細胞培養上清、血清、および血漿サンプル中のヒトIL-23のELISA検出

IL-23は、炎症、Th17細胞生物学、免疫活性化、自己免疫疾患、感染症、腫瘍免疫などの研究において頻繁に測定されるサイトカインです。IL-23はIL-23/IL-17軸の中心的な構成要素であるため、IL-17A、IL-22、GM-CSFなどの関連メディエーターと併せて評価されることがよくあります。生物学的疑問に応じて、追加の経路マーカーも分析される場合があります。

ELISA法自体は必ずしも複雑ではありませんが、前分析段階や生物学的要因が結果に大きく影響する可能性があります。細胞の種類、刺激条件、培養期間、サンプル処理と保存方法、そして予想されるIL-23濃度など、すべてが測定値に影響を与える可能性があります。健常ドナーの血清や血漿では、IL-23濃度がアッセイの検出限界を下回る場合がありますが、適切な刺激を受けたIL-23産生細胞培養では、容易に測定可能な濃度が得られます。

以下の例では、末梢血細胞製剤、THP-1細胞、Jurkat細胞、血清、血漿などが用いられています。また、これらの例は重要な点を示しています。すなわち、IL-23測定における各モデルの適合性は同等ではなく、結果は細胞の種類と刺激条件を考慮して解釈する必要があるということです。

ヒトIL-23とは何ですか？

IL-23は2つの異なるサブユニットから構成されている

ヒトIL-23はIL-12サイトカインファミリーに属する。単鎖タンパク質ではなく、ヘテロ二量体である。

IL-23は、IL23A遺伝子によってコードされるp19サブユニットと、IL12B遺伝子によってコードされるp40サブユニットから構成される。ヒトのp19前駆体は189個のアミノ酸からなる。p40サブユニットはIL-12と共通しており、p19とp40はジスルフィド結合したヘテロ二量体として結合し、生物学的に活性なIL-23を形成する。

この構造は検出において重要である。完全なIL-23を測定することを目的としたアッセイは、そのアッセイの検証済み特異性に基づいて、p19/p40ヘテロ二量体を関連するIL-12ファミリータンパク質および単離されたサブユニットから区別する必要がある。したがって、試験前に種特異性および標的特異性を確認する必要がある。

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IL-23はTh17応答の維持に役立つ

IL-23は、IL-23RとIL-12Rβ1からなるヘテロ二量体受容体を介してシグナル伝達を行う。この受容体は、活性化CD4+T細胞やメモリーCD4+T細胞など、いくつかの応答性免疫細胞集団に発現している。

IL-23受容体の結合は、JAK2/TYK2関連シグナル伝達経路、特にSTAT3を活性化し、多くの細胞環境においてSTAT4の寄与は小さい。このシグナル伝達は、RORγtの発現やIL-17A、IL-22、GM-CSFの産生など、Th17エフェクタープログラムをサポートする。

IL-23は、ナイーブT細胞の分化を単独で開始させる因子としてではなく、Th17細胞の維持、増殖、および病原性エフェクター機能において特に重要な役割を果たします。そのため、IL-23は慢性炎症、自己免疫機構、感染症、および腫瘍免疫に関する研究においてしばしば測定されます。

より広範なネットワークを調査する研究者は、Solarbioの シグナル伝達経路セクション 関連する標的および経路産物を見つける。

末梢血細胞培養におけるIL-23の評価方法は？

LPS刺激には適切な細胞調製が必要である

LPS誘導性IL-23実験においては、精製末梢血リンパ球よりも、ヒト末梢血単核細胞（PBMC）または単球やその他の抗原提示細胞を含む別の調製物の方が適している。IL-23は主に活性化単球、マクロファージ、樹状細胞によって産生され、ヒト血液細胞調製物におけるLPS応答は主に先天性LPS感知経路に依存している。元の試料が「末梢血リンパ球」と記録されている場合は、結果を解釈する前に、分離方法と単球含有量を確認する必要がある。

本稿で説明する試験設定では、細胞を24時間または96時間培養し、培養上清を回収してヒトIL-23の濃度を測定した。LPS濃度が50 ng/mLおよび1 μg/mLの場合、これらは普遍的な推奨用量ではなく、研究固有の実験条件として扱うべきである。

LPS濃度を2種類、採取時間を2種類とすることで、4つの刺激条件が得られます。比較は、各時点において、刺激を与えない対照群との比較を含め、同一の時点で行う必要があります。

今回の結果は、単純な高用量対低用量の比較として解釈すべきではありません。96時間の培養期間中、栄養分の枯渇、細胞密度の変化、細胞死、細胞組成の変化、サイトカインの分解または消費など、様々な要因によって上清中の測定濃度が変化する可能性があります。

