminées

Les cellules provenant d'un autre laboratoire ne doivent pas être introduites directement dans la salle de culture principale. Une lignée cellulaire peut paraître saine tout en étant porteuse de mycoplasmes.

Les tissus primaires présentent également un risque accru car ils proviennent directement de matières animales ou humaines. Même un échantillonnage rigoureux ne permet pas d'éliminer toutes les sources de contamination possibles.

Les nouvelles cellules doivent être cultivées séparément, testées et mises en quarantaine jusqu'à confirmation d'un résultat négatif. Un stock sain peut ensuite être congelé pour une utilisation ultérieure.

Les réactifs partagés propagent rapidement la contamination.

Un flacon contaminé de milieu de culture, de PBS, de trypsine ou de sérum peut affecter plusieurs lignées cellulaires. Il en va de même pour les pipettes, les tubes d'aspiration et les bains-marie partagés.

La meilleure pratique consiste à manipuler une lignée cellulaire à la fois, à utiliser de petites quantités de réactifs, à conserver les réactifs de quarantaine séparément des réactifs de culture courants et à éviter de transporter le même flacon entre différents espaces de travail.

Quelle méthode de détection des mycoplasmes est la plus efficace ?

La PCR et la qPCR sont pratiques pour le dépistage de routine.

Les tests PCR sont largement utilisés car ils donnent un résultat clair en quelques heures. Cette méthode détecte généralement les séquences d'ADN conservées des mycoplasmes, notamment les régions associées aux gènes de l'ARNr 16S.

Il convient au criblage de nouvelles cellules, aux contrôles réguliers des banques de cellules, au dépannage, à l'évaluation du sérum ou du milieu et au contrôle de qualité avant publication.

Solarbio fournit plusieurs produits de détection des mycoplasmes pour les travaux de culture cellulaire. Ces produits comprennent : Kit de test de mycoplasmes CA1081 (méthode PCR) et Kit de test rapide CA1082 pour mycoplasmes (pour culture cellulaire).

La coloration au Hoechst est utile pour un contrôle rapide

La coloration fluorescente au Hoechst est peu coûteuse et ne nécessite pas d'équipement complexe, hormis un microscope à fluorescence adapté. Pour le criblage par fluorescence, Kit de détection de mycoplasmes CA1080 est conçu pour le contrôle microscopique des mycoplasmes dans les cultures cellulaires.

Le kit comprend la solution de travail Hoechst 33258, la solution fixatrice et le milieu de montage anti-décoloration pour la coloration, la fixation et la préparation des lames.

Dans un échantillon de cellules Vero négatif, la fluorescence Hoechst est principalement confinée aux noyaux, sans de nombreux points fluorescents fins à l'extérieur des noyaux.

En cas de contamination, de petits points fluorescents peuvent apparaître autour de la surface cellulaire ou entre les cellules.

Ce test est utile pour les travaux en classe, les vérifications rapides et les laboratoires disposant de budgets de test limités.

Cette technique présente toutefois des limites. Les débris cellulaires, les corps apoptotiques et la fluorescence de fond peuvent ressembler à ceux observés avec les mycoplasmes. Un résultat de coloration douteux doit être confirmé par PCR.

Les tests de culture prennent plus de temps

Les tests de culture restent importants dans certains contextes réglementés et pour les procédures de mise sur le marché des produits. L'échantillon est placé sur un milieu de culture approprié et la croissance de mycoplasmes est surveillée.

Le principal problème réside dans la rapidité d'obtention des résultats. Ces derniers peuvent prendre de 7 à 21 jours, ce qui est problématique lorsqu'un laboratoire doit décider rapidement de la viabilité d'un lot de cellules.

Certaines espèces de mycoplasmes sont également plus difficiles à cultiver que d'autres, la méthode dépend donc de milieux de culture adaptés et d'opérateurs expérimentés.

Les tests de luminescence donnent des résultats rapides

Les tests de luminescence rapide détectent l'activité enzymatique ou les signaux métaboliques liés aux mycoplasmes viables. Ils sont particulièrement utiles lorsqu'il est nécessaire d'analyser un grand nombre d'échantillons en peu de temps.

Le laboratoire doit disposer d'un équipement compatible et les interférences de fond doivent être soigneusement vérifiées. Pour les analyses à haut risque, un résultat rapide peut nécessiter une confirmation par PCR ou culture.

Les équipes qui ne savent pas quelle méthode convient le mieux à leur type de cellules ou à leur calendrier de tests peuvent utiliser celle de Solarbio. service technique ressources pour l'assistance produit et flux de travail.

Une lignée cellulaire contaminée doit-elle être traitée ?

Certaines cultures sont mieux abandonnées.

Le traitement n'est pas toujours le bon choix.

Si la lignée cellulaire est facile à remplacer, fortement contaminée ou déjà conservée sous forme de stock congelé propre, son élimination est généralement plus sûre. Le maintien d'une culture fortement contaminée au laboratoire crée un risque pour toutes les lignées cellulaires environnantes.

Le sauvetage est plus raisonnable lorsque les cellules sont rares, génétiquement modifiées, sélectionnées sur une longue période, dérivées d'un tissu primaire limité ou difficiles à obtenir à nouveau.

La culture infectée doit être isolée avant tout traitement. L'incubateur, l'enceinte de sécurité, le système d'aspiration, les pipettes, le bain-marie et les surfaces environnantes doivent également être nettoyés. Le traitement des seules cellules sera peu efficace si la zone de travail reste contaminée.

Il est difficile de contrôler les traitements antibiotiques faits maison

Les macrolides, les tétracyclines, les quinolones et les composés apparentés peuvent être efficaces contre certaines espèces de mycoplasmes. La difficulté réside dans la recherche d'une concentration permettant d'éliminer le micro-organisme sans détruire les cellules.

Une dose tolérée par une lignée cellulaire peut inhiber la croissance d'une autre. Les cellules primaires sensibles constituent un cas particulièrement complexe.

Une faible dose peut seulement masquer la contamination. La culture peut être négative pendant le traitement puis redevenir positive par la suite. C'est pourquoi, pour tout traitement antibiotique préparé à domicile, il est conseillé de commencer par un test de tolérance sur une petite quantité de cellules plutôt que par l'ensemble du stock cellulaire.

Les réactifs de décapage commerciaux sont plus faciles à utiliser

Les réactifs commerciaux d'élimination des mycoplasmes évitent au laboratoire de préparer plusieurs antibiotiques et de tester de nombreuses concentrations à partir de zéro.

Solarbio CA1090 Éliminateur de mycoplasme et Réactif d'élimination des mycoplasmes CA1093 Ces méthodes sont destinées aux protocoles de culture cellulaire contaminés. Le traitement se poursuit souvent sur plusieurs passages, en fonction du type cellulaire et du niveau de contamination.

Les cellules ne doivent pas être testées uniquement en présence du réactif d'élimination. Après traitement, une période de récupération en milieu sans réactif est nécessaire. Le test doit ensuite être répété. Un second résultat négatif après une culture prolongée apporte une réponse plus fiable.

Comment prévenir la contamination par les mycoplasmes ?

Cellules de quarantaine avant utilisation courante

Chaque lignée cellulaire entrante doit être enregistrée. Cet enregistrement doit comprendre sa source, sa date d'arrivée, son numéro de passage, le résultat du test, l'opérateur et sa position de stockage.

La culture doit rester séparée jusqu'à la fin des tests. En cas de résultat négatif, une culture mère saine doit être congelée. Les travaux ultérieurs pourront alors être effectués à partir de cette culture mère plutôt que d'une culture ancienne ayant été utilisée pendant des mois.

Nettoyer régulièrement les équipements partagés

L'enceinte de sécurité biologique doit être nettoyée avant et après chaque utilisation. Les bacs à eau des incubateurs doivent être vidés et désinfectés régulièrement. Les bains-marie, les supports de centrifugeuse, les platines de microscope, les flacons d'aspiration et les pipettes nécessitent également une attention particulière.

Le spray anti-mycoplasmes Solarbio CA1091 peut être utilisé dans le cadre d'un processus de nettoyage environnemental. Le réactif de prévention des mycoplasmes CA1101 est disponible pour une utilisation préventive en culture cellulaire. Les laboratoires peuvent vérifier mises à jour du produit lors de l'examen de leurs documents relatifs au contrôle de la contamination.

Tester les cellules au bon moment

Un test par an ne suffit pas pour un laboratoire de culture cellulaire actif.

Les cellules doivent être testées dès leur arrivée, avant la congélation d'un stock principal, après la décongélation d'un stock important, avant une expérience de longue durée, avant le partage de cellules avec un autre laboratoire et chaque fois qu'une croissance anormale apparaît.