各時点において、刺激を与えない対照群を同一の培養条件下で維持する必要がある。この対照群がないと、LPS誘導分泌を基礎分泌や培養における時間依存的な変化と確実に区別することができない。

文化的な詳細は一貫性を保つ必要がある

培養操作のわずかな違いが、サイトカイン測定値に大きな差を生む可能性があります。開始時の細胞密度、血清含有率、培養総量、LPS調製方法、培養条件、および採取方法は、グループ間で一貫して維持する必要があります。初代血液細胞を用いた実験では、単球含有量の違いがLPS誘導性IL-23に大きな影響を与える可能性があるため、ドナーの由来と細胞分離方法も記録する必要があります。

採取した上清はすべて、採取後一貫した方法で処理する必要があります。新鮮なサンプルと、複数回の凍結融解サイクルを経たサンプルを比較することは避けてください。

Solarbioの 研究製品群 ELISAキット、細胞培養試薬、刺激剤、および免疫細胞実験で使用されるその他の製品を対象としています。

THP-1細胞におけるIL-23の検出はどのように行われるのか？

LPS刺激による単球系細胞モデル

ヒト単球性白血病細胞株THP-1は、自然免疫シグナル伝達および炎症の研究において、再現性の高いモデルとして広く用いられています。ヒトの初代血液細胞は生物学的に重要な細胞ですが、ドナー間でばらつきがあり、体外での生存期間も限られています。THP-1細胞は初代細胞を用いた実験を補完するものであり、必ずしもそれに取って代わるものではありません。

この例では、THP-1細胞を10%ウシ胎児血清を含むRPMI-1640培地で培養した。LPSは最終濃度50 ng/mLおよび500 ng/mLで添加した。

培養上清を24時間後と48時間後に採取し、ヒトIL-23の有無を検査した。

LPSの2つの濃度を、自動的に「中程度」と「強い」と分類すべきではありません。THP-1細胞のLPSに対する反応性は、細胞の状態、分化状態、細胞密度、血清条件、受容体発現によって異なります。LPS濃度が高いからといって、必ずしもIL-23反応が比例して高くなる、あるいは解釈しやすくなるわけではありません。

THP-1細胞の結果は、初代培養細胞の結果と同様に扱うべきではない。

THP-1細胞とヒト初代単球（PBMC）は、起源や生物学的挙動が異なります。受容体発現、活性化状態、増殖パターン、LPSに対する反応などが異なる場合があります。

THP-1細胞を用いた結果は、まずTHP-1モデルの範囲内で解釈されるべきである。ヒト初代免疫細胞を用いたデータの直接的な代替として使用すべきではない。

アッセイシグナルが弱い場合、標準曲線が異常に見える場合、または繰り返し実行しても一致しない場合は、Solarbioの 技術サービスチーム 製品の選択や基本的な試験条件の見直しに役立ちます。

Jurkat細胞はIL-23分泌の適切なモデルと言えるか？

PMA刺激の解釈には慎重さが求められる

Jurkat細胞は、T細胞シグナル伝達の研究に広く用いられているヒトT細胞白血病細胞株である。しかし、活性化単球、マクロファージ、樹状細胞は、分泌型ヘテロ二量体IL-23の主要な産生細胞として確立されているため、Jurkat細胞はIL-23の標準的な陽性産生モデルとは言えない。

本稿で説明する実験系では、上清採取前に、PMAを最終濃度0.2 μg/mLおよび10 μg/mLで3日間または5日間培養した。これらはJurkat細胞に対する強力かつ長期にわたる刺激条件であり、一般的に推奨されるIL-23誘導条件として提示すべきではない。これらの条件下で得られたIL-23シグナルは、非刺激対照群および細胞生存率データと併せて解釈する必要がある。

濃度範囲が広く、曝露期間が複数日にわたるため、単純な用量反応関係の解釈は困難である。なぜなら、細胞の生存率、増殖、および状態の変化が測定結果に大きく影響する可能性があるからである。

実験中は、特にPMA濃度が高い場合や長時間曝露した後は、細胞の生存率と細胞数を継続的にモニタリングする必要があります。ELISAで陽性反応が検出されただけでは、Jurkat細胞が生理学的に適切なIL-23産生モデルであるとは断定できません。予期せぬ陽性結果が出た場合は、適切な対照実験を行い、必要に応じて別の方法を用いて確認する必要があります。

刺激剤と細胞の種類は研究目的に合致していなければならない。

LPSとPMAは互換性のある刺激物質ではありません。LPSは応答性の自然免疫細胞においてTLR4依存性シグナル伝達を活性化するのに対し、PMAはプロテインキナーゼC依存性経路を直接活性化し、いくつかの細胞モデルにおいてシグナル伝達を誘発するために一般的に用いられています。

実験の目的によって、細胞モデルと刺激の種類を決定する必要があります。THP-1細胞または初代単球系細胞は、LPSに対する自然免疫応答の研究に使用できます。PMAを添加したJurkat細胞はT細胞シグナル伝達の研究に有用ですが、だからといってJurkat細胞がIL-23分泌の検証済みモデルになるわけではありません。ELISAの結果は、選択したモデルの生物学的特性に基づいて解釈する必要があります。

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正常な血清や血漿では、なぜIL-23が検出されないのでしょうか？

結果は検出限界を下回る場合があります

このサンプルパネルでは、正常なヒト血漿サンプル20検体と正常なヒト血清サンプル20検体を検査したところ、すべてのサンプルにおいてIL-23はアッセイの検出限界以下であった。

この結果は、IL-23が完全に存在しなかったことを証明するものではありません。これは、使用したアッセイ条件下では、存在したIL-23の量がアッセイの検出限界以下であったことを意味します。

IL-23を含む多くのサイトカインは、健康な人でも非常に低い濃度で循環している可能性があります。測定される濃度は、免疫状態、炎症や感染症、投薬、年齢、検体処理、その他の生物学的要因や前分析的要因によっても影響を受ける可能性があります。

検出限界を下回る結果であっても、必ずしもアッセイの失敗を意味するわけではありません。まず、検量線、ブランクおよびコントロールの性能、サンプル処理、アッセイ手順を確認する必要があります。アッセイの性能が許容範囲内であれば、正確な濃度値を割り当てるのではなく、検出限界以下として、または製造元の指定する報告規則に従って結果を報告すべきです。

血清と血漿は異なるマトリックスである

血清と血漿は、自動的に単一の分析グループとして扱うべきではありません。両者の調製方法は異なり、マトリックス効果がアッセイの性能に影響を与える可能性があります。

採取チューブ、血漿に使用する抗凝固剤、血清の凝固条件、遠心分離までの時間、保存温度、凍結融解サイクルの回数はすべて記録しておく必要があります。これらの変数は、目標濃度が測定可能な範囲の下限に近い場合に特に重要になります。

どのIL-23 ELISAキットがサンプルに適していますか？

ヒトIL-23 ELISAキット

これ SEKH-0034 ヒトIL-23 ELISAキット 本製品は、現行の製品説明書に従って、血清、血漿、細胞培養上清などの検証済みのヒトサンプルタイプ中のヒトIL-23の定量的検出に使用できます。

本製品は、炎症研究、Th17関連研究、免疫細胞刺激、自己免疫メカニズム、感染症、および腫瘍免疫に関連する。

SEKH-0034ヒトIL-23 ELISAキットは、本製品の説明書に記載されている検証済みのサンプルマトリックスで使用してください。検査前に、サンプルがアッセイの報告可能範囲内に収まるか、または検証済みの希釈手順を用いて報告可能範囲内に調整できるよう、予想される濃度も考慮する必要があります。

他種用IL-23キット

SEKM-0024 マウス IL-23 ELISA キット マウスサンプルを対象としています。 SEKR-0072 ラットIL-23 ELISAキット ラットのサンプルに使用され、 SEKCN-0130 ニワトリIL-23 ELISAキット 鶏の研究に利用可能です。

ある種の生物用に作られたキットは、交差反応性が試験され確認されていない限り、別の生物種には使用しないでください。タンパク質名が似ているからといって、アッセイ抗体が標的を同じように認識するとは限りません。

マウスIL-23 ELISAキットおよびその他の種特異的キットは、研究で使用する動物モデルに応じて選択する必要があります。

北京ソーラーバイオ科学技術有限公司は2004年に設立され、免疫学、細胞生物学、分子生物学、生化学向けの製品を開発しています。製品および品質システムに関する詳細は、以下のウェブサイトをご覧ください。 Solarbio社の企業ページ.