Un intervalle de trois mois entre les tests constitue un point de départ raisonnable pour de nombreux laboratoires de recherche. Les plateformes à haut débit ou les laboratoires qui reçoivent régulièrement des lignées cellulaires externes peuvent nécessiter des tests plus fréquents.

Des enregistrements précis sont aussi importants que le test lui-même. Lorsque chaque lignée cellulaire possède un historique clair, il devient beaucoup plus facile de retracer l'origine de la contamination et d'identifier les cultures potentiellement exposées.

Solarbio Elle fournit des produits pour la biologie cellulaire, la biologie moléculaire, l'immunologie, la biochimie, la coloration, les standards analytiques et la recherche sur les petites molécules. Ses systèmes de gestion sont conformes aux normes ISO 9001, ISO 13485, ISO 14001 et ISO 45001.

Conclusion

La lutte contre les mycoplasmes ne nécessite pas un système compliqué, mais elle requiert un travail régulier.

Tester les nouvelles cellules avant leur introduction au laboratoire principal. Conserver séparément les différentes lignées cellulaires et les réactifs. Nettoyer régulièrement le matériel partagé. Congeler une souche mère stérile tant que la culture est encore en bon état.

En cas de contamination, isoler d'abord les cellules. Remplacer la culture si possible. Si les cellules sont précieuses, utiliser une méthode d'élimination contrôlée et vérifier le résultat après élimination du réactif de traitement.

L'important est de ne pas attendre que le milieu change de couleur ou que les cellules commencent à se détacher du flacon. À ce moment-là, les données expérimentales risquent d'être déjà altérées.

Pour obtenir de l'aide dans le choix d'un produit de détection, d'élimination ou de prévention adapté, contactez l'équipe Solarbio.

FAQ

Q1 : La pénicilline-streptomycine peut-elle prévenir la contamination par les mycoplasmes ?

A1 : Non. La pénicilline-streptomycine n’offre pas une protection fiable car le mycoplasme est dépourvu de la structure normale de la paroi cellulaire ciblée par de nombreux antibiotiques standards.

Q2 : À quelle fréquence faut-il tester les cultures cellulaires pour détecter la présence de mycoplasmes ?

A2 : De nombreux laboratoires effectuent des tests tous les trois mois. Des tests doivent également être réalisés à la réception des cellules, avant la congélation d’une souche mère, avant les expériences importantes et en cas de croissance anormale.

Q3 : La contamination par mycoplasmes peut-elle être identifiée par l'observation du milieu de culture ?

A3 : Non avec certitude. Le milieu peut rester clair lors des premiers stades de la contamination. Un jaunissement rapide, une croissance cellulaire lente, une transfection déficiente ou une morphologie anormale peuvent être des signes d’alerte, mais un test approprié reste nécessaire.

Q4 : La PCR est-elle meilleure que la coloration Hoechst pour la détection des mycoplasmes ?

A4 : Les deux méthodes sont complémentaires : la coloration de Hoechst est bien adaptée au contrôle de routine et au dépistage préliminaire, tandis que la PCR est plus appropriée pour la confirmation de contaminations suspectées ou dans les situations exigeant une sensibilité accrue. Pour les échantillons critiques ou les tests de libération de lots biopharmaceutiques, il est recommandé de combiner les méthodes de culture (méthode de référence) ou d’utiliser plusieurs méthodes pour une validation croisée afin d’améliorer la fiabilité des résultats.

Q5 : Faut-il sauver toutes les lignées cellulaires contaminées ?

A5 : Non. Il est généralement plus sûr de jeter les cellules remplaçables ou fortement contaminées. Le sauvetage est principalement envisagé pour les lignées cellulaires rares, primaires, sélectionnées ou génétiquement modifiées.

Q6 : Quand faut-il tester à nouveau les cellules après le traitement ?

A6 : Après le traitement d’élimination des mycoplasmes, effectuer le premier test PCR après 2 à 3 passages (7 à 10 jours). Réaliser le second test à 7 jours d’intervalle. Deux résultats négatifs consécutifs indiquent une efficacité préliminaire. Un suivi continu jusqu’à l’obtention d’un résultat négatif au 28^e jour confirme l’éradication.

Q7 : Quels produits Solarbio permettent la détection et le contrôle des mycoplasmes ?

A7 : Solarbio fournit CA1080, CA1081 et CA1082 pour la détection, CA1090 et CA1093 pour l'élimination, CA1091 pour le nettoyage environnemental et CA1101 pour la prévention.