最終結果を読む前に確認すべきことは何ですか？

標準曲線から始めましょう

検量線は、キットに記載されている許容基準を満たし、推奨されている曲線フィッティング手法を用いる必要があります。繰り返し測定されたウェルは、アッセイで規定された精度範囲内で一致する必要があります。

ブランク吸光度は低いままであるべきです。ブランク吸光度が高い場合は、洗浄が不十分、汚染、試薬の取り扱いミス、または過剰なインキュベーションが原因である可能性があります。

測定法の報告上限値を超えるシグナルが検出されたサンプルは、プロトコルで許可されている場合は希釈して再検査する必要があります。定量下限値を下回る結果は正確な濃度として報告してはならず、検出限界値を下回る結果はそれに応じて報告する必要があります。

サンプル調製を振り返る

IL-23の値が予想外だった場合、研究者はまず検査キットに疑問を抱くことが多いが、その不一致の原因はワークフローのより早い段階で発生している可能性がある。

細胞密度がグループ間で異なっていた可能性、刺激物質の調製方法が間違っていた可能性、あるいは上清に細胞破片が含まれていた可能性が考えられます。また、血清または血漿サンプルが凍結融解サイクルを繰り返した可能性もあります。

ピペット操作、洗浄、インキュベーション時間と温度、マイクロプレートリーダーの設定も一貫している必要があります。ELISAは、特にサイトカイン濃度が低い場合、操作方法の違いに敏感です。

結論

ヒトIL-23の測定は、炎症や免疫応答の研究において有用な情報を提供する可能性があるが、測定された濃度は実験全体の計画を踏まえて解釈する必要がある。

LPS誘導性IL-23の研究においては、精製リンパ球よりも、単球を含む末梢血単核細胞（PBMC）、初代単球または樹状細胞、および適切に特性評価された骨髄系細胞モデルの方が生物学的に適しています。THP-1細胞は、検証済みの培養条件下でLPSを用いて評価できます。Jurkat細胞はPMA誘導性T細胞シグナル伝達の研究に有用である可能性がありますが、検証を裏付ける証拠なしに標準的なIL-23分泌モデルとして提示すべきではありません。

正常な血清および血漿では、IL-23濃度が検出限界を下回る場合があります。アッセイコントロールと標準曲線が正常に機能している場合、これは有効な結果となり得ます。

種の適合性、サンプル処理、培養の一貫性、アッセイの実施方法など、すべてが最終データに影響を与えます。キットの選択や試験条件についてご質問がある場合は、アッセイを開始する前にSolarbioまでお問い合わせください。

FAQ

Q1：ヒトIL-23とは何ですか？

A1：ヒトIL-23は、IL-12ファミリーに属する炎症誘発性ヘテロ二量体サイトカインです。IL-23A遺伝子によってコードされるp19サブユニットと、IL-12B遺伝子によってコードされるp40サブユニットから構成されています。

Q2：IL-23はなぜTh17細胞と関連しているのですか？

A2：IL-23は、IL-23RとIL-12Rβ1からなる受容体複合体を介してシグナル伝達を行う。これによりJAK2/TYK2関連シグナル伝達が活性化され、Th17関連応答においてSTAT3が主要な下流STATとなる。

Q3：ヒトIL-23は細胞培養上清中で検出できますか？

A3：はい。細胞モデルがIL-23を産生する能力を持ち、かつサンプルタイプがELISAキットに適合していることが確認されている場合、細胞培養上清を検査することができます。単球を含む末梢血単核細胞（PBMC）、初代単球／マクロファージ／樹状細胞、および適切に特性評価された骨髄系細胞モデルは、精製リンパ球やJurkat細胞よりも、一般的にIL-23分泌研究に適しています。

Q4：LPSはIL-23の実験に使用できますか？

A4：はい。LPSは、単球、マクロファージ、樹状細胞、単球を含む末梢血単核細胞（PBMC）製剤、および一部の骨髄系細胞モデルなど、応答性の高い自然免疫細胞におけるIL-23産生を刺激することができます。ただし、精製リンパ球からのIL-23分泌を誘導するとは限りません。

Q5：PMAはJurkat細胞に使用できますか？

A5：PMAはJurkat細胞を活性化させ、T細胞シグナル伝達の研究に有用ですが、Jurkat細胞は分泌型IL-23の標準的な陽性産生モデルではありません。PMA処理したJurkat細胞の上清は、裏付けとなるデータがない限り、検証済みのIL-23陽性対照として提示すべきではありません。

Q6：正常な血清や血漿中でIL-23が検出されないことがあるのはなぜですか？

A6：IL-23は、検査の検出限界以下の濃度で存在する可能性があります。これは、正常検体中の低濃度サイトカインによく見られる現象です。

Q7：マウスIL-23 ELISAキットでヒト検体を検査できますか？

A7：いいえ。製造元が交差反応性を特に検証していない限り、ヒト検体はヒトIL-23 ELISAキットで検査する必要があります。

Q8：重複する井戸が一致しない場合、何をチェックすべきですか？

A8：ピペット操作の精度、サンプルの混合、洗浄、インキュベーション時間、プレートの位置、気泡、試薬の調製など、すべてを確認する必要があります。